黃 輝，劉 凱，王宇希，郭 煒，馬恒甲，謝 楠

（杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310024）

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）又名青蝦，是中國主要淡水養(yǎng)殖蝦類［1-3］，也是中國主要淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖品種之一［4］。中國的日本沼蝦養(yǎng)殖起步于20 世紀60 年代中期［5］，70 年代后，日本沼蝦養(yǎng)殖形成一定的生產(chǎn)規(guī)模，均以套養(yǎng)為主，直到80 年代末，日本沼蝦養(yǎng)殖才步入發(fā)展的盛期，養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大，單產(chǎn)得到較大幅度的提高，養(yǎng)殖技術(shù)也在實踐中逐步完善，經(jīng)濟效益顯著提升［6］。目前，日本沼蝦養(yǎng)殖過程中種質(zhì)退化現(xiàn)象比較嚴重［7］，中國開展日本沼蝦的良種選育，培育高品質(zhì)品種，對于保障日本沼蝦的種苗生產(chǎn)質(zhì)量，促進中國淡水養(yǎng)蝦業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究通過對5 個典型水域的日本沼蝦進行線粒體COI基因序列比較研究，以此了解各群體間的遺傳差異，從而為日本沼蝦的良種選育及其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年采集錢塘江（QT）、武義（WY）、高塘湖（GT），肇慶（ZQ）和南寧（NN）5 個不同群體的日本沼蝦樣本；樣品取尾部肌肉，每個群體取樣15 尾，保存于無水乙醇中，用于后續(xù)的群體遺傳學分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 DNA 提取采用氯仿-異戊醇提取法［8］。DNA 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 序列PCR 擴增 上下游引物分別為VF1_t1 5′-TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3′、VR1d_t1 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA-3′（序列來源：https：//dnabarcoding101.org/lab/ bioinformatics.html）。PCR 擴增體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，Mg2+4 μL，dNTP 混合物4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板50~100 ng，Taq酶2 U，滅菌ddH2O 補齊。PCR 反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR 產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技股份有限公司，純化后直接進行Sanger法測序。

1.2.3 序列分析 利用UGENE v41.0 軟件［9］的MAFFT 模塊對所測序列進行序列比對，trimAL 軟件［10］進行對齊。對堿基差異大的序列，通過NCBI網(wǎng)站的在線BLAST 功能，去除非特異性擴增序列；然后利用Mega X 軟件［11］，基于Kimura 2-parameter模型計算相對遺傳距離；利用R 軟件包poppr［12］得到NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉次數(shù)為1 000，其中將羅氏沼蝦序列（GenBank 號為MW602628）作為外類群（OUT），并利用R 軟件包pvclust［13］進行層次聚類分析，距離指標設(shè)為abscor，聚類方法設(shè)為average，自舉次數(shù)為1 000。利用DNAsp 軟件［14］統(tǒng)計單倍型（h）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）等遺傳多樣性參數(shù)。利用Arlequin 軟件［15］基于Tajima’sD和Fu’sFs參數(shù)進行中性檢驗，并基于F統(tǒng)計量進行分子變異分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）及計算各群體間的遺傳分化系數(shù)。利用PopArt 軟件［16］基于TCS network 網(wǎng)絡構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本沼蝦不同群體COI基因序列的堿基占比

將測序得到的75 個日本沼蝦序列和1 個羅氏沼蝦序列用UGENE v41.0 軟件比對，并經(jīng)trimAL 軟件對齊及手工校正，得到669 bp 長度的堿基序列。每個序列均可翻譯成相應的蛋白序列，共獲得68 個樣本序列，其中去除非特異性擴增序列8 個（ZQ 群體7 個，NN 群體1 個）。在67 個日本沼蝦樣本序列中，保守位點420 個、變異位點222 個、簡約信息位點123 個、堿基缺失或插入位點27 個。利用SNP-site v2.5.1 軟件將67 個日本沼蝦樣本序列轉(zhuǎn)換為vcf 格式后，利用SnpSift v5.0e 軟件計算平均轉(zhuǎn)換與顛換的比值（TS/TV），為2.78。利用Mega X 軟件計算各群體T、C、A、G 堿基的占比，由表1 可知，各群體的（A+T）占比均明顯高于（G+C），表明本研究各群體COI基因序列的堿基組成具有明顯的AT 偏倚性。此外，經(jīng)SPSS v13.0 軟件的ANOVA 分析發(fā)現(xiàn)，T、G 堿基組間存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 日本沼蝦不同群體COI基因序列的堿基占比

2.2 日本沼蝦不同群體COI 基因序列的遺傳多樣性參數(shù)

使用DNAsp 和Arlequin 軟件計算日本沼蝦的5個野生群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見表2。WY 群體的單倍型多樣性最低（0. 895），QT、ZQ 群體的單倍型多樣性最高（均為1.000），GT 群體的單倍型多樣性較低（0.990）。ZQ 群體的核苷酸多樣性最高（0.076 56），QT群體的核苷酸多樣性最低（0.011 99）。

表2 日本沼蝦不同群體COI基因序列的遺傳多樣性參數(shù)

中性檢驗結(jié)果顯示，除GT 群體的Tajima’sD為正值外，其余群體均為負值；除ZQ 群體的Fu’sFs為正值外，其余群體均為負值?；赥ajima’sD參數(shù)，NN群體中性檢驗呈顯著水平（P＜0.05）?；贔u’sFs參數(shù)，GT、QT群體中性檢驗呈顯著水平，P分別為0.001和0.000，遠小于0.05。AMOVA 分析顯示，99.56%的變異發(fā)生在群體內(nèi)，僅0.44%的變異發(fā)生在群體間，群體間的遺傳分化系數(shù)為0.004 42（P＜0.05）。

2.3 日本沼蝦5 個野生群體的單倍型網(wǎng)絡

日本沼蝦5 個野生群體的單倍型網(wǎng)絡（圖1）顯示，67 個日本沼蝦樣本定義了65 種單倍型，各單倍型具有一定的分化程度。來自NN 群體和QT 群體的單倍型形成了2 個主要分支。單倍型間節(jié)點較多，呈網(wǎng)狀分布。NN 群體的單倍型呈線狀分布；QT 群體則呈網(wǎng)狀分布；GT 群體的單倍型相對較少，分布相對集中；WY 群體的單倍型分布跨度較大，與GT、QT 群體均有交集；ZQ 群體的單倍型分布較分散。

2.4 日本沼蝦群體內(nèi)及群體間的遺傳距離

用Mega X 軟件分析得出日本沼蝦群體內(nèi)及群體間的遺傳距離，如表3 所示。5 個日本沼蝦群體內(nèi)遺傳距離為0.008 6~0.086 1，群體間的遺傳距離為0.016 4~0.072 5。其中ZQ 群體和NN 群體遺傳距離要明顯高于QT 群體和GT 群體遺傳距離。

表3 日本沼蝦不同群體內(nèi)及群體間遺傳距離

利用R 語言基于遺傳距離分別用NJ 法和層次聚類法建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和聚類樹（圖3）。QT群體和GT 群體遺傳距離較近，與ZQ 群體和NN 群體相比遺傳距離較遠，WY 群體與QT 群體和GT 群體的遺傳距離較小。

圖2 NJ 法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 層次聚類法建立的聚類樹

3 小結(jié)與討論

不同地理群體日本沼蝦的線粒體COI基因序列（A+T）含量均高于（G+C），呈現(xiàn)出明顯的AT 偏好性，與紅螯螯蝦等其他無脊椎動物的COI基因序列研究結(jié)果一致［17］。所有日本沼蝦樣本序列中，保守位點420 個，變異位點222 個，簡約信息位點123 個，堿基缺失或插入位點27 個，顯著高于紅螯螯蝦［17］。但是，日本沼蝦COI基因序列的平均轉(zhuǎn)換與顛換比值為2.78，低于紅螯螯蝦［17］。在基因組中，轉(zhuǎn)換與顛換的比值約為2。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，這個比值可以超過3［17］?？梢姡毡菊游rCOI基因序列的平均轉(zhuǎn)換與顛換比值在正常范圍內(nèi)。

物種的遺傳變異是適應生境的必要條件［18］。Grant［19］認為，單倍型多樣性大于0.5 且核苷酸多樣性大于0. 005 時，遺傳多樣性較高。本研究中不同地理群體日本沼蝦的單倍型多樣性為0.895~1.000，核苷酸多樣性為0.007 39~0.076 56，不同地理群體日本沼蝦均表現(xiàn)出較高的多樣性，其中，QT 群體和ZQ 群體表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性，ZQ 群體表現(xiàn)出較高的核苷酸多樣性，與單倍型網(wǎng)絡分析結(jié)果一致。這可能與ZQ 群體較少受到人類活動的干擾有關(guān)。在單倍型網(wǎng)絡中，不同群體單倍型之間節(jié)點較多，ZQ 群體的單倍型分布較分散。依據(jù)Grant［19］提出的4 個群體擴張事件類型，本研究結(jié)果顯示，不同群體日本沼蝦的COI基因序列呈現(xiàn)高單倍型多樣性和高核苷酸多態(tài)性的特點，總體來看符合具有長期進化歷史的穩(wěn)定群體特性。當Tajima’sD為負且達到顯著水平，表明種群分化偏離中性選擇，預示著在進化過程中受到了隨機漂變、選擇壓力和瓶頸效應等影響，可能經(jīng)歷過群體擴張［20］。本研究中，NN 群體Tajima’sD為負且達到顯著水平。Fu’sFs＞0，表明種群經(jīng)歷過遺傳瓶頸事件，F(xiàn)u’sFs＜0，表明種群趨于擴張或經(jīng)歷過選擇掃蕩［21］，本研究中，GT、QT群體的Fu’sFs為負且達到顯著水平，表明這2 個群體經(jīng)歷過選擇掃蕩或瓶頸效應之后的群體擴張。

以羅氏沼蝦為外類群，對不同地理群體日本沼蝦COI基因進行測序，得到日本沼蝦群體內(nèi)及群體間遺傳距離，基于遺傳距離以及系統(tǒng)發(fā)育樹和聚類樹分析可知，QT 群體和GT 群體遺傳距離較近，與ZQ 群體和NN 群體相比遺傳距離較遠。這有可能與QT 群體和GT 群體地理位置較近有關(guān)。WY 群體與QT、GT 群體的遺傳距離較小，經(jīng)Mega X 軟件計算，分別為0.033 2 和0.030 3，甚至小于WY 群體內(nèi)遺傳距離（0.039 4）。對于WY 群體與QT、GT 群體，可以通過進一步的研究來明確它們之間的遺傳關(guān)系。