沈曉曉,宋向文,,3,張 鈺,王 威,,3,陳云波,方文佩,李艷玲,韓邦興,,3,易善勇,,3

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012;2.安徽省中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)工程研究中心,安徽 六安 237012;3.安徽省大別山中醫(yī)藥研究院,安徽 六安 237012)

老鴉瓣(Amanaedulis),別名老鴉蒜、老鴉頭,是百合科、郁金香屬多年生草本植物,為我國分布最廣的郁金香原種[1]。其味辛、甘,性寒,有小毒,歸肺、肝經(jīng),主治咽喉腫痛、瘰疬結(jié)核、瘀滯疼痛、癰癤腫毒、蛇蟲咬傷等[2](P176-177)。目前已知老鴉瓣屬共有九種[3](P184),[4](P89),[5-11],該屬植物中含有多糖、黃酮、生物堿、木質(zhì)素類等多種化學(xué)成分,其中多糖、秋水仙堿和黃酮類為其主要有效成分,具有顯著的抗腫瘤、抗痛風(fēng)作用[12](P74),[13](P1767-1769),[14],[15](P753)。

基于老鴉瓣在抗腫瘤方面的顯著療效,多年來其野生資源在市場中供不應(yīng)求[16]。因此,如何提高老鴉瓣的產(chǎn)量成為人們關(guān)注的問題。在此背景下,老鴉瓣的體外繁殖與栽培技術(shù)得到了較快發(fā)展,成了一種有效避免對(duì)其野生資源破壞的重要途徑。因此,本文是基于課題組前期在老鴉瓣屬資源綜述上的進(jìn)一步補(bǔ)充和延伸[17],主要從老鴉瓣的本草背景、化學(xué)成分、藥理作用以及體外繁殖與栽培方面進(jìn)行綜述。

1 本草背景

1.1 歷史變遷

“老鴉瓣”首載于清代藥用植物名著《植物名實(shí)圖考》中,是我國傳統(tǒng)中草藥,距今已有1600多年的藥用歷史,具有錯(cuò)綜復(fù)雜的歷史變遷[18](P1105-1125)。曾先后分別作為“貝母”“丹龍睛”“山慈菇”以及“毛慈姑”使用。而中藥山慈菇最開始記載于《本草拾遺》。老鴉瓣入藥最早出現(xiàn)于晉代,在晉代南北朝時(shí)老鴉瓣被作為“貝母”入藥,后因使用中發(fā)現(xiàn)其具有一定的毒性,被列為貝母偽品,命名“丹龍睛”;從宋代開始老鴉瓣又作為“山慈菇”的一種基原植物收載[19];古代使用老鴉瓣鱗莖入藥時(shí)并不去除其表面絨毛,因而又稱作“毛慈姑”;現(xiàn)代將其去除表面絨毛的干燥鱗莖命名為“光慈姑”[20]。根據(jù)李光燕等研究發(fā)現(xiàn)老鴉瓣在歷代本草中是“山慈菇”藥用最為明確的品種,并建議將老鴉瓣用作中藥山慈菇的基原[21]。而劉婷婷等研究發(fā)現(xiàn),老鴉瓣多為地方“山慈菇”習(xí)用品或偽品,杜鵑蘭(臨床上用“山慈菇”基原)與老鴉瓣化學(xué)成分、藥理作用方面有各自特點(diǎn),均有輕微毒性,不可混用[22]。

1.2 資源分布

迄今為止,老鴉瓣共報(bào)道了九個(gè)種[3-11],分別為老鴉瓣(Amanaedulis)、二葉老鴉瓣(A.erythronioides)、大別老鴉瓣(A.hejiaqingii)、南岳老鴉瓣(A.nanyueensis)、天目老鴉瓣(A.tianmuensis)、寶華老鴉瓣(A.baohuaensis)、安徽老鴉瓣(A.anhuiensis)、括蒼山老鴉瓣(A.kuocangshanica)和皖浙老鴉瓣(A.wnzhensis)。它們?yōu)闁|亞特有,本屬主要生長在溫帶落葉或亞熱帶常綠闊葉林、混交林。近年來,老鴉瓣屬資源在國內(nèi)新分布也多有報(bào)道[23-26]。根據(jù)植物志記載,老鴉瓣喜陽光充足的山坡或雜草叢,主要分布于安徽、江蘇、浙江、江西、湖南、湖北、山東、河南、陜西、遼寧等地,日本和朝鮮半島也有分布。馬宏亮等根據(jù)植物志記載對(duì)相關(guān)老鴉瓣資源分布進(jìn)行實(shí)地考察[27],結(jié)果顯示老鴉瓣分布最北端為遼寧丹東(北緯40.1297°),最南端為安徽黃山(北緯29.4148°),最東端為遼寧丹東(東經(jīng)124.3657°),最西端為陜西寶雞(東經(jīng)107.0413°),基本分布于中國的主要水系流域,包括長江中下游流域、黃河中下游流域、淮河流域及渤海地區(qū)。老鴉瓣九個(gè)種的具體分布為:A.edulis是最常見和最廣泛的物種(分布于遼寧(安東)、山東、江蘇、浙江、安徽、江西、湖北、湖南和陜西(太白山),以及朝鮮、日本),而其他幾個(gè)物種都是分布較狹窄的地方性物種;A.erythronioides主要分布于浙江,安徽和江西;A.hejiaqingii主要分布在大別山一帶(河南、湖北接壤地區(qū));A.nanyueensis和A.tianmuensis主要分布在河南衡山和浙江天目山一帶;A.baohuaensis主要分布在江蘇句容;A.anhuiensis主要分布在安徽天柱山一帶;A.kuocangshanica主要分布在浙江括蒼山一帶;A.wnzhensis主要分布在安徽寧國。

1.3 資源鑒別

早期因相關(guān)本草記載言之不詳,老鴉瓣的干燥鱗莖“光慈姑”常與“山慈菇”在入藥時(shí)混淆使用。宋時(shí)期老鴉瓣干燥鱗莖被稱作“山慈菇”藥用,后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)山慈菇的法定基原是蘭科植物杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)、獨(dú)蒜蘭(Pleionebulbocodioides)或云南獨(dú)蒜蘭(Pleioneyunnanensis)的干燥假鱗莖,前者稱“毛慈菇”,后二者稱“冰球子”。后因老鴉瓣除去表面絨毛的干燥鱗莖又命名“光慈姑”,自此“山慈菇”與“光慈姑”在基原上得以區(qū)分[21]。

光慈姑和山慈菇不僅在來源上有著很大差異,其植株形態(tài),花期果期等方面也大有不同。光慈姑的葉片呈現(xiàn)長條形或長形,多為兩片;花莖弱,單朵頂生,顯白色,伴有紫色條紋;鱗莖呈卵圓形,棕褐色,內(nèi)側(cè)密被長絨毛;有2枚對(duì)生或3枚輪生的苞片,苞片條形,長2—3 cm[28]?；ㄆ?—4月,果期4—5月。山慈菇葉片呈狹橢圓形、橢圓至披針形,多為一片;花葶直立或近直立,其中毛慈姑具有5—22朵花呈紫色至褐色,冰球子1—2朵頂生呈粉紅色至紫色;花期毛慈姑5—6月,冰球子4—6月,果期毛慈姑9—12月,冰球子9—10月[29]。此外,阮小麗等發(fā)現(xiàn)基于導(dǎo)管種類及大小、黏液細(xì)胞、草酸鈣針晶長短等特征,可以用作顯微鑒別包括老鴉瓣的7種山慈菇來源藥材[30]。

除基原、性狀、顯微鑒別方法以外,老鴉瓣與其混偽品還可通過分子技術(shù)進(jìn)行鑒別。例如,趙群等基于ITS序列設(shè)計(jì)老鴉瓣特異性PCR引物[31],通過改變實(shí)驗(yàn)外界條件,包括不同PCR儀、Taq酶、模板用量、退火溫度以及循環(huán)次數(shù)來探究PCR反應(yīng)最佳條件,再將PCR終產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn),通過凝膠成像儀檢測有無出現(xiàn)目的條帶來判別老鴉瓣正偽品,該法可將老鴉瓣與其混偽品準(zhǔn)確區(qū)分,相較于傳統(tǒng)方法其更穩(wěn)定、高效。此外,有學(xué)者將老鴉瓣的核型分析作為鑒別不同居群老鴉瓣的依據(jù),此法可為老鴉瓣野生資源保護(hù)和人工選育提供支持。如鄧愛輝等通過常規(guī)壓片法對(duì)老鴉瓣進(jìn)行核型分析[32],結(jié)果表明不同居群老鴉瓣的染色體數(shù)目包括24和48兩類,核型包括2A、3A、3B三種類型,其中3B最為常見,2A為首次發(fā)現(xiàn)。

2 主要化學(xué)成分及藥理活性

2.1 多糖類

多糖是植物中一類天然的高分子聚合物,具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化、降糖降脂等活性。馬宏亮對(duì)不同產(chǎn)地光慈姑多糖進(jìn)行含量測定,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的光慈姑,多糖含量差異顯著,由南到北,呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[27]。楊小花通過分離純化得到光慈姑精制多糖,發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化和清除金屬離子的能力,但總還原力較弱[33]。曹余耀等使用四種不同溶劑從老鴉瓣中提取得到四種多糖(HBSS、CHSS、DASS和CASS),分別對(duì)四種多糖進(jìn)行進(jìn)行了硫化、磷酸化和羧化修飾(S-AEPs、P-AEPs、C-AEPs),并研究比較其抗氧化活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磷酸化衍生物(P-AEP)對(duì)DPPH、羥基自由基和亞鐵離子的清除能力最強(qiáng);硫化多糖(S-AEP)表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力;羧化修飾后的C-AEP保持了穩(wěn)定的抗氧化性能[34]?？梢姴煌瘜W(xué)結(jié)構(gòu)修飾所得的多糖對(duì)老鴉瓣抗氧化的能力影響顯著;接著,通過單糖分析發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖是HBSS、CHSS和DASS中的主要糖,半乳糖是CASS中的主要糖,HBSS顯示出最大的溶解度,而CASS觀察到更高的泡沫容量和泡沫穩(wěn)定性,DASS有較高熱穩(wěn)定性,HBSS顯示出最高的ABTS+清除活性,HBSS和CASS均有較高DPPH和OH-清除活性[35]。對(duì)上述四種多糖在不同溫度、PH和不同離子強(qiáng)度下對(duì)流變性和乳化性能進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),隨著多糖濃度的增加,其乳化性能和穩(wěn)定性均增強(qiáng)[36]。此外,周妍等研究發(fā)現(xiàn)老鴉瓣多糖對(duì)H2O2所造成的果蠅氧化損傷有保護(hù)作用[37]。

2.2 黃酮類

黃酮類化合物是傳統(tǒng)中藥材中最主要有效成分之一,多為天然抗氧化劑[38],具有清除自由基,抗炎、抗菌、抗輻射等活性[39]。余曉雪等報(bào)道黃酮主要存在于老鴉瓣的干燥葉中,總黃酮含量占比較高(6.28%),利用高效液相色譜法分析出老鴉瓣葉黃酮中包含兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等多種活性黃酮類物質(zhì)[40]。汪道兵等采取正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取老鴉瓣黃酮條件,發(fā)現(xiàn)不同濃度的老鴉瓣黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力均較好,呈現(xiàn)出一定還原力[41];進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),老鴉瓣黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、草莓混菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果[42];此外,老鴉瓣黃酮對(duì)采后“紅顏”草莓還具有一定的防腐保鮮效果[43]。

2.3 生物堿類

老鴉瓣中的生物堿類成分報(bào)道較少,已知秋水仙堿是老鴉瓣中的主要生物堿類活性成分,但占比很小,如尹藝林等通過高效液相色譜法測得秋水仙堿含量為0.0754 g/g[14]。值得注意的是,該類成分在老鴉瓣的組培過程中會(huì)抑制細(xì)胞的分化,這也是老鴉瓣快繁體系建立過程中亟待解決的難題[16]。

2.4 木質(zhì)素類

張苗通過系列柱色譜法從光慈姑的活性部位中分離純化得到了25個(gè)單體化合物[44],并利用現(xiàn)代波譜技術(shù)完成了各化合物的結(jié)構(gòu)鑒定,發(fā)現(xiàn)大部分物質(zhì)為木質(zhì)素類化合物,其中3個(gè)為新化合物,24個(gè)為首次從光慈姑中分離得到,進(jìn)一步豐富了該類植物資源化學(xué)成分庫。

2.5 其他

多項(xiàng)研究表明,老鴉瓣提取物具有較好的抗腫瘤活性。例如,范岳陽等針對(duì)肝癌的治療挑選了包括老鴉瓣等六種傳統(tǒng)中草藥,采取水-乙醇和石油醚-乙酸乙酯兩種不同提取方法獲得提取物,發(fā)現(xiàn)老鴉瓣提取物可以誘導(dǎo)DNA斷裂而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞作用[45]。季烽等通過小鼠腹腔注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光慈姑可較好抑制小鼠細(xì)胞的有絲分裂,并停留在中期,特別是能明顯抑制分裂較快的惡性腫瘤細(xì)胞,同時(shí)也能夠顯著抑制急性淋巴細(xì)胞與急性粒細(xì)胞的白血病患者中的血細(xì)胞脫氫酶[15]。阮小麗等通過小鼠皮下注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老鴉瓣甲醇提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌、肝癌、小鼠S180以及人肝癌細(xì)胞株7721均具有一定抑制作用[46]。張苗通過研究發(fā)現(xiàn)光慈姑乙醇、氯仿總提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性[44]。光慈姑含有秋水仙堿,在臨床上老鴉瓣也因此常被用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[15,47,48]。Lee等發(fā)現(xiàn)光慈姑的正丁醇提取物對(duì)HIV-1病毒的p24抗原有明顯抑制作用,并能明顯保護(hù)MT-4細(xì)胞[49]。此外,李嘉琳等在老鴉瓣的甲醇提取物中發(fā)現(xiàn)了三種新郁金香苷,并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明老鴉瓣甲醇提取物中的活性物質(zhì)可作為治療皮膚病中的黑色素瘤和白癜風(fēng)候選藥物[50]。此外,徐月月等通過堿提酸沉-堿性蛋白酶水解法提取制備老鴉瓣中的抗氧化肽,發(fā)現(xiàn)其具有較好抗氧化活性[51]。

3 體外繁殖與栽培

3.1 快繁體系的建立

目前光慈姑藥材主要依賴于野生資源,隨著近年來傳統(tǒng)中草藥的迅速發(fā)展,老鴉瓣需求量的日益增長,致使老鴉瓣資源日漸匱乏,亟須通過對(duì)老鴉瓣的體外快速繁殖技術(shù)體系進(jìn)行研究,以解決老鴉瓣野生資源不足之難題。朱麗芳等利用老鴉瓣鱗莖的芯芽和子芽作為外植體進(jìn)行探究[52],發(fā)現(xiàn)芯芽和子莖在MS+TDZ 2.0mg/L+NAA 4.0 mg/L的培養(yǎng)基中芽的誘導(dǎo)率較高,為79.22%;利用子芽和不定芽在MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L的培養(yǎng)基中,可進(jìn)行叢生芽增殖,再接種于含有IBA 1.0 mg/L的MS培養(yǎng)基中即可生根。以老鴉瓣冷藏芯芽產(chǎn)生的芽莖作為外植體探究不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA對(duì)其誘導(dǎo)、分化和叢生芽增殖的影響,發(fā)現(xiàn)芽莖誘導(dǎo)愈傷時(shí)6-BA和NAA的最佳濃度為0.5mg/L和2.0 mg/L,誘導(dǎo)率為78.54%;愈傷分化不定芽時(shí)6-BA和NAA的最佳濃度為2.0 mg/L和0.2 mg/L,誘導(dǎo)率為66.21%;叢芽增值培養(yǎng)時(shí)6-BA和NAA的最佳濃度為0.5 mg/L和0.2 mg/L,增值系數(shù)2.48[53]。孫駿威等利用外層鱗片凹面朝上的接種方式在MS+TDZ 0.3 mg/L+6-BA 2.0 mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最佳,再生小鱗莖在1/4 MS+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.3mg/L的培養(yǎng)基中生根率和移栽成活率較高,分別為97%和98%[54]。

3.2 體外繁殖模式與栽培

老鴉瓣具有典型的百合花部特征,花粉在開放的1～3 d活性最高,部分活性維持直至凋謝,老鴉瓣是兼性異交類繁育系統(tǒng),主要依賴?yán)ハx傳粉[55]。涂清芳等為研究老鴉瓣苗木的最佳種植方式和應(yīng)用模式[56],采用播種和鱗莖培養(yǎng)兩種不同繁殖方式,在林蔭處、建筑周圍半遮陰處和光照充足處三種光照條件不同的園林綠化環(huán)境中進(jìn)行老鴉瓣的種植,發(fā)現(xiàn)老鴉瓣應(yīng)在園林綠化中適宜采用鱗莖的繁殖方式,且在半遮陰處鱗莖種植的出苗率、結(jié)實(shí)率、繁殖系數(shù)最高。孫媛等在探究立體栽培模式對(duì)老鴉瓣光合特性和生長的影響時(shí),也表明立體栽培適當(dāng)遮陰的條件有利于提高老鴉瓣的光合速率[57]。徐建紅通過測定不同水分條件下老鴉瓣植株的凈光合速率,發(fā)現(xiàn)老鴉瓣對(duì)土壤水分含量較敏感,栽培期間保持土壤含水量在23.7%～25.2%較為適宜[58];且老鴉瓣植株在63%～78%光強(qiáng)下光合系統(tǒng)運(yùn)行最佳。孫媛等綜合考慮光慈姑的產(chǎn)量和品質(zhì),建議老鴉瓣在100株/m2的密度條件下,使用有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥120 kg/hm2作基肥,并于生長旺期葉面噴施0.2%硫酸鋅[59]。此外,繆媛媛等通過對(duì)老鴉瓣進(jìn)行摘蕾及人工授粉處理,發(fā)現(xiàn)摘蕾可以促進(jìn)老鴉瓣中鱗莖生物量的積累,人工授粉可顯著增加老鴉瓣結(jié)實(shí)率、種子數(shù)量及單粒重[60]。

4 展望

近年來,隨著人們逐漸對(duì)老鴉瓣化學(xué)成分及藥理活性的不斷深入的了解,引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。老鴉瓣的市場需求與日俱增,而其野生資源有限,無法滿足日益增長的市場需求,已出現(xiàn)供求失衡之勢(shì)。因此,組織培養(yǎng)與人工栽培技術(shù)成為其發(fā)展的重要一環(huán),但還沒有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化需求的目標(biāo),仍需不斷推進(jìn)和完善。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)老鴉瓣的研究多集中于多糖、黃酮類、木質(zhì)素類物質(zhì),在生物堿和其他未知化學(xué)成分的探索上仍需加強(qiáng)。另外,老鴉瓣作為傳統(tǒng)中藥材,具體活性成分及相應(yīng)活性機(jī)制的研究也不夠深入,亟須國內(nèi)外學(xué)者加強(qiáng)對(duì)該物種的進(jìn)一步探索,以期為今后老鴉瓣的種質(zhì)資源保護(hù)、藥品研發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。