李文翔 王艦 王芳

摘 要 為探究馬鈴薯在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)耐低溫品種‘DR-2與低溫敏感品種‘費(fèi)烏瑞它組培苗葉片蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，鑒定到肽段282 790個(gè)，唯一性肽段19 099個(gè)，蛋白質(zhì)4 471個(gè)。通過Label-Free技術(shù)對(duì)葉片差異表達(dá)蛋白分析表明，低溫脅迫下‘DR-2中有38個(gè)顯著差異蛋白，‘費(fèi)烏瑞它中有72個(gè)顯著差異蛋白。篩選出代謝通路差異蛋白13個(gè)，包括代謝相關(guān)蛋白5個(gè)，光合作用相關(guān)蛋白3個(gè)，防御相關(guān)蛋白2個(gè)，運(yùn)輸相關(guān)蛋白3個(gè)。Pathway富集分析結(jié)果表明低溫脅迫處理下，分布在光合作用、能量代謝通路中的3-磷酸甘油醛脫氫酶、鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白、肌醇-3-磷酸合酶在葉片中差異表達(dá)，該結(jié)果對(duì)研究馬鈴薯低溫響應(yīng)機(jī)制具有一定參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯；低溫脅迫；蛋白質(zhì)組學(xué)；響應(yīng)機(jī)制

低溫是制約植物生長和發(fā)育最常見的非生物脅迫之一，對(duì)植物生長和生產(chǎn)均有不利影響。植物通過細(xì)胞到生理應(yīng)答反應(yīng)迅速啟動(dòng)相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，合成相關(guān)蛋白，形成多個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以響應(yīng)低溫脅迫[1]。作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)參與植物體內(nèi)大部分生理功能的調(diào)節(jié)[2]。利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)低溫脅迫中差異表達(dá)蛋白進(jìn)行研究，可了解低溫脅迫下蛋白質(zhì)的變化，揭示其作用模式，鑒定潛在目標(biāo)蛋白，從而在蛋白質(zhì)水平上掌握脅迫因子傷害機(jī)制與植物適應(yīng)機(jī)制。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法以不同組織作為蛋白質(zhì)表達(dá)的研究已在水稻[3]、玉米[4]、小麥[5]、擬南芥[6]等植物中報(bào)道。歐文軍[7]在木薯葉片中鑒定出34個(gè)差異蛋白通過維持光合作用、能量代謝和分子伴侶等表達(dá)以響應(yīng)低溫脅迫。Rocco等[8]短期低溫處理擬南芥后發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)量增加，主要參與能量產(chǎn)生和碳代謝等途徑。唐秀英等[9]對(duì)不同品種水稻低溫處理，發(fā)現(xiàn)苗期根系差異蛋白主要在碳代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成等途徑中起催化結(jié)合作用。

馬鈴薯作為一種重要的主糧作物，由于適應(yīng)能力強(qiáng)、增產(chǎn)潛力大等特點(diǎn)，已成為僅次于小麥、水稻的第三大糧食作物[10]，在全球范圍廣泛種植。馬鈴薯喜冷涼，但溫度低于10 ℃時(shí)對(duì)幼苗生長不利，苗期遭受低溫傷害后誘導(dǎo)體內(nèi)可溶性糖和蛋白質(zhì)生成，保護(hù)植株免受低溫傷害；同時(shí)光合作用受阻，導(dǎo)致植株停止生長，對(duì)產(chǎn)量造成影響[11]。國內(nèi)對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)的研究主要集中在干旱脅迫[12]和生長發(fā)育[13]等方面，在低溫脅迫方面的研究較少。本研究以Label-Free技術(shù)為主要研究手段，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法挖掘馬鈴薯低溫脅迫響應(yīng)因子，篩選差異表達(dá)蛋白，為后續(xù)基因克隆和低溫響應(yīng)途徑研究提供參考，也為抗性品種的遺傳改良和培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）耐低溫品種‘DR-2和低溫敏感品種‘費(fèi)烏瑞它組培苗為試驗(yàn)材料，由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理方法 組培苗在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，選取長勢(shì)一致的組培苗進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照組轉(zhuǎn)入人工氣候培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度白天20 ℃、晚上18 ℃，光照度為10 000 lx，光照時(shí)間為12 h；處理組進(jìn)行低溫脅迫，溫度為4 ℃，其余條件與對(duì)照組相同，設(shè)置3次重復(fù)。分別處理5 d后，每個(gè)重復(fù)取18株，將完整功能葉混樣后液氮冷凍放入10 mL離心管，備用。

1.2.2 樣品制備 用研缽液氮冷凍研磨樣品，使用甲醇-氯仿沉淀法沉淀蛋白質(zhì)，使用NanoDrop 進(jìn)行蛋白定量，定量信息見表1。用FASP對(duì)全部蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解：每例樣品中分別加入適量DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min后室溫冷卻。轉(zhuǎn)入10? ku超濾離心管去除分子量大于10 ku的大分子蛋白，12 000×g離心15 min，棄濾液。加入100 μL IAA，震蕩混勻，室溫避光放置30 min，12 000× g離心10 min，棄濾液。加入100 μL NH4HCO3，震蕩混勻，14 000×g離心10 min，重復(fù)4次后加入40 μL Trypsin，充分振蕩，37 ℃水浴16～18 h。換新收集管，12 000×g離心10 min，收集濾液，加入適量0.1% TFA溶液，酶解后的肽段使用C18 Cartridge對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽處理，真空干燥。酶解后的肽段用0.1% FA復(fù)溶，取上清進(jìn)行濃度測(cè)定，以備LC-MS/MS分析。

1.2.3 LC-MS/MS分析 每例樣品取適量肽段使用納升流速Easy nLC 1 200 色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。緩沖液：A液為 0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為 80%）。色譜柱以95%的A液平衡。樣品進(jìn)樣到Trap Column（100 μm×20 mm，5 μm，C18，Dr. Maisch GmbH）后經(jīng)過色譜分析柱（75 μm×150 mm，3 μm，C18，Dr. Maisch GmbH）進(jìn)行梯度分離，流速為300 nL/min。液相梯度設(shè)置如下：0～3 min，B液線性梯度為2%～8%；3～98 min，B液線性梯度為8%～28%；98～108 min，B液線性梯度為28%～40%；108～110 min，B液線性梯度為40%～100%；110～120 min，B液維持在100%。肽段分離后用Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴采集質(zhì)譜分析。分析時(shí)長為120 min，檢測(cè)模式：正離子，母離子掃描范圍：300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率：60 000 @m/z 200，AGC target：3e6，一級(jí)Maximum IT：50 ms。肽段二級(jí)質(zhì)譜分析按照下列方法采集：每次全掃描后觸發(fā)采集20個(gè)最高強(qiáng)度母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖譜（MS2 scan），二級(jí)質(zhì)譜分辨率：15 000 @ m/z 200，AGC target：1e5，二級(jí)Maximum IT：25 ms，MS2 Activation Type：HCD，Isolation window：1.6 m/z，Normalized collision energy：28。Label-free非標(biāo)記定量分析委托上海拜譜生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.4 蛋白質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索 采用檢索軟件MaxQuant 1.6.0.16進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索，參數(shù)設(shè)置見表2。

1.2.5 蛋白質(zhì)定量與差異分析 MaxQuant是領(lǐng)先的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量算法，已逐漸成為該領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)解決方案之一[14]。在定量結(jié)果的顯著性差異分析中，本試驗(yàn)篩選樣本組內(nèi)3次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，視上下調(diào)差異倍數(shù)大于2且P小于0.05的蛋白質(zhì)為顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)。采用兩組樣本間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異倍數(shù)和T檢驗(yàn)得到的P兩個(gè)因素共同繪制火山圖，用于表現(xiàn)兩組樣本數(shù)據(jù)的顯著性差異。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 GO是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化基因功能分類體系，從生物過程、分子功能和細(xì)胞組分三方面對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類[15]，GO注釋的顯著性富集分析通過Fisher精確檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)。KEGG通路富集分析以所有定性蛋白質(zhì)為背景，通過Fisher精確檢驗(yàn)，來分析計(jì)算各個(gè)通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平，從而確定受到顯著影響的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

對(duì)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)，其中馬鈴薯品種‘DR-2對(duì)照組中鑒定肽段共計(jì)69 666個(gè)，唯一性肽段15 635個(gè)，蛋白組數(shù)目4 284個(gè)；低溫處理組中鑒定肽段共計(jì)66 517個(gè)，唯一性肽段15 263個(gè)，蛋白組數(shù)目4 224個(gè)。馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它對(duì)照組中鑒定肽段共計(jì)71 051個(gè)，唯一性肽段15 931個(gè)，蛋白組數(shù)目4 206個(gè)；低溫處理組中鑒定肽段共計(jì)75 556個(gè)，唯一性肽段16 527個(gè)，蛋白組數(shù)目4 299個(gè)。本試驗(yàn)得到鑒定肽段共計(jì)282 790個(gè)，唯一性肽段共計(jì)19 099個(gè)，蛋白組數(shù)目共計(jì)4 471個(gè)。

2.2 蛋白質(zhì)定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)

利用DAA質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析‘DR-2低溫處理組與對(duì)照組、‘費(fèi)烏瑞它低溫處理組與對(duì)照組、‘DR-2低溫處理組與‘費(fèi)烏瑞它低溫處理組和‘DR-2對(duì)照組與‘費(fèi)烏瑞它對(duì)照組共4個(gè)對(duì)照組中的顯著性差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分別篩選出顯著差異蛋白總數(shù)為38、72、195和193，其中上調(diào)表達(dá)蛋白與下調(diào)表達(dá)蛋白結(jié)果見圖1。

2.3 顯著性差異蛋白質(zhì)分析

紅色點(diǎn)為上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)，綠色點(diǎn)為下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)，灰色點(diǎn)為非顯著性差異蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)點(diǎn)的橫縱坐標(biāo)為離散度來表明蛋白質(zhì)差異程度，離散度越大差異越大。各組間顯著性差異蛋白見圖2。

2.4 蛋白質(zhì)聚類分析

本試驗(yàn)從樣本和蛋白質(zhì)定量信息兩個(gè)維度進(jìn)行分類，紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)。由圖3可以看出低溫脅迫和對(duì)照組的葉片差異蛋白上下調(diào)表達(dá)情況，每個(gè)處理的3組重復(fù)中相似性很高，說明本試驗(yàn)所篩選的目標(biāo)差異蛋白質(zhì)較合理。

2.5 GO富集分析

分析發(fā)現(xiàn)‘DR-2在低溫處理與對(duì)照組的差異蛋白表現(xiàn)在33個(gè)生物過程、9個(gè)細(xì)胞組分、25個(gè)分子功能途徑中。根據(jù)GO層級(jí)水平關(guān)系及富集程度篩選出主要參與低溫脅迫應(yīng)答的18個(gè)途徑。由表3可知生物過程功能分類中，差異表達(dá)基因在單一生物合成及小分子代謝過程中富集度較高；L-抗壞血酸代謝過程只有一個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。細(xì)胞組分功能分類中，細(xì)胞質(zhì)中差異表達(dá)基因顯著富集。分子功能分類中，催化活性GO term極顯著富集，且占比最多，共22個(gè)基因富集；焦磷酸酶活性過程有5個(gè)基因富集，3-磷酸肌醇合酶活性占比較少，只有1個(gè)基因表達(dá)。GO term富集說明‘DR-2葉片響應(yīng)低溫脅迫的主要組分在細(xì)胞質(zhì)中，通過激活焦磷酸酶、水解酶及3-磷酸肌醇合酶等活性催化更多蛋白質(zhì)合成，參與有機(jī)酸的合成及小分子代謝、單糖代謝等過程來抵御低溫脅迫。

分析發(fā)現(xiàn)‘費(fèi)烏瑞它在低溫處理與對(duì)照組的差異蛋白表現(xiàn)在61個(gè)生物過程、34個(gè)細(xì)胞組分、34個(gè)分子功能途徑中。根據(jù)GO層級(jí)水平關(guān)系及富集程度篩選出主要參與低溫脅迫應(yīng)答的18個(gè)途徑。由表4可知生物過程功能分類中，雖然有機(jī)物生物合成過程差異表達(dá)基因顯著富集，但是P值相對(duì)較高；雙糖、葡萄糖代謝以及對(duì)非生物刺激、光刺激和含氧化合物等反應(yīng)表現(xiàn)出抑制下調(diào)狀態(tài)。細(xì)胞組分中主要為細(xì)胞內(nèi)部分。分子功能分類中，結(jié)構(gòu)分子活性、熱激蛋白結(jié)合、3-磷酸肌醇合酶活性等極顯著差異，在氧化還原酶活性中顯著富集。GO term富集說明‘費(fèi)烏瑞它的葉片對(duì)氧化還原酶活性響應(yīng)較強(qiáng)，可能是通過光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)氧復(fù)合物促進(jìn)熱激蛋白的結(jié)合降低了雙糖和葡萄糖反應(yīng)速率，進(jìn)而引起低溫刺激應(yīng)答基因的下調(diào)表達(dá)。

分析發(fā)現(xiàn)‘費(fèi)烏瑞它低溫處理與‘DR-2低溫處理的差異蛋白表現(xiàn)在175個(gè)生物過程、36個(gè)細(xì)胞組分、91個(gè)分子功能途徑中。圖4表示低溫處理下，差異蛋白在3個(gè)類別中前10的顯著富集GO term。生物過程功能分類中，小分子代謝、單一生物代謝過程等顯著富集。細(xì)胞組分功能分類中，細(xì)胞質(zhì)部分及葉綠體部分顯著富集。分子功能分類中，氧化還原酶活性、催化活性等顯著富集。GO term富集說明在低溫脅迫下造成‘費(fèi)烏瑞它與‘DR-2不同抗性的原因可能是由于不同馬鈴薯品種在葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與葉綠體類囊體、葉綠體膜等光合作用相關(guān)的細(xì)胞組分結(jié)合能力不同，通過催化氧化還原酶活性、水解酶活性、熱激蛋白結(jié)合等，造成對(duì)糖代謝、有機(jī)物合成、非生物刺激等途徑的不同反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)低溫的不同抗性。

分析發(fā)現(xiàn)‘費(fèi)烏瑞它對(duì)照組與‘DR-2對(duì)照組的差異蛋白表現(xiàn)在155個(gè)生物過程、30個(gè)細(xì)胞組分、65個(gè)分子功能途徑中。圖5顯示‘費(fèi)烏瑞它和‘DR-2對(duì)照組中，差異蛋白在3個(gè)類別中前10的顯著富集GO term。

2.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析（圖6），4個(gè)差異蛋白在氨基酸生物合成和亞油酸代謝2個(gè)生物代謝途徑中發(fā)生了顯著性變化（P<0.05）。

如圖7所示，13個(gè)差異蛋白顯著富集在3個(gè)生物代謝途徑中，其中光合作用、半膀氨酸和蛋氨酸代謝2個(gè)途徑發(fā)生了極顯著變化（P<0.01），氨基酸生物合成途徑發(fā)生了顯著性變化（P<0.05）。

DR-4D vs DR-CK比較組鑒定出相關(guān)差異蛋白4個(gè)，F(xiàn)-4D vs F-CK比較組鑒定出相關(guān)差異蛋白12個(gè)，相關(guān)差異蛋白鑒定信息見表5。

如圖8所示，78個(gè)差異蛋白顯著富集在9個(gè)生物代謝途徑中，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、卟啉和葉綠素代謝、氨基酸生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸的生物合成、谷胱甘肽代謝6個(gè)途徑發(fā)生了極顯著變化（P<0.01），精氨酸生物合成、光合生物中的碳固定、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝3個(gè)途徑發(fā)生了顯著性變化（P<0.05）。

如圖9所示，71個(gè)差異蛋白顯著富集在10個(gè)生物代謝途徑中，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、光合作用、光合作用-觸角蛋白、精氨酸生物合成、光合生物中的碳固定5個(gè)途徑發(fā)生了極顯著變化（P<0.01），丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、代謝途徑、氨基酸生物合成、牛黃酸代謝5個(gè)途徑發(fā)生了顯著性變化（P<0.05）。

F-4D vs DR-4D比較組鑒定出相關(guān)差異蛋白33個(gè)，F(xiàn)-CK vs DR-CK比較組鑒定出相關(guān)差異蛋白34個(gè)，相關(guān)差異蛋白鑒定信息見表6。

3 討論

3.1 能量代謝相關(guān)蛋白

3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是植物體中將葡萄糖及糖原分解為丙酮酸過程的一種關(guān)鍵酶，催化3-磷酸甘油醛氧化脫氫和磷酸化生成的糖酵解途徑的中間產(chǎn)物，并使得脫氫酶的輔酶NAD+生成NADH和H+，通過蘋果酸等進(jìn)入線粒體，經(jīng)過氧化呼吸鏈的傳遞最終生成水和二氧化碳[18]。KEGG富集分析表明，對(duì)低溫處理與對(duì)照組分析發(fā)現(xiàn)3-磷酸甘油醛脫氫酶在‘DR-2中上調(diào)表達(dá)，在‘費(fèi)烏瑞它中下調(diào)表達(dá)；在低溫處理下的‘費(fèi)烏瑞它和‘DR-2中發(fā)現(xiàn)NAD脫氫酶和蘋果酸酶下調(diào)表達(dá)，與GO富集分析結(jié)果葡萄糖代謝生物過程抑制下調(diào)表達(dá)結(jié)果一致。表明在低溫脅迫下，由于馬鈴薯品種不同對(duì)3-磷酸甘油醛脫氫酶的表達(dá)不同，導(dǎo)致對(duì)葡萄糖的分解能力不同，推測(cè)是造成‘DR-2耐低溫性高于‘費(fèi)烏瑞它的原因之一。

低溫導(dǎo)致植物中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等改變[19]，誘導(dǎo)植物體基因的上下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生冷脅迫相關(guān)特異蛋白[1]。肌醇-3-磷酸合酶（MIPS）作為一種磷蛋白，參與肌醇合成過程，在肌醇穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用。MIPS的磷酸化是生物肌醇合成的新型調(diào)節(jié)機(jī)制[20]。肌醇通過自身氧化代謝生成參與細(xì)胞壁合成的木聚糖及果膠[21]，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，穩(wěn)定植株胞內(nèi)滲透壓以提高對(duì)低溫的耐受性。研究表明MIPS在擬南芥[22]、煙草[23]、水稻[24]中過表達(dá)增強(qiáng)了其對(duì)鹽、干旱和低溫脅迫的抗性； OsMIPS1的過表達(dá)增加了低溫抗性，沉默表達(dá)則降低了水稻低溫抗性[25]。植物細(xì)胞存在類三磷酸肌醇受體蛋白，參與磷脂酰肌醇系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]，通過對(duì)細(xì)胞膜液泡膜等結(jié)合調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂分化，推測(cè)本研究中低溫處理下的‘費(fèi)烏瑞它和‘DR-2肌醇磷酸合酶的上調(diào)表達(dá)穩(wěn)固了植株胞內(nèi)外環(huán)境，提高了低溫抗性。

3.2 光合作用相關(guān)蛋白

熱激蛋白（HSP）是植物細(xì)胞受逆境脅迫產(chǎn)生的一種維持生命活動(dòng)的功能蛋白，熱激70 ku蛋白上調(diào)表達(dá)可提高植株的抗逆性[27]。HSP70B的低表達(dá)可提高光系統(tǒng)Ⅱ的光敏感性，HSP70B的過表達(dá)具有保護(hù)作用[28]。GO富集與KEGG富集分析表明，熱激70 ku蛋白的抑制下調(diào)可能是造成‘費(fèi)烏瑞它中光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)氧復(fù)合物及光合作用相關(guān)生物途徑上調(diào)表達(dá)的原因。低溫通過降低代謝酶的活性，最終影響光合效率。植物光合作用電子傳遞鏈在低溫脅迫抑制后活性氧含量降低[29]。本研究發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下‘費(fèi)烏瑞它含氧化合物反應(yīng)處于抑制下調(diào)狀態(tài)，但是熱激同源70 ku蛋白、psaC多肽蛋白、Psb28亞基蛋白上調(diào)表達(dá)，這可能是相關(guān)HSP與基因蛋白共同作用在一定程度上保護(hù)了低溫環(huán)境下的‘費(fèi)烏瑞它植株避免凍傷致死。

3.3 其他蛋白

鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是一種植物胞內(nèi)分子伴侶，參與鈣離子穩(wěn)態(tài)過程的保守功能蛋白[30]。Komatsu等[31]研究表明CRT基因的過表達(dá)提高了水稻耐寒性。Sharma等[32]試驗(yàn)表明CRT基因可以響應(yīng)水稻低溫脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)低溫處理下的‘費(fèi)烏瑞它中鈣網(wǎng)蛋白下調(diào)表達(dá)，可能降低了植株胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，造成‘費(fèi)烏瑞它低溫抗性較‘DR-2弱，這與前人的研究一致。

ACO2是一種氧化酶基因，在木瓜中證實(shí)與果實(shí)成熟期的葉片衰老相關(guān)[33]。本研究中 ACO2基因上調(diào)表達(dá)，推測(cè)是造成葉片胞內(nèi)活性氧積累，導(dǎo)致‘費(fèi)烏瑞它低溫敏感的原因之一。LOX是一種脂氧合酶，吳錦程等[34]表明低溫脅迫下鈣離子系統(tǒng)與膜脂氧合酶活性調(diào)控相關(guān)，廖晶晶[35]發(fā)現(xiàn)LOX10提高了薄皮甜瓜植株的耐旱性，本研究中LOX1.5在‘DR-2中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)是穩(wěn)固了膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，提高了低溫耐受性。

4 結(jié)? 論

不同馬鈴薯品種在生長發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)存在差異，試驗(yàn)結(jié)果表明：分布在光合作用、能量代謝等通路中相關(guān)蛋白的差異表達(dá)是造成馬鈴薯對(duì)低溫不同抗性的主要原因。推測(cè)3-磷酸甘油醛脫氫酶、鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白、肌醇-3-磷酸合酶在低溫脅迫響應(yīng)途徑中十分重要，在后續(xù)試驗(yàn)中可對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 楊慧菊，蘭玉倩，王石華.植物響應(yīng)低溫脅迫組學(xué)研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，52（5）：142-148.

YANG H J，LAN Y Q，WANG SH H.Advances in plant response to low temperature stress ［J］.Shandong Agricultural Science，2020，52（5）：142-148.

［2］ LEE H E，SHIN D，SANG R P，et al. Ethylene responsive element binding protein 1 （StEREBP1） from? Solanum tuberosum increases tolerance to abiotic stress in transgenic potato plants［J］.Biochemical & Biophysical Research Communications，2007，353（4）：863-868.

［3］ VO K，RAHMAN M M.Proteomics and metabolomics studies on the biotic stress responses of rice：an? update［J］.Rice，2021，14（1）：1-16.

［4］ 石 江，趙 琳，朱月清，等.玉米幼苗葉片響應(yīng)熱脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（6）：893-908.

SHI J，ZHAO L，ZHU Y Q，et al.Proteomic analysis of maize seedling leaves in response to heat stress ［J］.Zhejiang Agricultural Journal，2018，30（6）：893-908.

［5］ MICHALETTI A，NAGHAVI M R，TOORCHI M，et al. Metabolomics and proteomics reveal drought-stress responses of leaf tissues from spring-wheat［J］.Scientific Reports，2018，8（1）：5710-5728.

［6］ 席景會(huì).低溫脅迫下擬南芥差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］.吉林：吉林大學(xué)，2007.

XI J H.Study on differential proteomics of Arabidopsis? under low temperature stress ［D］. Jinlin：Jilin University，2007.

［7］ 歐文軍.木薯葉片響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究［D］.?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2014.

OU W J. Transcriptome and? proteome study of cassava? leaves in? response to? low? temperature? stress［D］. Haikou：Hainan Unitersity，2014.

［8］ ROCCO M，ARENA S，RENZONE G，et al. Proteomic?analysis of temperature stress-responsive proteins in Arabidopsis thaliana rosette leaves［J］.Molecular? Biology? Systems，2013，9（6）：1257-1267.

［9］ 唐秀英，王會(huì)民，龍起樟，等.低溫脅迫對(duì)水稻苗期根系影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，34（6）：82-88.

TANG X? Y，WANG H? M，LONG Q ZH，et al. Proteomics study on the effect of? low temperature stress on the root system of rice seedling［J］.Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2019，34（6）：82-88.

［10］ DEVAUX，ANDR K，PETER O. Potatoes for sustainable global? food? security［J］.Potato Research，2014，57（3/4）：185-199.

［11］ 楊超英.馬鈴薯種質(zhì)資源的耐凍性鑒定和耐凍機(jī)理研究［D］.西寧：青海大學(xué)，2014.

YANG CH Y.Study on the freezing tolerance identification and? freezing tolerance? mechanism of? potato? germplasm? resources［D］.Xining：Qinghai University，2014.

［12］ 張鳳軍，葉景秀，師 理，等.干旱脅迫下不同抗旱水平馬鈴薯葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018， 46（9）：23-28.

ZHANG F J，YE J X，SHI L，et al.Proteomic analysis of potato leaves with different drought resistance levels under drought stress ［J］.Jiangsu Agricultural Science，2018，46（9）：23-28.

［13］ REMPELOS L，COOPER J ，WILCOCKSON S，et al. Quantitative proteomics to study the response of potato to contrasting fertilisation regimes［J］.Molecular Breeding，2013，31（2）：363-378.

［14］ 王 丹. SH-SY5Y細(xì)胞BPDE蛋白加合物研究［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2019.

WANG D.Study on BPDE protein adducts in SH-SY5Y cells ［D］. Taiyuan：Shanxi Medical University，2019.

［15］ ASHBURNER M，BALL C? A. Gene ontology：tool for the unification of biology.The gene ontology consortium［J］.Nature? Genetics，2000，25（1）：25-29.

［16］ 蔡英杰.轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊的耐鹽堿性研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.

CAI Y J.Study on salt and alkaline tolerance of ClNAC9 transgenic chrysanthemum ［D］. Harbin：Northeast Forestry University，2016.

［17］ KANEHISA M，GOTO S. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets［J］.Nucleic Acids Research，2012，40（4）：109-114.

［18］ 孫永梅，劉麗杰，馮明芳，等.植物在低溫脅迫下的糖代謝研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（7）：95-102，108.

SUN Y M，LIU L J，F(xiàn)ENG M F，et al.Research progress of plant glucose metabolism under low temperature stress ［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2015，46（7）：95-102，108.

［19］ 陳思琪，孫敬爽，麻文俊，等.植物低溫脅迫調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2022，38（17）：51-61.

CHEN S Q，SUN J SH，MA W J，et al.Research progress on the regulation mechanism of plant low temperature stress ［J］.Chinese Agronomy Bulletin，2022，38（17）：51-61.

［20］ DERANIEH R M，HE Q，CARUSO J A，et al.Phosphorylation regulates myo-inositol-3-phosphate synthase：a novel regulatory mechanism of inositol biosynthesis ［J］.Journal of Biological Chemistry，2013，288（37） 26822-26833.

［21］ 王 超.響應(yīng)大豆胞囊線蟲脅迫的GmMIPS基因的表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位的研究［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

WANG CH.Expression analysis and subcellular localization of GmMIPS gene in response to soybean cyst nematode stress ［D］.Shenyang：Shenyang Agricultural University，2019.

［22］ ROHIT J，MANGU V R，NIRANJAN B. Arabidopsis plants constitutively overexpressing a myo-inositol 1-phosphate synthase gene （SaINO1） from the halophyte smooth cordgrass exhibits enhanced level of tolerance to salt stress［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2013，65（6）：61-66.

［23］ MARC R. K，HEATHER K. Low-temperature perception leading to gene expression and cold tolerance in higher plants［J］.New Phytologist，2012，195（4）：737-751.

［24］ HARMEET K，POOJA V，BHANU P P，et al.Ectopic expression of the ABA-inducible dehydration-responsive chickpea l - myo -inositol 1-phosphate synthase 2 （CaMIPS2 ） in Arabidopsis enhances tolerance to salinity and dehydration stress［J］.Planta，2013，237（1）：321-335.

［25］ 趙志宏. OsMIPS在水稻生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中的功能分析［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

ZHAO ZH H.Functional analysis of OsMIPS in rice growth and development and stress response ［D］. Guangzhou：South China Agricultural University，2012.

［26］ 顧海科.水稻和擬南芥中類三磷酸肌醇受體蛋白的免疫學(xué)證據(jù)［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

GU H K.Immunological evidence of inositol triphosphate like receptor protein in rice and Arabidopsis ［D］. Beijing：China Agricultural University，2004.

［27］ 王明強(qiáng)，張道遠(yuǎn).植物熱激蛋白70基因家族及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（2）：421-428.

WANG M Q，ZHANG D Y.Research progress of plant heat shock protein 70 gene family and its biological function ［J］.Genomics and Applied Biology，2015，34（2）：421-428.

［28］ ROCCO M，ARENA S，RENZONE G，et al.Proteomic?analysis of temperature stress-responsive proteins in Arabidopsis thaliana rosette leaves［J］.Molecular BioSystems，2013，9（6）：1257-1267.

［29］ POWLES S B，BERRY J A，BJRKMAN O. Interaction between light and chilling temperature on the inhibition of photosynthesis in chilling-sensitive plants［J］.Plant Cell & Environment，2010，6（2）：117-123.

［30］ 孫旭紅，周煥斌，王道文，等.植物鈣聯(lián)蛋白與鈣網(wǎng)蛋白的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018，34（9）：48-52.

SUN X H，ZHOU H? B，WANG D W，et al.Research progress of plant cadherin and calreticulin ［J］.Chinese Agronomy Bulletin，2018，34（9）：48-52.

［31］ KOMATSU S，YAMADA E，F(xiàn)URUKAWA K.Cold stress changes the concanavalin A-positive glycosylation pattern of proteins expressed in the basal parts of rice leaf sheaths［J］.Amino Acids，2009，36（1）：115-123.

［32］ SHARMA A，ISOGAI M.A novel interaction between calreticulin and ubiquitin-like nuclear protein in rice［J］.Plant Cell，2004，45（6）：684-692.

［33］ CHEN Y T，LEE Y R，YANG C Y，et al. A novel papaya ACC oxidase gene （CP-ACO2） associated with late stage fruit ripening and leaf senescence［J］.Plant Science，2003，164（4）：531-540.

［34］ 吳錦程，吳畢莎，黃審劍，等.枇杷幼果PLD和LOX對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)［J］.植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，33（2）：203-209.

WU J CH，WU B SH，HUANG SH? J，et al. Response of young loquat fruit PLD and LOX to low temperature stress［J］.Acta Plant Science，2015，33（2）：203-209.

［35］ 廖晶晶.薄皮甜瓜CmLOX10在植物成熟衰老和干旱響應(yīng)中的作用［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

LIAO? J? J.The role of muskmelon CmLOX10 in plant maturation，senescence and drought response［D］. Shenyang：Shenyang Agricultural University，2018.

Abstract? In order to explore the response mechanism of potato to low temperature stress at the proteomic level，the leaf proteomic of the plantlets of the low-temperature-tolerant variety ‘DR-2 and the low-temperature sensitive variety ‘Favorite were analyzed in this study，the results showed that there were? 282 790 peptides，19 099 unique peptides and 4 471 proteins，and? there were? 38 differentially expressed proteins in ‘DR-2 and 72 differentially expressed proteins in ‘Favorite under low temperature stress by Label-Free technique. And 13 of them were screened outin metabolic pathways，including 5 metabolism-related proteins，3 photosynthesis-related proteins，2 defense-related proteins and 3 transport-related proteins. Pathway enrichment analysis results showed that glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，calreticulin，heat shock protein，and inositol-3-phosphate synthase distributed in photosynthesis and energy metabolism pathways were differentially expressed in leaves under low temperature stress. This study providesa reference for study? on the low temperature response mechanism of potato.

Key words Potato;Low temperature stress; Proteomics; Response mechanism