姚 金，劉奕葦，張繼鸞，李嘉樂(lè)，吳大力，王洪斌

（江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005）

細(xì)菌作為海洋生態(tài)環(huán)境中生物群落的重要組成部分，在物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮重要作用，特別是在有機(jī)物污染的生物修復(fù)中起關(guān)鍵作用［1］。很多學(xué)者進(jìn)行了特定自然生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌生物多樣性的研究［2-5］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA 測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌生物多樣性研究［6，7］。對(duì)海洋沉積物樣品采用不同的DNA 提取方法及高通量測(cè)序技術(shù)，能獲取更多的細(xì)菌群落信息，且能反映特定環(huán)境的細(xì)菌多樣性狀況［8］。

沉積物中細(xì)菌群落通過(guò)交互代謝活動(dòng)來(lái)影響N、P 等營(yíng)養(yǎng)元素的物質(zhì)循環(huán)，代謝物通過(guò)自身或其他途徑傳遞到水體，從而影響水體的營(yíng)養(yǎng)狀況；同時(shí)，水體中的化學(xué)物質(zhì)通過(guò)自然沉降等途徑進(jìn)入沉積物，為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，影響沉積物中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及種群數(shù)量；潮間帶由于受人類活動(dòng)的干預(yù)，生態(tài)條件往往不一樣，導(dǎo)致細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異。潮間帶沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成多樣性的研究可以反映水體的污染狀況，同時(shí)也是細(xì)菌分子生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重要方面［9，10］。

連云港市位于江蘇省北部，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量陸生有機(jī)污染物排入近海海域，有機(jī)污染問(wèn)題非常嚴(yán)重，海灣生態(tài)系統(tǒng)受到不同程度的污染［5］，而這種破壞性污染直接或間接地引起細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的改變。對(duì)江蘇省連云港市海岸潮間帶沉積物細(xì)菌多樣性的研究罕見(jiàn)報(bào)道，本研究以連云港市3 個(gè)典型海岸潮間帶的泥沙沉積物為研究對(duì)象，應(yīng)用IIIumina Miseq 測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果，得出沉積物細(xì)菌生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)，探討環(huán)境與細(xì)菌的演替規(guī)律，為細(xì)菌資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)的設(shè)置及沉積物樣品采集

2017 年5 月，在連云港市海岸3 個(gè)潮間帶（墟溝、東西連島、西墅）分別隨機(jī)設(shè)置3 個(gè)采樣點(diǎn)：墟溝（SXG1、SXG2、SXG3）、東西連島（SLD1、SLD2、SLD3）及西墅（SXS1、SXS2、SXS3），采樣點(diǎn)經(jīng)緯度見(jiàn)表1。

表1 采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度

根據(jù)潮汐規(guī)律在最低潮時(shí)采樣，潮間帶分為高、中、低3 個(gè)潮區(qū)，分別設(shè)置采樣點(diǎn)，將采樣管（內(nèi)徑4.8 cm 的不銹鋼管，長(zhǎng)30 cm）打入表層，管內(nèi)沙子樣品高度達(dá)10 cm 時(shí)塞上橡膠塞，取出采樣管，將泥沙樣品裝入1 000 mL 采樣瓶（無(wú)菌處理），采樣瓶裝入帶冰的密封箱，4 ℃冰箱保存，待用。

1.2 沉積物理化因子檢測(cè)

總碳（TOC）的測(cè)定：重鉻酸鉀-濃硫酸容量法；總氮（TN）的測(cè)定：鋅-鎘還原法；電導(dǎo)率的測(cè)定：PHS-3C型酸度計(jì)；pH的測(cè)定：DDB-303A電導(dǎo)率儀。

1.3 細(xì)菌富集、總DNA 提取

將5 g 沉積物樣品接種至2216E 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)（28 ℃、48 h）。新鮮菌液裝入1.5 mL 離心管，12 000 r/min、5 min 離心后棄上清液，收集菌體，試劑盒（Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，購(gòu)自TaKa-Ra）抽提細(xì)菌總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.4 16S rRNA 擴(kuò)增及測(cè)序

將細(xì)菌基因組DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司，對(duì)細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行Illumina MiSeq 測(cè)序文庫(kù)的制備并分析測(cè)序結(jié)果。

引物序列：520F（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）；802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物理化因子特征

由表2 可知，3 個(gè)采樣點(diǎn)的pH 比較穩(wěn)定，SXG、SXS 采樣點(diǎn)的TOC、TP、TN均高于SLD 采樣點(diǎn)，說(shuō)明SXG、SXS 采樣點(diǎn)富營(yíng)養(yǎng)化程度高于SLD 采樣點(diǎn)，污染程度重，數(shù)據(jù)結(jié)果與實(shí)際環(huán)境一致，SLD 采樣點(diǎn)位于東西連島大沙灣浴場(chǎng)，屬風(fēng)景區(qū)，面向外海，潮間帶為沙質(zhì)；而SXG 采樣點(diǎn)位于攔海大堤內(nèi)側(cè)，受港灣淤積和拋淤影響較大，潮間帶為淤泥質(zhì)；SXS 采樣點(diǎn)位于西墅港灣，周圍有堿廠、新城生活區(qū)，靠近水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，污染壓力大，環(huán)境生態(tài)脆弱，底質(zhì)為淤泥。

表2 沉積物理化因子檢測(cè)結(jié)果

2.2 細(xì)菌總DNA 提取及16S rRNA 擴(kuò)增

樣品細(xì)菌總DNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，條帶明顯、單一、無(wú)降解。

圖1 細(xì)菌總DNA 檢測(cè)結(jié)果

2.3 細(xì)菌分類鑒定及群落結(jié)構(gòu)組成

由圖2 可知，3 個(gè)采樣點(diǎn)細(xì)菌主要由變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）及其他（不確定）組成。從門水平看，變形桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，占菌群總數(shù)的99.4%，其他種群僅占0.6%；SLD 采樣點(diǎn)變形桿菌門占菌群總數(shù)的99.2%，SXG、SXS 采樣點(diǎn)分別占菌群總數(shù)的99.8% 和99.1%；在屬水平，SLD、SXS 和SXG 采樣點(diǎn)的屬平均值分別為24、34、32 個(gè)（表3），沉積物細(xì)菌在屬水平上存在一定的差異。變形桿菌門中的弧菌屬、交替假單胞菌屬、紅螺菌屬和發(fā)光桿菌屬的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，占菌群總數(shù)的94.6%。

圖2 細(xì)菌群落組成

表3 細(xì)菌分類鑒定結(jié)果（單位：個(gè)）

根據(jù)獲得的OTU 豐度矩陣，使用R 軟件計(jì)算SLD、SXS 和SXG 3 個(gè)采樣點(diǎn)共有OTU 數(shù)量（圖3），3個(gè)采樣點(diǎn)共有OTU 為170 個(gè)；SXG 采樣點(diǎn)和SXS 采樣點(diǎn)共有OTU 達(dá)96 個(gè)，SLD 采樣點(diǎn)和SXS 采樣點(diǎn)共有OTU 為18 個(gè)，SLD 采樣點(diǎn)和SXG 采樣點(diǎn)共有OTU為27 個(gè)，由于3 個(gè)采樣點(diǎn)的地理位置比較近，表層沉積物中細(xì)菌組成具有一定的相似性。不同采樣點(diǎn)的生境條件及潮間帶底質(zhì)又各有不同，SLD 采樣點(diǎn)獨(dú)有OTU 為37 個(gè)，遠(yuǎn)大于SXS、SXG 采樣點(diǎn)，SXS 采樣點(diǎn)和SXG 采樣點(diǎn)潮間帶為淤泥沙質(zhì)，環(huán)境生態(tài)較一致，SLD 采樣點(diǎn)為沙質(zhì)潮間帶，人類活動(dòng)多，環(huán)境生態(tài)與SXS、SXG 采樣點(diǎn)存在一定的差異性，表明沉積物細(xì)菌群落與環(huán)境因素密切相關(guān)。

圖3 共有OTU 的Venn 圖

2.4 細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析

由表4 得出豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)（辛普森多樣性指數(shù)、香濃-維納多樣性指數(shù)）的平均值。SLD 采樣點(diǎn)：辛普森多樣性指數(shù)為0.368 3，豐富度指數(shù)為133.190 6，香濃-維納多樣性指數(shù)為1.351 5；SXS 采樣點(diǎn)：辛普森多樣性指數(shù)為0.583 4，豐富度指數(shù)為170.261 7，香濃-維納多樣性指數(shù)為1.881 6；SXG 采樣點(diǎn)：辛普森多樣性指數(shù)為0.585 9，豐富度指數(shù)為169.362 3，香濃-維納多樣性指數(shù)為2.080 3。結(jié)果表明，細(xì)菌群落多樣性和豐富度排序?yàn)镾XG 采樣點(diǎn)＞SXS 采樣點(diǎn)＞SLD 采樣點(diǎn)，該結(jié)論與樣品采集點(diǎn)自然環(huán)境特征及污染狀況一致。

表4 各樣品的豐富度和多樣性指數(shù)

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta 多樣性分析

利用R 軟件，對(duì)群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA），描述沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta 多樣性，如圖4 所示。SLD1、SLD2、SLD3 與SXS1、SXS2、SXS3 明顯歸為2 個(gè)類群，與實(shí)際的樣品采集點(diǎn)的地理分割及環(huán)境生態(tài)差異一致；而SXG3 與SXG1、SXG2 明顯分在2 個(gè)區(qū)，雖然SXG3與SXG1、SXG2 同屬墟溝海岸潮間帶，但環(huán)境生態(tài)有明顯差異。SLD1與SLD2、SLD3雖屬同一相區(qū)，但距離較遠(yuǎn)，也存在差異，但相似性差異大于地理隔絕。

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta 多樣性主成分分析

此外，基于UniFrac 距離矩陣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta 多樣性聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致（圖5）。

3 小結(jié)與討論

3 個(gè)采樣點(diǎn)的細(xì)菌主要由變形桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門、梭桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、綠彎菌門及其他（不確定）組成。本研究認(rèn)為變形桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，沉積物細(xì)菌在屬水平上存在較大差異，變形桿菌門的弧菌屬、交替假單胞菌屬、紅螺菌屬、發(fā)光桿菌屬的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，占菌群總數(shù)的94.6%。變形桿菌門的弧菌常常出現(xiàn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，紅螺菌、發(fā)光細(xì)菌是與赤潮發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)的細(xì)菌類群；交替假單胞菌占比較大，在自然界分布極廣，能利用多種有機(jī)物，包括一些不能被其他細(xì)菌利用的有機(jī)物［11］；其他不確定種類表明潮間帶細(xì)菌存在大量未知資源，有待進(jìn)一步研究。

近海岸潮間帶是人類和社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)密集的區(qū)域，隨著近海城市社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，潮間帶也面臨養(yǎng)殖污染，如富營(yíng)養(yǎng)化、陸地廢源排放、填海圍海工程及物質(zhì)入侵等生態(tài)環(huán)境問(wèn)題［9］。生態(tài)環(huán)境惡化主要表現(xiàn)為生物多樣性的演替，特別是細(xì)菌對(duì)環(huán)境現(xiàn)狀的敏感性，對(duì)其多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究有重要意義。細(xì)菌群落多樣性和豐富度的排序?yàn)樾鏈喜蓸狱c(diǎn)＞西墅采樣點(diǎn)＞東西連島采樣點(diǎn)，墟溝采樣點(diǎn)處于港灣內(nèi)部，由于攔海大堤的建造，在墟溝港灣造成一定程度的淤積，再加上港口碼頭建造產(chǎn)生的拋淤，導(dǎo)致墟溝采樣點(diǎn)完全是淤泥質(zhì)；西墅采樣點(diǎn)潮間帶大部分為淤泥質(zhì)，少數(shù)為沙質(zhì)，加上靠近海水養(yǎng)殖區(qū)域，根據(jù)養(yǎng)殖方式、規(guī)模及海流影響呈現(xiàn)不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化，養(yǎng)殖污染的壓力較大；而東西連島采樣點(diǎn)完全沙質(zhì)，屬于旅游景區(qū)，雖人類活動(dòng)多，但面向外海，無(wú)拋淤及養(yǎng)殖污染壓力，環(huán)境條件相對(duì)穩(wěn)定，故墟溝采樣點(diǎn)、西墅采樣點(diǎn)細(xì)菌多樣性和豐富度高于東西連島采樣點(diǎn)，本研究認(rèn)為潮間帶底質(zhì)條件及理化因子的不同影響了細(xì)菌多樣性和豐富度。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布的差異能夠反映人類活動(dòng)及不合理人為干預(yù)造成的環(huán)境變化對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響。

海洋環(huán)境中細(xì)菌群落具有多樣性，不同環(huán)境中細(xì)菌組成具有異質(zhì)性［12］，有研究表明，沉積物和海水之間細(xì)菌群落存在差異，Xia 等［13］通過(guò)主成分分析，發(fā)現(xiàn)黃河口沉積物與表層水體細(xì)菌組成差異較大，而高濃度懸浮物是造成二者差異的主要原因。孫鳳芹等［14］從南海深海沉積物中分離獲得349 株可培養(yǎng)細(xì)菌，芽孢菌屬和變形桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。劉玉娟等［15］從南海海洋沉積物樣品中獲得200 株可培養(yǎng)細(xì)菌，主要以厚壁菌門、變形菌桿門、放線菌門、擬桿菌門為主，在他們研究中都闡述了細(xì)菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成與生態(tài)環(huán)境改變的同步性。本研究也認(rèn)為3 個(gè)采樣點(diǎn)的潮間帶底質(zhì)類型及理化因子的不同影響了細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成，至于某些特殊細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等尚需進(jìn)一步探討。