陳昕璐，高 原，李鵑鵑，郭歡歡，王 卓，高 申 （.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院, 上海 00433；.復旦大學藥學院, 上海 0003）

信使 RNA（mRNA）是蛋白質合成中從基因到核糖體的遺傳信息的瞬時載體[1]，相對于 DNA 治療, 有更多優(yōu)勢，例如，無整合到宿主基因組中而導致插入突變的風險、比DNA 更能獲得持久預測蛋白表達動力學蛋白表達，且體外合成 mRNA 相對容易等。然而，由于mRNA 不穩(wěn)定性，其需要一個遞送載體保護，免受核酸酶降解的同時還要使其被細胞吞噬，核酸胞內釋放并翻譯成蛋白。目前已上市的mRNA 疫苗，大多采用的是脂質納米粒（LNPs）載體[2-4]。LNP 有4 個重要組成部分：結構性脂質、膽固醇、陽離子脂質（或可電離脂質體）和隱形脂質。其中，陽離子脂質或可電離脂質是將帶負電的mRNA 能夠裝載到LNP 必不可少的組成部分。Lipo8000 是新型的陽離子脂質體轉染試劑，轉染效率和Lipo3000 基本一致，適用于將DNA和RNA 轉染入真核細胞，對多種細胞具有高轉染效率，常作為脂質納米粒載核酸藥物研究的對照試劑[5-6]。DLin-MC3-DMA 被認為是最有效的陽離子脂質體之一，具有“低毒高效”的優(yōu)勢[7]，2018 年全球首個上市的siRNA 產品Onpattro 就是采用DLin-MC3-DMA 作為載體[8]。DLin-MC3-DMA 在酸性條件下呈正電性，而生理pH 條件（pH 值為7.4）下呈電中性，現(xiàn)已成為制備肝臟靶向siRNA/LNP 系統(tǒng)的“標準”脂質材料。但其遞送mRNA 的能力尚未見到報道。本研究以DLin-MC3-DMA 作為陽離子脂質構建脂質納米粒，并以Lipo8000 為對照對其體外遞送mRNA 的能力進行考察，為后續(xù)腫瘤基因治療研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 細胞、儀器和試劑

小鼠前列腺癌 RM-1 細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）。

MalvernZS90 激光粒徑電位測試儀（Malvern公司，英國）；JEM-2010 型透射電鏡（JEOL 公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡 （Olympus 公司，日本）；SartoriusBS11os 精密電子天平（德國賽多利斯集團）；超凈工作臺（淀山湖凈化設備儀器廠）；MSHPRO磁力攪拌器（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；5804R低溫高速離心機（Eppendorf，美國）；DMIL 熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；CellmeterMini 全自動細胞計數(shù)儀（Nexcelom，美國）；旋轉蒸發(fā)儀（常州英峪予華儀器有限公司）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；真空冷凍干燥機（上海精密實驗設備有限公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國）；MULTISKAN MK3 酶標儀（Thermo公司，美國）。

1 640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶（Gibco 公司，美國）；PBS（上海源培生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒、DAPI 水溶性封片液（上海碧云天生物技術有限公司）；Lipo8000? 轉染試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；DLin-MC3-DMA(艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；DEPC（艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；β-谷甾醇（上海麥克林生化科技有限公司）；PEG2K-DMG（艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；二氯甲烷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4% 多聚甲醛（武漢塞維爾生物科技有限公司)；EGFP-mRNA（吉瑪基因）；瓊脂糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TBE（5×）（南京江苑生物科技有限公司）；Gel-red（Biosharp）。

RM-1 細胞培養(yǎng)于含10 % 胎牛血清、青霉素100 U/ml 及鏈霉素 100 μg/ml 的 1 640 完全培養(yǎng)基，在 37 ℃、5 % CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80% 融合時用于實驗。

1.2 載mRNA 脂質納米粒的處方篩選和制備

稱 取DLin-MC3-DMA、DEPC、β-谷 甾 醇、PEG2K-DMG（摩爾比為50∶10∶38.5∶1.5）分別為12.5 μl（約10 mg）、2.5 mg、4.6 mg、1.3 mg，加入2 ml 二氯甲烷，室溫攪拌8 h。旋蒸蒸干有機溶劑后純水重懸，超聲乳化，每超聲10 s，間隔5 s，重復3 次，得DLin-MC3-DMA 脂質納米粒（DLin-LNP）。將脂質納米粒溶液在-80 ℃ 冰箱中預凍，放入冷凍干燥機中，制成 DLin 凍干粉。DLin 凍干粉置于-20 ℃環(huán)境中儲存。待使用時，取適量DLin-LNP 凍干粉溶解稀釋，按比例加入適量模型藥EGFP-mRNA，室溫孵育30 min，制備成載mRNA脂質納米粒DLin@mRNA。

1.3 脂質納米粒的表征

取適量制備的DLin@mRNA，用純水稀釋制成1 mg/ml 的溶液，使用MalvernZS90 激光粒徑電位測試儀檢測粒徑及Zeta 電位，使用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)及大小并拍照記錄。

1.4 脂質納米粒的穩(wěn)定性考察

取新制備的DLin 空白載體（DLin-Blank）和DLin@mRNA 納米粒重懸于純水中，配置濃度為1 mg/ml 的脂質納米粒溶液，靜置20 d，用粒徑電位測試儀檢測其粒徑和Zeta 電位的變化情況。

1.5 DLin-LNP 對 mRNA 的包載作用

采用瓊脂糖電泳實驗考察DLin-LNP 對mRNA的包載能力。取 1 μg EGFP-mRNA，按照DLin-LNP/mRNA 質量比為0、0.5、1、2、4、6、8、10 的比例，將各組EGFP-mRNA 和DLin 按比例加入到2 ml 的EP 管中，渦旋混勻，孵育30 min 后可在預制的凝膠板上上樣。在電壓為100 kV 的條件下進行電泳，40 min 后取出電泳板，置于紫外光條件下觀察顯影并拍照記錄。

1.6 轉染實驗

采用 EGFP-mRNA 為模型藥，以RM-1 為模型細胞，以 4×105個/ml 的密度鋪48 孔板，每孔加入250 μl 含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以質量比（載體/mRNA)為2、4、6、8 分別配置 Lipo8000@mRNA 和 DLin@mRNA，每組復3 孔，PBS 組為對照組。室溫孵育30 min 后可加入孔板中。每孔加入 DMEM 空白培養(yǎng)基 250 μl，加入樣品溶液，培養(yǎng)4 h。吸除原培養(yǎng)液，換上含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)，20 h 后熒光顯微鏡下觀察mRNA 的表達情況。

1.7 空白脂質納米粒的安全性測試

為了考察DLin-Blank 載體本身的安全性，采用CCK-8 法考察對RM-1 細胞的細胞毒性作用，具體方法如下：以4×105個/ml 鋪于96 孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度的Lipo8000-Blank、DLin-Blank，使終質量濃度分別為0、10、20、50、100、200 μg/ml，每組重復6 孔，同時設置無細胞的孔為空白孔，PBS 組為對照組，于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。孵育結束后，吸除培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，并用1 640 空白培養(yǎng)基補至100 μl，置于培養(yǎng)箱孵育2 h。使用酶標儀檢測每孔450 nm 波長處的吸光度。

計算每孔的細胞活力公式如下：

1.8 細胞內攝取和分布

采用RM-1 細胞為模型，以 4×105個/ml 密度鋪24 孔板，每孔500 μl。將其放于 37 ℃、5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，PBS 洗2 次，分別加入含游離EGFP-mRNA、Lipo8000@mRNA、DLin@mRNA 的納米粒溶液(Lipo8000 組和DLin組的脂質體/mRNA 分別為2 和6），補充無血清培養(yǎng)基，使 EGFP-mRNA 終含量為 1 μg/孔，在孵箱中培養(yǎng) 24 h。吸去培養(yǎng)液，PBS 洗 1 次，用預冷的4 %多聚甲醛溶液固定30 min，PBS 洗2 次。取8 μl 含有DAPI 的封片液滴于載玻片上，將蓋玻片含有細胞的一面貼于含有封片液的載玻片上，玻片兩側用指甲油固定。利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察脂質納米粒在RM-1 細胞內的分布情況，并拍照記錄。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用軟件GraphPad Prism 7 進行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較使用ANOVA 分析法，以P＜0.05 和P＜0.01 為差別有顯著性和極顯著性。

2 結果

2.1 納米粒的表征

使用激光粒度儀檢測DLin-Blank 和DLin@mRNA 的平均粒徑分別為（151.10±2.10）nm（圖1A）和（164.75±1.85）nm（圖1B），顯示載mRNA 后的脂質納米粒平均粒徑略有增大。DLin-Blank 和DLin@mRNA 的Zeta 電 位 結 果 分 別 為（23.70±0.50）mV（圖1C）和（2.6±0.2）mV（圖1D）。使用透射電鏡觀察脂質納米粒的形態(tài)，DLin-Blank 和DLin@mRNA 納米粒均為類球形（圖2），納米粒載藥前后形態(tài)無明顯變化，粒徑在150 nm 左右，大小與粒度儀檢測結果一致。

圖1 DLin-Blank 和DLin@mRNA 的電位和粒徑檢測結果圖

圖2 DLin-Blank(左)和DLin@mRNA(右)在透射電鏡下的形態(tài)

2.2 納米粒的溶液穩(wěn)定性考察

為了評價各納米粒的穩(wěn)定性，進行了穩(wěn)定性考察，結果如圖3 所示。實驗期間，各納米粒粒徑和電位保持基本穩(wěn)定，證明其具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 脂質納米粒穩(wěn)定性考察結果 (n=3)

2.3 脂質納米粒對 mRNA 的包載作用

脂質納米粒的包載作用保護mRNA 免受酶解，是基因能夠有效轉染的關鍵。將DLin-LNP 與mRNA 以不同的質量比共同孵育結合，進行瓊脂糖電泳實驗。紫外光線下的顯影結果顯示，當質量比為 ＞1 時，脂質納米粒可以通過靜電作用將mRNA完全包裹，阻止mRNA 在電泳板上的遷移 (圖4)。

圖4 脂質納米粒與mRNA 以不同質量比結合的瓊脂糖電泳實驗圖

2.4 核酸轉染實驗

以質量比（脂質體/mRNA)分別為2、4、6、8 的Lipo8000@mRNA 和DLin@mRNA 考察RM-1 細胞中的轉染情況，同時設置PBS 組為對照組，每組復3 孔。用熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后的熒光強度，拍照記錄，并使用Image J 統(tǒng)計各組熒光強度。結果如圖5 所示，DLin 納米粒在質量比為6 時轉染效果最好，DLin 組在各質量比時的熒光強度均較Lipo8000 組的更強，顯示出更佳的轉染效果。

圖5 核酸轉染實驗結果

2.5 納米粒的細胞毒性分析

使用CCK-8 法檢測細胞活力，結果如圖6 所示，DLin-Blank 的毒性遠低于Lipo8000-Blank，當濃度達到100 μg/ml 時Lipo8000-Blank 組的RM-1細胞存活率降到50 %以下。DLin-Blank 組的細胞存活率在所檢測濃度范圍內均保持在80 %以上。DLin-LNP 較Lipo8000-LNP 具有更低的細胞毒性。

圖6 DLin 和Lipo8000 脂質納米粒對RM-1 細胞的細胞毒性分析結果 (n=6)

2.6 藥物的細胞內分布研究

制備DLin@mRNA 和Lipo8000@mRNA 分別與RM-1 細胞共同孵育3 h，并以PBS 作為對照，使用激光共聚焦顯微鏡觀察RM-1 細胞對納米粒的分布情況。結果顯示，在細胞質部分可觀察到綠色熒光蛋白（EGFP-mRNA），說明納米粒被腫瘤細胞攝取后主要分布在胞質內，且DLin@EGFP 組的熒光強度略高于Lipo8000@EGFP 組，與轉染實驗中的結果保持基本一致 （圖7）。

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察納米粒在RM-1 細胞中的分布

3 討論

LNP 作為目前 mRNA 主流的遞送載體之一，目前已常用于腫瘤治療和疫苗[9-10]。DLin-MC3-DMA 是新型陽離子脂質，為了探究DLin-MC3-DMA 包載mRNA 的效果，本研究以DLin-MC3-DMA 作為納米粒的重要組成制備了DLin@mRNA，并以此為基礎進行了體外研究。結果顯示，陽離子脂質所制備的LNP 形成了正電位效果，對帶負電mRNA 的裝載具有較好的包載效果。DLin-LNP 的納米粒為類球形，粒徑為（151.10±2.10）nm，空載電位為（23.7±0.5）mV，載藥前后形態(tài)無明顯變化。DLin@mRNA 溶液在20 d 內仍具有較好的溶液穩(wěn)定性，可有效裝載mRNA 并保護其不受分解。此外，DLin 較市售Lipo8000 具有更高的轉染效率且細胞毒性更低，顯示出良好的優(yōu)勢。

LNP 的均勻性和核酸負載效率影響最終藥效的兩個重要的因素。LNP 的制備取決于脂質成分發(fā)生分子間相互作用而自組裝。脂質體的多樣性、核酸的獨特性以及兩者混合的時間特性均會對納米粒最終的特性造成影響。LNP 制備方法很多，脂質體擠出法、納米沉淀法、微流控等都是常見的制備方法，其中微流控技術備受研究者的喜愛，但鑒于微流控通量小，在中試生產中可能受到限制[11]。因此，在載藥納米材料不斷發(fā)展的同時，對于如何生產穩(wěn)定、載量高、載藥效果好的LNP 的制備工藝，還需要進一步深入研究[12]。

綜上所述，本實驗成功構建了DLin@mRNA納米粒，并進行了載藥比例、膜包覆條件及相關體外特性的考察，該仿生納米體系具有成為安全、高效的體內靶向給藥遞送系統(tǒng)的潛力。后期我們將開展體外細胞學評價及體內的靶向性、藥效學評價，并進一步探索其抗腫瘤作用的機制。