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      茉莉酸甲酯對(duì)橡膠樹(shù)花藥愈傷乳管細(xì)胞分化的影響

      2023-05-30 10:05:03郭子晗譚德冠黃東益付莉莉孫雪飄張家明
      熱帶作物學(xué)報(bào) 2023年2期
      關(guān)鍵詞:愈傷組織基因表達(dá)橡膠樹(shù)

      郭子晗 譚德冠 黃東益 付莉莉 孫雪飄 張家明

      關(guān)鍵詞:橡膠樹(shù);愈傷組織;乳管細(xì)胞分化;茉莉酸甲酯;基因表達(dá)

      中圖分類(lèi)號(hào):S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

      橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)屬于大戟科橡膠屬,是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物,在我國(guó)主要分布于海南、云南、廣東等熱帶北緣地區(qū)[1]。乳管是橡膠樹(shù)膠乳生物合成和貯存的唯一場(chǎng)所,是由無(wú)數(shù)個(gè)乳管細(xì)胞所組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)器官[2-3]。橡膠樹(shù)樹(shù)皮被定期開(kāi)割,樹(shù)皮中被割開(kāi)的乳管中會(huì)排出奶汁狀的膠乳(細(xì)胞質(zhì)),膠乳經(jīng)收集和加工后,成為重要的工業(yè)原料——天然橡膠(順-1,4-聚異戊二烯)。世界上99%的商品天然橡膠來(lái)源于橡膠樹(shù)[4]。

      由于樹(shù)皮中乳管的數(shù)量是決定天然橡膠產(chǎn)量的最重要因素[5-6],為此許多學(xué)者聚焦于橡膠樹(shù)乳管分化研究。大部分學(xué)者用大田植株枝條或樹(shù)干的樹(shù)皮作為研究對(duì)象,通過(guò)外界物理或化學(xué)刺激來(lái)研究樹(shù)皮乳管分化情況[7-9]。近期有學(xué)者以橡膠樹(shù)愈傷組織為研究對(duì)象,通過(guò)在培養(yǎng)基中添加化學(xué)物質(zhì)來(lái)研究愈傷乳管分化情況[10]。

      茉莉酸(JA)具有促進(jìn)橡膠樹(shù)乳管分化功能的這一發(fā)現(xiàn)是橡膠樹(shù)乳管分化研究中取得的突破性進(jìn)展。最初HAO 等[7]發(fā)現(xiàn)外源JA 能促進(jìn)橡膠樹(shù)枝條樹(shù)皮乳管分化;TAN 等[10]也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加一定濃度的外源JA 能促進(jìn)橡膠樹(shù)愈傷組織中乳管細(xì)胞分化。當(dāng)前,科研人員圍繞JA 調(diào)控橡膠樹(shù)乳管分化的信號(hào)分子開(kāi)展一系列研究并取得一定進(jìn)展。HbSKP1、HbCOI1、HbJA1、HbLAP1、HblMYC1、HblMYC2、HbEREBP1 等與茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)的基因被克隆出來(lái)[11-14];發(fā)現(xiàn)橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞存在特定的茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊COI1-JAZ3-MYC2,其通過(guò)上調(diào)法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因和小橡膠粒子蛋白(SRPP)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)橡膠生物合成[15]。

      茉莉酸甲酯(MeJA)與JA 同屬茉莉酸類(lèi)物質(zhì)(JAs),但MeJA 對(duì)橡膠樹(shù)愈傷乳管細(xì)胞分化的效果尚不清楚。本研究將應(yīng)用橡膠樹(shù)愈傷組織來(lái)系統(tǒng)研究MeJA 對(duì)乳管細(xì)胞分化的效果,并研究其所調(diào)控橡膠合成相關(guān)基因表達(dá)情況,對(duì)促進(jìn)橡膠樹(shù)愈傷組織在乳管分化研究中的應(yīng)用,以及開(kāi)發(fā)新型橡膠樹(shù)增產(chǎn)刺激劑從而促進(jìn)橡膠樹(shù)天然橡膠的生產(chǎn)具有一定意義。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      于2021 年3 月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)三隊(duì)采集橡膠樹(shù)品種‘熱研7-33-97的春花,將采集好的花枝立刻置于4℃冰箱中保存24~48 h,備用。

      1.2 方法

      1.2.1 橡膠樹(shù)花藥愈傷組織的誘導(dǎo) 選取已低溫處理過(guò)的處于單核期的橡膠樹(shù)雄花,包裹于紗布中,于75%(V/V)酒精中浸泡30 s,然后置于0.15%(W/V)升汞中浸泡8 min,無(wú)菌水清洗5遍。于無(wú)菌條件下從雄花中剝離出雄蕊,接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。

      誘導(dǎo)花藥愈傷組織培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[16],具體為改良MS+2,4-D 1 mg/L+ KT 1 mg/L+NAA1 mg/L+8%(W/V)蔗糖+2.5 g/L Phytagel。為了研究MeJA 對(duì)花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的效果,在誘導(dǎo)花藥愈傷組織培養(yǎng)基中分別添加0、1、2、3 mg/L 的MeJA。上述的植物激素和Phytagel均購(gòu)自Sigma 公司。培養(yǎng)基pH 為6.2,培養(yǎng)條件為25℃黑暗條件。

      1.2.2 橡膠樹(shù)花藥愈傷組織鮮重測(cè)量 取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織塊于電子天平中稱重,每個(gè)處理重復(fù)20 次。

      1.2.3 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞 組織化學(xué)法參照田維敏等[17]的方法進(jìn)行。取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織于70%(V/V)酒精中固定48 h,酒精系列脫水,冰醋酸過(guò)渡處理4 h,于60℃下溴-碘染色液處理48 h。冰醋酸浸洗3 次,每次2 h;無(wú)水酒精脫水3 次,每次1 h;正丁醇透明3 次,每次2 h。材料被滲蠟、包埋后,經(jīng)萊卡滑走切片機(jī)切成10 μm 厚的薄片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、固綠染色、無(wú)水酒精脫水、二甲苯透明處理后,再用中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片。

      1.2.4 愈傷組織乳管細(xì)胞分化頻率 光學(xué)顯微鏡下觀察不同MeJA 濃度處理的花藥愈傷組織的組織化學(xué)切片,每處理隨機(jī)觀察30 個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中乳管細(xì)胞的分化頻率。愈傷組織乳管細(xì)胞分化頻率=(乳管細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

      1.2.5 熒光定量PCR 分別取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織,采用北京天根生化科技有限公司的RNAprep Pure 植物總RNA提取試劑盒(產(chǎn)品號(hào):DP432)提取愈傷組織RNA,再用Thermo Scientific 公司的RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(產(chǎn)品號(hào):#K1622)將愈傷組織總RNA 反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。根據(jù)TANG 等[18]報(bào)道的調(diào)控橡膠樹(shù)橡膠生物合成的重要基因序列信息,選取與橡膠合成密切相關(guān)的小橡膠粒子蛋白(small rubber particleprotein,SRPP)基因的4 個(gè)家族成員(HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7)、橡膠延伸因子(rubber elongation factor, REF)基因的家族成員HbREF1、橡膠轉(zhuǎn)移酶(cis-Prenyl transferase,CPT)基因的家族成員HbCPT6 的序列設(shè)計(jì)引物(表1),用于熒光定量PCR 反應(yīng)。以在橡膠樹(shù)膠乳中穩(wěn)定表達(dá)的eIf2 基因[19]作為參考基因。利用寶生物公司的SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒(產(chǎn)品號(hào):RR820A)進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng),反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸15 s,反應(yīng)共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。每處理含有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2?ΔΔCT 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

      1.2.6 電鏡制片 電鏡超薄制片參考照田維敏等[17]的方法進(jìn)行。取培養(yǎng)至第65 天的1 mg/L MeJA 處理的愈傷組織置于預(yù)冷的4%戊二醛溶液中4℃下固定24 h,0.2 mol/L PBS 緩沖液清洗2 次,2%鋨酸4℃下再固定10 h,乙醇系列脫水,環(huán)氧丙烷滲透,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,切成50~70 nm 薄片,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,透射電子顯微鏡(HT-7700)下觀察。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 MeJA 對(duì)橡膠樹(shù)花藥愈傷組織生長(zhǎng)的影響

      在誘導(dǎo)橡膠樹(shù)花藥愈傷組織培養(yǎng)基中添加不同濃度MeJA,會(huì)明顯影響到愈傷組織塊的生長(zhǎng)。培養(yǎng)至65 d 時(shí),各處理的愈傷組織均呈現(xiàn)鮮黃色,表面凹凸不平(圖1A~圖1D)。MeJA 濃度為1 mg/L 的處理其愈傷塊平均鮮重(FW)為0.23 g,雖然略低于對(duì)照(0.24 g),但統(tǒng)計(jì)學(xué)上二者無(wú)顯著差異,說(shuō)明MeJA 在0~1 mg/L 范圍內(nèi)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)影響不明顯。MeJA 濃度為2、3 mg/L的處理愈傷塊平均FW 分別為0.18 g 和0.13 g,均顯著低于對(duì)照和1 mg/L MeJA 的處理(圖1E),說(shuō)明MeJA 在2~3 mg/L 范圍內(nèi)會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng)。對(duì)MeJA 濃度與愈傷FW 進(jìn)行相關(guān)性分析(圖1F),相關(guān)系數(shù)R 為-0.971,表明二者負(fù)相關(guān),說(shuō)明隨著培養(yǎng)基中MeJA 濃度的增加,抑制花藥愈傷組織生長(zhǎng)的程度會(huì)加大,愈傷組織FW 呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。上述結(jié)果表明低濃度的MeJA(0~1 mg/L)對(duì)花藥愈傷組織的影響不明顯,而高濃度的MeJA(2~3 mg/L)會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng),且MeJA 濃度與愈傷組織生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

      2.2 MeJA 對(duì)橡膠樹(shù)花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的影響

      溴-碘染色法是一種經(jīng)典可靠的鑒別乳管細(xì)胞方法[20]。溴-碘染色的石蠟制片顯示培養(yǎng)至65 d的花藥愈傷組織中存在被染成棕色的細(xì)胞,是由于該細(xì)胞中的橡膠內(nèi)含物被溴-碘溶液染成棕色,這些細(xì)胞為乳管細(xì)胞(圖2A~圖2D)。切片中還存在一些黑褐色單寧細(xì)胞,該類(lèi)細(xì)胞的單寧內(nèi)含物被染成黑褐色。此外,愈傷組織中還存在一些淀粉細(xì)胞,這些細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒狀的淀粉粒。

      培養(yǎng)基中添加一定濃度的MeJA 會(huì)促進(jìn)橡膠樹(shù)花藥愈傷乳管細(xì)胞分化。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L 時(shí),愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率上升至15.8%,顯著高于其他處理,比對(duì)照(5.7%)增加近2 倍(圖2A、圖2B、圖2E)。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為2 mg/L 時(shí),愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率為13.0%,雖然顯著高于對(duì)照,但卻顯著低于1 mg/L MeJA 的處理(圖2C、圖2E)。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為3 mg/L 時(shí),愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率下降至9.7%,雖然也顯著高于對(duì)照,但顯著低于1、2 mg/L MeJA 的處理(圖2D、圖2E)。上述結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)基中添加低濃度的MeJA 能促進(jìn)愈傷組織乳管細(xì)胞分化,而高濃度的MeJA 會(huì)抑制其分化,其中MeJA 濃度為1 mg/L 效果最佳。

      2.3 膠乳合成相關(guān)基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中表達(dá)分析

      SRPP、REF、CPT 是存在于小橡膠粒子膜的蛋白質(zhì),是參與橡膠生物合成的重要酶和調(diào)控因子,它們所編碼的基因在乳管細(xì)胞中特異表達(dá)[21-24]。筆者檢測(cè)橡膠樹(shù)SRPP、REF、CPT 基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)它們表達(dá)量的變化趨勢(shì)與愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率的變化趨勢(shì)基本一致。熒光定量PCR 結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,培養(yǎng)基中添加1~3 mg/L MeJA 后均能顯著促進(jìn)HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 的表達(dá)(圖3)。這是由于添加MeJA 后愈傷組織中乳管細(xì)胞數(shù)量增加所致。當(dāng)培養(yǎng)基中添加1mg/L MeJA 時(shí)愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率最高,此時(shí)HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 表達(dá)量最高,分別為對(duì)照的7.8、676.6、222.3、130.7、26.1、13.0 倍。當(dāng)培養(yǎng)基中添加2、3 mg/LMeJA 時(shí)愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率呈下降趨勢(shì),此時(shí)除了HbSRPP7 外,其他基因表達(dá)量均隨著MeJA 濃度的升高而下降。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MeJA 能促進(jìn)橡膠樹(shù)愈傷組織中乳管細(xì)胞分化。

      2.4 橡膠樹(shù)花藥愈傷乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

      雖然通過(guò)溴-碘染色法能確切證實(shí)愈傷組織中存在乳管細(xì)胞,但愈傷乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)尚不清楚。橡膠樹(shù)樹(shù)皮乳管細(xì)胞的大尺寸橡膠粒子直徑為0.40~0.75 μm,中等尺寸橡膠粒子直徑為0.25~0.35 μm, 小尺寸橡膠粒子直徑為0.08~0.20 μm[21]。本研究采用透射電鏡技術(shù)來(lái)研究花藥愈傷組織中乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)愈傷乳管細(xì)胞中也存在大、中、小尺寸橡膠粒子,其中大尺寸橡膠粒子直徑為0.20~0.30 μm,中等尺寸粒子直徑為0.10~0.18 μm,小尺寸粒子直徑為0.04~0.08 μm(圖4)。與樹(shù)皮乳管細(xì)胞的橡膠粒子相比較,這些愈傷乳管細(xì)胞的橡膠粒子尺寸均較小,其原因可能是它們都處于發(fā)育早期,也可能是由于乳管細(xì)胞來(lái)源不同所致。愈傷乳管細(xì)胞內(nèi)還含有黃色體,它們呈球形囊泡狀,內(nèi)部含高電子致密物質(zhì)(圖4B)。

      3 討論

      已有研究表明JAs 具有能夠調(diào)節(jié)植物抗逆和抗病蟲(chóng)害的防御反應(yīng),同時(shí)還具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的功能[25-26]。橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的膠乳主要起防御功能[27-28],除了含有橡膠烴外,還含有一些有毒物質(zhì),如羥基腈水解酶,用來(lái)催化腈基類(lèi)化合物水解,釋放氫氰酸,抵御害蟲(chóng)和病原菌的侵害[29]。在本研究中,培養(yǎng)基中添加MeJA 具有促進(jìn)橡膠樹(shù)花藥愈傷組織中乳管細(xì)胞分化的功能;而隨著愈傷組織中乳管細(xì)胞數(shù)量增加,所含的膠乳也會(huì)增多,因此愈傷組織中含有毒物質(zhì)的濃度可能會(huì)增高,這些有毒物質(zhì)可能會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng),這可能是MeJA 影響愈傷組織生長(zhǎng)的主要原因。

      在本研究中,培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L時(shí)為橡膠樹(shù)花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的最佳濃度。而TAN 等[10]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中JA 濃度為2 mg/L時(shí)為橡膠樹(shù)花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的最佳濃度。但在本研究中高濃度MeJA 處理其愈傷乳管細(xì)胞分化的變化趨勢(shì)與TAN 等[10]報(bào)道的相一致。這些結(jié)果表明MeJA 與JA 誘導(dǎo)愈傷乳管細(xì)胞分化的最佳濃度雖存在一定差異,但二者調(diào)控愈傷組織乳管細(xì)胞分化的效果相似,說(shuō)明MeJA 可代替JA 進(jìn)行乳管細(xì)胞分化研究。

      MeJA 與JA 同屬茉莉酸類(lèi)物質(zhì)(JAs),但二者市場(chǎng)價(jià)格差異巨大,前者價(jià)格低廉,根據(jù)Sigma公司網(wǎng)站的報(bào)價(jià),后者價(jià)格約為前者的140 倍(https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)。由于JA 價(jià)格過(guò)于昂貴,限制其在橡膠樹(shù)大田生產(chǎn)試驗(yàn)與應(yīng)用。JA 應(yīng)用于橡膠樹(shù)乳管分化的研究主要集中于枝條樹(shù)皮,發(fā)現(xiàn)JA 能促進(jìn)枝條樹(shù)皮分化次生乳管[7-8]。于俊紅等[9]開(kāi)展了JA 對(duì)成齡橡膠樹(shù)次生乳管分化的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)JA 對(duì)成齡橡膠樹(shù)次生乳管分化具有促進(jìn)效果,但它們僅涂1 g 含1% JA的羊毛脂于面積2 cm×2 cm 的用刀片輕刮至綠色的橡膠樹(shù)皮層,1 個(gè)月后取處理部位樹(shù)皮進(jìn)行組織化學(xué)鑒定。目前尚未能像橡膠樹(shù)增產(chǎn)刺激劑乙烯利那樣涂抹于成齡橡膠樹(shù)割口處來(lái)開(kāi)展JA 能否促進(jìn)橡膠樹(shù)增產(chǎn)的大田實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn),MeJA 能促進(jìn)愈傷組織乳管細(xì)胞分化,表明其可代替JA 進(jìn)行乳管細(xì)胞分化研究。因此,在橡膠樹(shù)的大田生產(chǎn)試驗(yàn)中,將來(lái)可用價(jià)格低廉的MeJA來(lái)代替價(jià)格昂貴的JA 進(jìn)行,這對(duì)開(kāi)發(fā)新型橡膠樹(shù)增產(chǎn)刺激劑,促進(jìn)橡膠樹(shù)生產(chǎn)具有一定意義。

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