劉煒　熊怡然　郜曉峰　劉金林　孫彬　何培民

關鍵詞：海馬齒；杭州灣；生態(tài)適應性；脅迫；生態(tài)修復

中圖分類號：X171.4；X173 文獻標識碼：A

海馬齒（Sesuvium portulacastrum）又叫濱水菜，屬于番杏科海馬齒屬，是一種多年生肉質草本植物[1]，分布于福建、臺灣、廣東（臺山）、海南（南部）及東沙島等熱帶和亞熱帶海岸，由于其獨特的生理特性和良好的生態(tài)修復功能，廈門大學黃凌風團隊應用該植物在浙江梅山灣進行生態(tài)修復，植株順利過冬（尚未發(fā)表）。海馬齒常見與紅樹林伴生于河口泥灘、沼澤、鹽灘、石灰?guī)r海岸帶等鹽堿地，是具有穩(wěn)定鹽漬土作用的兼性鹽生植物，被用于我國南方海域生態(tài)修復工程中[2]。國內外早期對該植物的研究較關注其耐鹽能力， MESSEDDI 等[3] 發(fā)現海馬齒在高至600～1000 mmol/L 的NaCl 溶液中其生長才受到抑制，由此，很多學者陸續(xù)開展了其耐鹽機制與相關基因組學、轉錄組學等研究[4-6]，并由此開展了鹽堿地生態(tài)修復工程的應用研究。近年來對海馬齒耐重金屬的研究較多，發(fā)現其對鉛[7]、鋅[8]、無機汞[9]、鎳[10]、銅[11]等重金屬具有良好的耐性與富集作用，具有極強的逆境適應性，開始用于廢棄礦區(qū)修復，并逐步擴大到其他污染環(huán)境的修復。福建水產研究所與廈門大學率先應用海馬齒生態(tài)浮床對富營養(yǎng)化海域進行原位生態(tài)修復[12]，在筼筜湖、八尺門海域等地修復效果良好，但面臨技術應用推廣的難題[13]，因此，亟需確定海馬齒生態(tài)適應能力和應用區(qū)域等問題。

杭州灣位于浙江省北部、上海市南部，東臨舟山群島，西有錢塘江匯入，是全國唯一的河口型海灣，處于副熱帶季風性氣候區(qū)[14]。該區(qū)域經濟活躍，自然和旅游資源豐富，區(qū)位優(yōu)勢明顯。但隨著人類活動和不合理的圍填海等，2001—2018 年杭州灣全海域水質為劣四類，主要污染物為無機氮、活性磷酸鹽和油類，海水呈富營養(yǎng)化，浮游植物密度較高，海洋生態(tài)系統總體不健康，生態(tài)系統功能受到嚴重損害[15]。由于杭州灣呈喇叭狀，半日潮水文條件，灣內水體擴散條件差；河口海灣淡咸水相互作用，加上長江徑流帶來的營養(yǎng)鹽疊加，該生態(tài)系統難以完成自我凈化[16]，因此，亟待對杭州灣海域進行人工生態(tài)修復。

海馬齒對磷的半飽和吸收常數達0.9593 mg/L，高于多數植物對磷的半飽和吸收常數，氮的半飽和吸收常數為0.4455 mg/L[17]，富營養(yǎng)化控制能力極強，對磷具有較高耐受性，對多環(huán)芳烴類、重金屬等也具有較好的耐受能力與富集能力[18]，適用于杭州灣水體的修復工程。海馬齒生態(tài)浮床技術是較為成熟的水域生態(tài)修復手段之一[19]，已應用于福建、廣東、浙江等地的水域生態(tài)修復，由于海水限制使浮床形成物理隔離，使得海馬齒生態(tài)風險極低，并不會造成生物入侵風險，并且其根系能夠為水生生物提供棲息場所。海馬齒是原生于熱帶亞熱帶地區(qū)的植物，探究海馬齒的低溫極限和對逆境環(huán)境的適應性，對海馬齒修復技術的示范推廣和確定海馬齒的生態(tài)修復區(qū)域十分必要。本研究通過室內溫度、鹽度模擬實驗和野外濱海栽培海馬齒，闡明海馬齒能適應的低溫極限，單一脅迫和鹽、低溫雙重脅迫下海馬齒的生態(tài)適應能力，并據此研究海馬齒生態(tài)修復技術在杭州灣應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

杭州灣地處副熱帶季風氣候區(qū)，風向表現為季風特征，冬季一般為偏北風，夏季一般為偏南風，氣候特征是冬夏季季風交替，四季分明，陽光充足，氣候濕潤，雨熱同期，該區(qū)域5—10 月有臺風活動，且集中在夏季7—9 月，大風、暴雨、風暴潮等突發(fā)性小范圍災害性天氣時有發(fā)生。實驗區(qū)域如圖1 所示，位于杭州灣北岸上海市南匯東灘濕地，位于長江口以南，杭州灣海區(qū)121°50E以東區(qū)域。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 實驗使用的海馬齒由福建水產研究所提供，海馬齒培養(yǎng)液采用霍格蘭營養(yǎng)液[20]，按照李衛(wèi)林等[21]的方法，取生長旺盛、長勢均勻的海馬齒，從上向下數4 個莖節(jié)，移除下方2 個莖節(jié)葉片，自來水清洗3 次，再用去離子水清洗3 次，用飽和Ca（ClO）₂溶液消毒5 min，再用去離子水清洗3 次，定植在載體上（聚乙烯泡沫板）。

1.2.2 室內實驗設計 （1）光響應實驗。取海馬齒植株20株，暗適應20 min，在室溫下，通過調制葉綠素熒光儀Dual-PAM 100 測定不同光照強度下的相對電子傳遞效率（rETR），光合有效輻射（PAR）設定為0、7、15、33、91、169、211、327、498、756、1175 μmol/（m²·s），同一植株測定3 次，記錄每次的光合速率（Pn），即rETR。將結果均值根據PLANTT 等1980 年研究的擬合曲線，光曲線模擬式如下：

（2）鹽度實驗。在塑料盆內加入0、5、10、15、20、25、30 共7 個鹽度梯度霍格蘭營養(yǎng)液3 L，每個載體上定植5 株海馬齒，使載體漂浮在盆中，模擬生態(tài)浮床，置于恒溫培養(yǎng)箱中，設置光照強度300 μmol/（m²·s），光暗比為12 h∶12 h，每隔2 d補充1 次純水維持鹽度不變，每周更換1 次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)35 d，記錄培養(yǎng)前后的鮮重、株高、根長，相對生長率為鮮重差和培養(yǎng)天數的比值，株高增長量是株高差。

（3）溫度實驗。在塑料盆內加入3 L 霍格蘭培養(yǎng)液，培養(yǎng)液由純水配置，其他條件同鹽度實驗，分別放置在溫度為0、5、10、15、20、25、30、35、40℃的培養(yǎng)箱中，每周更換1 次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)35 d，記錄培養(yǎng)前后的鮮重、葉片數、根長。

（4）鹽、寒復合脅迫實驗。在塑料盆內分別設置鹽度為0 的淡水和25 的海水，加入適量且等量霍格蘭溶液，體積為3 L，每盆定植海馬齒植物5 株，分別置于0、5、25℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3 盆重復，共計18 盆90 株，即T₀-S₀、T₀-S₂₅、T₅-S₀、T₅-S₂₅、T₂₅-S₀、T₂₅-S₂₅六組，每隔2 d 補充1 次純水維持鹽度，每周更換1 次培養(yǎng)液，光強和光暗比同鹽度實驗，連續(xù)培養(yǎng)35 d，35 d 后恢復溫度為25℃，測算植株的存活率。

1.2.3 野外栽培實驗 在杭州灣北岸濕地設置10 m×10 m 的栽培區(qū)，植株淹沒期約8 h。于2020年10 月4 日栽種海馬齒200 株，2020 年11 月4日記錄氣溫和植株存活數，計算存活率，至2021年1 月20 日實驗結束。

1.3 數據處理

采用Excel 軟件（2016 版，美國華盛頓）進行數據預處理，生物數據采用SPSS 軟件（19.0版，美國紐約）進行one-way ANOVA 分析，顯著水平為P<0.05，并采用SPSS 19.0 軟件進行光響應曲線模擬，輸出擬合值后采用Origin 軟件（8.0版，美國馬薩諸塞州）作圖。

2 結果與分析

2.1 海馬齒的光響應模型

2019 年12 月18 日，對采集的海馬齒暗適應后進行光響應曲線測定，10 個重復數據在不同光合有效輻射（PAR）的均值得到其光響應曲線（圖2）。按照公式進行擬合后，R2 為0.9910，擬合效果良好。

樣本數據模擬出的曲線有明顯的先上升后下降的趨勢，表明在低光強時，光合能力隨著光強增加而增強，達到一定光強時則會下降，即出現了光抑制現象。由模擬計算得出該時間段內采集到的海馬齒半飽和光強為96.28 μmol/（m2·s），飽和光強為384.05 μmol/（m2·s），由于Dual-PAM 100 無法測定暗呼吸且為了方便實驗設計， 將300 μmol/（m2·s）確定為本批次樣品最適光強，此時未出現光抑制，植物光合系統活躍。

2.2 海馬齒的耐鹽實驗

如圖3 所示，海馬齒在淡水和海水中均能成活，當海水鹽度達到30 后，海馬齒喪失調節(jié)能力，在長時間培養(yǎng)中存活率較低。在鹽度0～25 水域中可以生根生長，并且在鹽度10 時獲得最大相對生長率，通過對比可知，海馬齒在鹽度為0 的培養(yǎng)液培養(yǎng)時，株高增加最快，而其相對生長率與鹽度為10 處理組差異并不顯著，兩組根長差異顯著，表明一定濃度的鹽處理會促進海馬齒植株的根系發(fā)育。

2.3 海馬齒的溫度適應性

溫度是影響植物生長的重要環(huán)境因子，在本研究中更關注低溫狀態(tài)下植株的生長生存情況。如圖4 所示，25℃處理組表現出良好的生長情況，鮮重增長率最高，與其他溫度處理組相比差異顯著（P<0.05），為5.20%0.04%；而且該處理組株高增長最快，但相對于15、20、30、35、40℃處理組差異不顯著（P>0.05）；該組葉片數增加最多，高于其他處理組。低溫狀態(tài)下，5℃和0℃時出現負增長，植物鮮重下降，株高生長幾乎停滯。0℃處理組表型變化為3 d 后出現葉片局部發(fā)黑，葉片失水皺縮，大約15 d 左右出現莖節(jié)軟化，自水下部分逐漸潰爛，大約24 d 左右，植株基本死亡；5℃處理組表型變化為葉片失水嚴重，指壓留有痕跡，植物莖節(jié)軟化，難以保持挺立，但當35 d 實驗周期結束后，溫度恢復至25℃時，植物恢復生長。

根是植物的重要器官之一，對環(huán)境因子的變化十分敏感[22]。由圖4 可知，25℃處理組根長較其他處理組更長，差異顯著（P<0.05），低溫狀態(tài)下根系生長有限， 0 ℃ 時平均根長為（3.201.01）cm。

2.4 室內復合脅迫實驗與野外實驗結果

杭州灣是典型的灣區(qū)，水域鹽度處于中鹽水平，年均氣溫在0℃以上，但實際應用時海馬齒面臨鹽、寒雙脅迫，需對鹽、寒復合脅迫下海馬齒的生態(tài)適應性進行研究。通過復合脅迫得出（圖5），25℃條件下，鹽度為0 和25 時海馬齒的存活率均為100%；5℃時，鹽度25 處理組的存活率為100%，鹽度0 處理組的存活率為80%；0℃時，出現較高的死亡率，鹽度0 處理組植株全部死亡，鹽度25 處理組的存活率為40%。

海馬齒在杭州灣實驗區(qū)能正常度過秋季，但需對冬季嚴寒時間段進行監(jiān)測。野外栽培開始時間為2020 年11 月4 日，結束時間為2021 年1 月20 日，最終存活率為10%。其中經歷了2 次寒潮，最低氣溫為-6℃，遠遠超出海馬齒低溫忍耐極限，造成海馬齒種群數量2 次銳減。2021 年3 月海馬齒恢復生長，種群數量上升。

3 討論

3.1 海馬齒的生態(tài)適應性

本研究中，海馬齒由福建采集運送至實驗室時，植株可能遭受了一定程度的傷害，從海馬齒的光響應曲線可以看出，此時海馬齒對高光強不具有特殊的耐受能力，在室內長期培養(yǎng)后發(fā)現海馬齒半飽和光強與光飽和點顯著提升，光飽和點近乎消失。對于植物光飽和點的研究[23]，有人認為冬小麥有時光飽和點會很大，甚至消失[24]，但在遭受干旱脅迫時，光飽和點會下降，即會產生光抑制現象[25]。因此，本研究中采用2 種光飽和點確定方法，一是有光抑制時，則曲線中的Pm對應的光強即光飽和點，另一種是沒有光抑制時，則理論上沒有光飽和點，可通過模型模擬出的Pm為標準，認為達到其一定比例即達到光飽和點。但本研究旨在確定實驗所用批次海馬齒的最適光強的范圍，確定300 μmol/（m²·s）作為最適光強，此時海馬齒的生活狀態(tài)良好，光合作用活躍，并且較低光強下能夠生長，表明海馬齒耐陰能力強，在杭州灣大規(guī)模應用時，一定程度上需考慮植物的光照條件。

楊成龍等[26]用海水澆灌海馬齒，發(fā)現海馬齒在低于1/2 海水澆灌下生長旺盛，根部Na⁺/K⁺離子交換能力很強，全海水澆灌時生長抑制。曾碧健等[27]發(fā)現海馬齒鹽度35 下長期培養(yǎng)，存活率僅為30%左右。本研究在恒溫培養(yǎng)箱中進行，蒸發(fā)量較大，鹽度產生短時波動，與前人研究基本一致。海馬齒對鹽度具有較強的適應能力，鹽度30 約為27.6 g/L NaCl 溶液，此時植株出現死亡，鹽度25 時，海馬齒仍能維持正常的生理過程，并保持植株生長；淡水時，海馬齒同樣具有較高的生理活性，表明海馬齒具有較廣的鹽度適應范圍，能夠在多種水域環(huán)境生存。在鹽度10 時的各生長指標均最高，僅株高生長量較淡水培養(yǎng)的低，說明適當的鹽度能促進海馬齒的生長和發(fā)育，特別是根系的發(fā)育，表明海馬齒具有作為近海、河口水體生態(tài)修復種的潛力。海馬齒根系發(fā)達，能夠對富營養(yǎng)化水域氮、磷等營養(yǎng)鹽進行同化吸收，對顆粒物有吸附和沉降作用，同時根系為微生物群落提供生存環(huán)境[28]，脫氮微生物具有較大豐度，根系越長則反硝化作用越大。就杭州灣而言，其鹽度適合海馬齒生態(tài)浮床的大規(guī)模應用，并且該水域鹽度對海馬齒生長具有促進作用。

溫度是海馬齒在杭州灣應用的最大障礙，也是海馬齒生態(tài)浮床技術推廣面臨的難題。研究表明，25℃時海馬齒達到最大生長速率，鮮重增長和平均根長顯著高于其他處理組，理論上此時的海馬齒生態(tài)修復能力最強。面對高溫，海馬齒生長狀態(tài)良好，具有較強的耐高溫能力，但在低溫狀態(tài)下表現一般，5℃時，海馬齒生長基本停滯，葉片和莖節(jié)軟化，鮮重小幅下降，但溫度恢復時，植株恢復生長，此時海馬齒遭受的低溫傷害可逆。

低溫可以直接減緩植物的新陳代謝，降低細胞膜流動性，進而限制膜功能，導致離子轉運、電子傳遞等功能難以進行[29]，蛋白質穩(wěn)定性遭受干擾[30]，抗氧化酶系統鈍化[31]，最終造成植物死亡。實驗中0℃時，植株受凍害嚴重，鮮重下降劇烈，植株生長停滯，葉片發(fā)黑皺縮，莖節(jié)潰爛，最終死亡，持續(xù)時間約24 d?？梢姾ｑR齒生態(tài)適應能力較強，基本能夠適應杭州灣水域的光照條件、鹽度條件和溫度條件。

3.2 低溫與鹽脅迫的關系

在鹽、寒復合實驗中，0℃淡水組存活率為0%，0℃鹽度25 處理組未完全死亡，且5℃鹽度25 處理組存活率100%，淡水組出現死亡，表明一定的鹽度處理能夠協助植物抵御低溫脅迫。孫港等[32]對甜瓜幼苗的研究表明，低溫和鹽脅迫的協同作用即雙重脅迫對植株危害更大。本研究結果產生差異可能時因為采用的水培方式，海水在0℃時并不會結冰，植株此時仍能進行水分運輸，淡水則表層結冰，對植株根系生長產生壓力；也有可能是海馬齒作為紅樹伴生植物，長期適應鹽脅迫，適度的鹽處理能協助植株維持滲透勢，而淡水處理組可吸收離子較少，難以維持滲透勢，胞內水分外流結晶，造成植株死亡；還有就是可能鹽處理組植株體內抗氧化酶系統十分活躍，大量的抗氧化酶不斷清除植物體內活性氧（ROS），當低溫脅迫產生ROS 時，已有的大量抗氧化酶與ROS 反應，從而更好地維持了膜系統的穩(wěn)定，其中具體的植物生理過程需作更深入的研究。張騰國等[33]發(fā)現在鹽脅迫和低溫脅迫誘導下，油菜的活性氧和抗氧化酶活性均出現升高，有證據表明NADPH 氧化酶、MAPK 激酶級聯途徑與H2O2 信號分子均參與了相關調控，低溫和鹽脅迫可能存在交叉對話。趙遠偉等[34]發(fā)現，室溫下小麥在鹽脅迫與低溫下的鹽脅迫抗氧化機制并不一樣，并且低溫下的小麥受傷害較室溫下弱，其結果與本研究結果一致，低溫和鹽脅迫間存在補償或拮抗關系。

3.3 野外實驗

野外實驗地點選擇在杭州灣北岸南匯東灘濕地，小規(guī)模種植，由研究結果可知，海馬齒在短時低溫0℃時并不會出現死亡，但氣溫下降至?6℃時植株會死亡，造成種群數量銳減。上海市最寒冷的時間即1 月，歷年來平均氣溫大多在0℃以上，但本次研究中可見，在杭州灣北岸實施海馬齒生態(tài)浮床時，應充分考慮極端惡劣天氣帶來的不利影響，特別是寒潮。因此，海馬齒應用于杭州灣時，可以考慮采用物理方法對植物種群實施保溫措施，同時對海馬齒耐寒基因進行挖掘與研究，通過紅樹伴生植物海馬齒的向北移種，對構建北方紅樹林生境和紅樹林保護具有重要的參考意義。

4 結論

本研究對海馬齒生態(tài)浮床技術在杭州灣的應用進行了室內實驗與野外實驗，明晰了海馬齒應用的溫度、鹽度范圍和適用的光照強度，海馬齒生態(tài)浮床技術在杭州灣基本可以進行應用，但需考量極端惡劣天氣的影響?；谌驓夂蜃兣拇蟊尘跋拢瑧每尚行圆粩嗵岣?，本研究對于杭州灣富營養(yǎng)化水域的生態(tài)修復工程具有重要價值。