熱性驚厥患兒血清miR-148a-3p HMGB1 25（OH）D水平與癲癇發(fā)作的相關(guān)性

張義堂 秦小菀 石 巖 侯海燕 殷 雪 李 哲 徐會(huì)民 劉麥葉 李萬楨 宋春雨

南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000

熱性驚厥在呼吸道感染嬰幼兒中較為常見，尤其是6個(gè)月至5歲的患兒，發(fā)病率為2%～5%。由于嬰幼兒體溫調(diào)節(jié)中樞發(fā)育不完善，易高熱發(fā)生驚厥，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂［1-2］。熱性驚厥頻繁發(fā)作可能遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，最常見的表現(xiàn)為癲癇發(fā)作［3-4］。近年來，分子標(biāo)志物與熱性驚厥的研究較為熱門，微小RNA（microRNA，miR）是一種小分子的內(nèi)源性非編碼RNA，在血液中非常穩(wěn)定，不容易降解，這種特性使得miR 十分適合作為疾病的診斷標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)血清miR-148a-3p 高水平與熱性驚厥密切相關(guān)［5］，但尚未有研究分析miR-148a-3p 對(duì)熱性驚厥繼發(fā)癲癇的預(yù)測(cè)價(jià)值［6-7］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種神經(jīng)體質(zhì)炎癥介質(zhì)，目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在熱性驚厥及癲癇發(fā)作中具有重要作用，HMGB1表達(dá)過量增加兒童癲癇發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［8-9］，不過HMGB1對(duì)于熱性驚厥繼發(fā)的癲癇是否也產(chǎn)生影響尚未可知。研究證實(shí)維生素D缺乏與兒童癲癇密切相關(guān)［10］，維生素D具有神經(jīng)穩(wěn)定作用，但熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇是否與維生素D 缺乏有關(guān)，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，血清25-羥維生素D（25 hydroxyvitamin D，25（OH）D）能否作為熱性驚厥繼發(fā)癲癇的標(biāo)志物值得分析。本研究探討熱性驚厥患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與預(yù)后癲癇發(fā)作的相關(guān)性，分析各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)熱性驚厥繼發(fā)癲癇的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2018-01—2022-03 南陽市中心醫(yī)院收治的122 例熱性驚厥患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合熱性驚厥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，肛溫≥38 ℃伴隨驚厥發(fā)作；（2）首次確診的熱性驚厥；（3）年齡≤5周歲；（4）病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有癲癇病史；（2）合并先天性、遺傳性疾??；（3）腦外傷、腦出血、腦發(fā)育畸形、缺血缺氧性腦病、顱內(nèi)感染等；（4）心血管疾病、肝腎疾病、血液病、營(yíng)養(yǎng)不良、代謝性疾病、惡性腫瘤等。根據(jù)熱性驚厥患兒預(yù)后結(jié)局是否發(fā)生癲癇，分為熱性驚厥癲癇組36 例和熱性驚厥非癲癇組86 例。小兒癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］：有明確的癲癇發(fā)作癥狀，腦電圖異常放電為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合磁共振檢查可確診。同期選擇55例未發(fā)生驚厥的呼吸道感染僅發(fā)熱的患兒為對(duì)照組。對(duì)照組患兒符合急性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，肛溫≥38 ℃，未發(fā)生驚厥，年齡≤5周歲，排除其他任何疾病。3組患兒一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of general data among three groups of children

1.2 檢測(cè)方法所有患兒入院時(shí)采集外周靜脈血，3 500 r/min離心分離血清。

1.2.1 血清miR-148a-3p 檢測(cè)：geneMAG-RNA/DNA試劑盒（美國(guó)Chemicell 公司）。將樣本與RNA 抽提劑以體積1∶1.5 的比例混合，再加入氯仿混合均勻，4 ℃下離心得到上層清液。將上層清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，得到捕獲有miR-148a-3p 的磁珠。加入5 mol/L硫氰酸胝緩沖液混合均勻，加入不含RNA酶的無核酸酶洗脫液，60～70 ℃水浴，從磁珠上洗脫捕獲的miR-148a-3p。室溫條件下離心，得到含有miR-148a-3p的樣本，置于—80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，試劑盒購自美國(guó)ABI 公司。反應(yīng)體系：100 mmol/L dNTPs 0.15 μL、Multiscribe反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 μL，RNA 抑制劑0.19 μL，反轉(zhuǎn)錄引物2 μL，含微小RNA的提取樣品2 μL，無核酸酶的水8.2 μL，反應(yīng)體系15 μL/管。反應(yīng)程序：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5min，4 ℃保存。miR-148a-3p熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，TaqMan 2*Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7 μL，Primer probe l μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，反應(yīng)體系20 μL/管，2 次重復(fù)。反應(yīng)程序：50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s循環(huán)40 次。參照說明書采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-148a-3p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 血清HMGB1 檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。檢測(cè)儀器為800TS 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司），嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.2.3 血清25（OH）D檢測(cè)：采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，試劑盒購自上海紀(jì)寧生物有限公司，檢測(cè)儀器為180SE全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（拜耳公司），嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3 資料收集方法查閱患兒病歷，收集下列資料：性別、月齡、肛溫、身高、體質(zhì)量、驚厥類型、高熱持續(xù)時(shí)間、驚厥持續(xù)時(shí)間、癲癇家族史、是否早產(chǎn)、是否低出生體質(zhì)量、是否有圍生期窒息史、退熱后腦電圖結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。多因素分析采用Logistic 回歸分析。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度、特異度以及最佳截?cái)嘀?。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平比較熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達(dá)量高于熱性驚厥非癲癇組、對(duì)照組（P＜0.05），并且熱性驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p 表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1 水平高于熱性驚厥非癲癇組、對(duì)照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清25（OH）D水平低于熱性驚厥非癲癇組、對(duì)照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清25（OH）D水平低于對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

注：miR-148a-3p為微小RNA-148a-3p；HMGB1為高遷移率族蛋白B1；25（OH）D為25-羥維生素D；與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與熱性驚厥非癲癇組比較，②P＜0.05

組別熱性驚厥癲癇組熱性驚厥非癲癇組對(duì)照組F值P值n 36 86 55 miR-148a-3p 2.26±0.57①②1.71±0.43①1.50±0.38 32.248＜0.001 HMGB1（μg/L）7.45±1.87①②6.70±1.58①5.33±1.29 22.603＜0.001 25（OH）D（μg/L）26.83±6.79①②34.24±8.56①42.16±4.15 52.224＜0.001

2.2 熱性驚厥導(dǎo)致癲癇發(fā)作的單因素分析熱性驚厥癲癇組與熱性驚厥非癲癇組驚厥類型、高熱持續(xù)時(shí)間、驚厥持續(xù)時(shí)間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒復(fù)雜性熱性驚厥的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒高熱持續(xù)時(shí)間≥24 h 的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒驚厥持續(xù)時(shí)間≥15 min的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒有癲癇家族史的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒腦電圖異常的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。2組患兒早產(chǎn)兒、低出生體質(zhì)量?jī)骸谥舷⑹繁容^，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 熱性驚厥導(dǎo)致癲癇發(fā)作的單因素分析 ［n（%）］Table 3 Single factor analysis of epilepsy caused by febrile convulsion ［n（%）］

2.3 熱性驚厥導(dǎo)致癲癇發(fā)作的多因素logistic 回歸分析以癲癇發(fā)作為因變量，以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素：驚厥類型、高熱持續(xù)時(shí)間、驚厥持續(xù)時(shí)間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結(jié)果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。賦值：癲癇發(fā)作：是=1，否=0；驚厥類型：復(fù)雜性=1，單純性=0；高熱持續(xù)時(shí)間≥24 h=1，＜24 h=0；驚厥持續(xù)時(shí)間≥15min=1，＜15min=0；癲癇家族史：是=1，否=0；退熱后腦電圖結(jié)果：異常=1，正常=0。結(jié)果顯示，驚厥類型、驚厥持續(xù)時(shí)間、退熱后腦電圖結(jié)果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D與癲癇發(fā)作存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見表4。

表4 熱性驚厥導(dǎo)致癲癇發(fā)作的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of epilepsy caused by febrile convulsion

2.4 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預(yù)測(cè)熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC 曲線分析ROC 曲線顯示，血清miR-148a-3p 截?cái)嘀禐?.93（AUC=0.850，95% CI：0.777～0.924），血清HMGB1 截?cái)嘀禐?.00 μg/L（AUC=0.802，95% CI：0.720～0.884），血清25（OH）D 截?cái)嘀禐?0.85 μg/L（AUC=0.703，95%CI：0.599～0.808），對(duì)熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的預(yù)測(cè)效能最高，靈敏度和特異度分別見表5。ROC曲線見圖1。

圖1 miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預(yù)測(cè)熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

表5 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D預(yù)測(cè)熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC曲線分析Table 5 Analysis of ROC curves of serum miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

3 討論

熱性驚厥是嬰幼兒常見疾病，絕大部分患兒預(yù)后良好，但仍有少部分患兒最終進(jìn)展為癲癇［13］。文獻(xiàn)報(bào)道［14］，既往有過熱性驚厥病史的嬰幼兒日后發(fā)生癲癇的患病率遠(yuǎn)高于無熱性驚厥病史的嬰幼兒。熱性驚厥導(dǎo)致癲癇發(fā)作的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、年齡、發(fā)熱程度、免疫、感染等多因素有關(guān)［15-16］。熱性驚厥好發(fā)于6 個(gè)月至5 歲，高峰期為1～2 歲，6 歲以上較少發(fā)作，這種年齡相關(guān)性可能與嬰幼兒大腦發(fā)育不完善有關(guān)［13，17］，嬰幼兒大腦皮質(zhì)分化不全、神經(jīng)元的樹突、軸突形成不足，尚未形成大腦各區(qū)復(fù)雜的交織，出生后2歲神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞才完全形成，神經(jīng)纖維分支加長(zhǎng)，至6 歲左右大腦半球的神經(jīng)傳導(dǎo)通路完全髓鞘化。高熱會(huì)增加大腦需氧量，降低神經(jīng)元興奮閾值，刺激神經(jīng)元異常放電，繼而形成驚厥。高熱驚厥損傷了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，為日后癲癇發(fā)作埋下隱患［18-19］。本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)，驚厥類型、高熱持續(xù)時(shí)間、驚厥持續(xù)時(shí)間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結(jié)果有關(guān)，且多因素Logistic 回歸分析顯示復(fù)雜性熱性驚厥、驚厥持續(xù)時(shí)間≥15 min、退熱后腦電圖結(jié)果異常是導(dǎo)致癲癇發(fā)作的高危因素。分析原因：復(fù)雜性熱性驚厥的患兒在體溫非高熱的時(shí)候也會(huì)發(fā)生驚厥，驚厥時(shí)間長(zhǎng)，24 h內(nèi)發(fā)作次數(shù)多，預(yù)后較單純性高熱驚厥差，進(jìn)展為癲癇的風(fēng)險(xiǎn)較高［20］。多項(xiàng)研究表示，有癲癇家族史、腦電圖異常、復(fù)雜性熱性驚厥是熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇的影響因素［21-22］。

本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達(dá)量高于熱性驚厥非癲癇組，且驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p表達(dá)量也高于對(duì)照組，提示miR-148a-3p 表達(dá)與熱性驚厥以及癲癇發(fā)作有關(guān)。有體外實(shí)驗(yàn)分析miR-148a-3p 表達(dá)與癲癇發(fā)作的機(jī)制，結(jié)果顯示丙戊酸鈉通過激活miR-148a-3p/Mcl-1通路促進(jìn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，揭示miR-148a-3p高表達(dá)與癲癇發(fā)作有關(guān)［23］。miR-148a-3p是由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA 分子，通過與靶信使mRNA 特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。miR-148a-3p轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因，并不翻譯成蛋白質(zhì)，miR-148a-3p作為天然存在的基因表達(dá)的調(diào)控分子，導(dǎo)致癲癇的機(jī)制可能與神經(jīng)毒性有關(guān)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p 預(yù)測(cè)熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇的靈敏度為83.33% ，特異度為74.42% ，提示miR-148a-3p 可以對(duì)熱性驚厥患兒是否癲癇發(fā)作的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，miR-148a-3p能夠作為評(píng)價(jià)熱性驚厥疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

HMGB1是重要的炎癥介質(zhì)，在感染所致的高熱患兒中血清HMGB1處于較高水平，并且熱性驚厥患兒的血清HMGB1 水平高于僅高熱患兒。本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1水平高于熱性驚厥非癲癇組，并且驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平也高于對(duì)照組，提示HMGB1水平與熱性驚厥引起的癲癇發(fā)作有關(guān)。HMGB1 在高熱驚厥患兒的作用機(jī)制：熱性驚厥患兒機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，巨噬細(xì)胞活化，主動(dòng)分泌HMGB1釋放至細(xì)胞外，同時(shí)分泌多種炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活環(huán)氧化酶途徑導(dǎo)致發(fā)熱，炎癥因子又會(huì)作用于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。HMGB1 與癲癇發(fā)作的機(jī)制尚未完全明朗，可能與Toll樣受體機(jī)制有關(guān)，確切的分子機(jī)制有待深入分析。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 預(yù)測(cè)熱性驚厥繼發(fā)癲癇的靈敏度為77.78%，特異度為68.60%，提示HMGB1具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，可以作為熱性驚厥繼發(fā)癲癇的標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，25（OH）D 水平可能與熱性驚厥繼發(fā)癲癇有關(guān)，繼發(fā)癲癇的患兒血清25(OH)D 水平處于較低水平，低于無癲癇的熱性驚厥患兒，也明顯低于發(fā)熱但無驚厥的對(duì)照組患兒。目前已有研究證實(shí)維生素和微量元素缺乏易誘發(fā)癲癇，25（OH）D 是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式，不僅影響鈣磷代謝，而且與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。25（OH）D具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)作用，通過合成神經(jīng)遞質(zhì)，增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)功能，促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育。維生素D缺乏可使熱性驚厥嬰幼兒的神經(jīng)元興奮性升高，膜電位異常，誘發(fā)癲癇。本研究顯示，血清25（OH）D 水平預(yù)測(cè)高熱驚厥患兒癲癇發(fā)作的靈敏度為72.22%，特異度為63.95%，具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。鑒于維生素D 缺乏與癲癇發(fā)作存在關(guān)聯(lián)，臨床推薦熱性驚厥嬰幼兒可適當(dāng)補(bǔ)充維生素D 改善營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，降低癲癇發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)。

血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作有一定相關(guān)性，可作為臨床輔助診斷標(biāo)志物。鑒于臨床條件限制，本研究樣本量較少，預(yù)測(cè)價(jià)值統(tǒng)計(jì)分析尚存在一定偏倚，今后還需擴(kuò)大樣本量聯(lián)合多中心調(diào)查。另外，相關(guān)指標(biāo)的分子機(jī)制也尚不明確，還有待體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。