牛樟葉總多糖提取物減輕衰老小鼠認(rèn)知障礙的作用研究

張蓓 徐宏

【摘 要】 目的： 研究牛樟葉總多糖減輕衰老小鼠認(rèn)知障礙的作用。方法：6月齡60只昆明小鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組鹽酸多奈哌齊片（0.3 mg/100 g）、牛樟葉總多糖提取物給藥組（58 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29 mg/100 g）。采用腹腔注射D-半乳糖方法制備衰老動(dòng)物模型，連續(xù)注射給藥40 d，于第11天開(kāi)始給予相應(yīng)劑量的藥物，第36天進(jìn)行Morris 水迷宮考察小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，給藥結(jié)束后，用水合氯醛麻醉后處死取材，采用酶標(biāo)儀按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腦勻漿丙二醛（MDA）水平、小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px），采用HE染色觀察小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變情況。結(jié)果：與模型組相比，牛樟葉提取物各劑量組能不同程度降低小鼠腦勻漿中MDA水平，升高小鼠血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，牛樟葉總多糖提取物組認(rèn)知功能有所提高，與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和牛樟葉總多糖各劑量組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，核濃染和固縮的程度降低。結(jié)論：牛樟葉總多糖有一定的抗衰老減輕認(rèn)知障礙的作用，作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 總多糖；抗衰老；認(rèn)知障礙

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）09-0020-05

Abstract：Objective To study the effect of total polysaccharide from cinnamomum cinnamomum leaves on reducing cognitive impairment in aged mice.Methods Sixty Kunming mice aged 6 months were randomly divided into blank group， model group， positive group， donepezil hydrochloride tablet （0.3 mg/100 g）， and cinnamomum cinnamomum leaves polysaccharide extract administration groups （58 mg/100 g， 46.4 mg/100 g， 29 mg/100 g）. The aging animal model was prepared by intraperitoneal injection of D-galactose for 40 days. On the 11th day， the corresponding dose of the drug was given. On the 36th day， the Morris water maze experiment was conducted to investigate the behavior of the mice. The level of malondialdehyde （MDA） in brain homogenate， the level of superoxide dismutase （SOD）， glutamyl glycine （GSH） and glutathione peroxidase （GSH-Px） in serum of mice were detected by microplate plate according to the kit instruction. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining.Results Compared with the model group， each dose group of cinnamomum cinnamomum extract could reduce the level of MDA in rat brain homogenate to different degrees， and increase the levels of SOD， GSH and GSH-Px in serum of mice. The cognitive function of cinnamomum cinnamomum cinnamomum polysaccharide extract group was improved. The nerve cells in the hippocampal CA1 region of mice in the positive drug group and the total cinnamomum cinnamomum polysaccharide groups were arranged neatly and the structure was relatively normal， and the degree of nuclear hyperchromia and pyknosis were reduced. Conclusion Polysaccharide from Cinnamomum cinnamomum leaves has a certain anti-aging effect and alleviates cognitive impairment， and its mechanism may be related to its antioxidant effect.

Keywords：Total polysaccharide; Anti-aging; Cognitive Impairment

衰老分為生理性衰老以及病理性衰老，平常所說(shuō)的衰老指的是生理性的衰老，是一種無(wú)法逆轉(zhuǎn)的生理過(guò)程。衰老的表現(xiàn)形式多樣，除了外在表現(xiàn)，大腦記憶能力的減退是衰老早期的表現(xiàn)之一［1］。機(jī)體的氧化應(yīng)激程度是加劇衰老發(fā)生的重要原因之一，可推知具有抗氧化作用的藥物，可能具備一定程度的抗衰老能力。

丙二醛是生物體中脂質(zhì)過(guò)氧化的常見(jiàn)產(chǎn)物之一，在臨床學(xué)科中，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)記，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度；SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員；GSH能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶［2-5］。本項(xiàng)目檢測(cè)給藥后小鼠腦漿及血清中上述因子的變化，以明確牛樟葉總多糖具備增強(qiáng)機(jī)體抗氧能力，從而起到延緩衰老作用。

此外，項(xiàng)目組前期已有實(shí)驗(yàn)研究表明牛樟葉水提取物的抗衰老作用［6］，為了進(jìn)一步明確其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)水提取物中的多糖類(lèi)成分進(jìn)行了純化富集實(shí)驗(yàn)，以純化后的多糖提取物開(kāi)展抗衰老作用研究，以期可揭開(kāi)其抗衰老作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為牛樟葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠60只，（20±2）g，清潔級(jí)，雄性，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（23±2） ℃、相對(duì)濕度60%～65%、12 h 明暗交替環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物 牛樟葉（Cinnamomum camphora leaves）總多糖提取物（25 mg/mL ，批號(hào)：20201221，柳州市中醫(yī)醫(yī)院中藥壯瑤藥制劑研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1.3 試劑 鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200818），D-半乳糖（惠興生化有限公司，批號(hào)：120214）。MDA試劑盒（批號(hào)：20200213）、 SOD 試劑盒（批號(hào)：20190815）、GSH 試劑盒（批號(hào)：20190923）、GSH-Px 試劑盒（批號(hào)：20190414），以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.4 儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Epoch Biotek 公司，美國(guó)）；ME204E分析電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］； UV1780-5 紫外分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組給藥 60只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 W后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及牛樟葉總多糖高、中、低劑量組，每組10只。

2.2 造模給藥 造模方法參考文獻(xiàn)［7］方法，模型組、陽(yáng)性給藥組、牛樟葉總多糖各給藥劑量組小鼠每日腹腔注射D-半乳糖生理鹽水溶液2.5 mL/100 g，正常對(duì)照組注射同體積的生理鹽水，從實(shí)驗(yàn)第11天開(kāi)始，灌胃給予牛樟葉總多糖高、中、低劑量組（58.0 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29.0 mg/100 g），根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3個(gè)劑量組小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px指標(biāo)差異有顯著意義（P<0.05），加大給藥劑量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本次實(shí)驗(yàn)依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置三個(gè)劑量組比例為2∶1.6∶1），陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸多奈哌齊片（0.3 mg/100 g），正常對(duì)照組及模型組灌胃同體積的蒸留水，每7 d稱(chēng)體質(zhì)量1次，依據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，連續(xù)40 d。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)［8］ 從造模第36天開(kāi)始進(jìn)行連續(xù)5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平臺(tái)，每天依次在每個(gè)象限訓(xùn)練每只小鼠，若小鼠60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上，其潛伏期為60 s，完成逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)。在末次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后進(jìn)行1次空間探索實(shí)驗(yàn)，撤掉平臺(tái)，隨后將小鼠面向池壁放入水中，入水口選擇平臺(tái)對(duì)面的象限，時(shí)間為60 s，計(jì)算平臺(tái)象限逗留時(shí)間（t3） 與總時(shí)間（t總）的比值（%） 。

2.4 小鼠血清的SOD、GSH-Px活性、GSH活性及腦組織勻漿中MDA含量檢測(cè) 各組取8 只小鼠，水合氯醛麻醉后眼眶取血，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，采用酶標(biāo)儀按SOD、GSH-Px、GSH、MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)GSH-Px、GSH活性及SOD、MDA含量。

2.5 小鼠海馬組織病理學(xué)檢查 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)取3只小鼠，水合氯醛麻醉后開(kāi)胸，暴露心臟，自左心室升主動(dòng)脈灌注約50 mL生理鹽水，待流出液為無(wú)色時(shí)，繼以灌注4%多聚甲醛溶液約60 mL至小鼠全身變硬。灌注結(jié)束后，剖取小鼠全腦放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

1 牛樟葉總多糖提取物對(duì)小鼠行為學(xué)的影響

1.1 Morris 水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果（表1） 各組小鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逐漸縮短。與正常組比較，訓(xùn)練第5日時(shí)，模型組小鼠行動(dòng)路線仍舊雜亂無(wú)章，逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.05），逗留平臺(tái)象限時(shí)間（t3） 占總時(shí)間（t總） 的比值減少（P<0.05 ），穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P<0.05）；與模型組比較，給藥組小鼠逃避潛伏期縮短（P<0.05 ），平臺(tái)象限逗留時(shí)間占總時(shí)間的比值增加（P<0.05 ），穿越平臺(tái)次數(shù)亦增加（P<0.05） 。

1.2 牛樟葉總多糖對(duì)衰老小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影響

1.2.1 牛樟葉總多糖對(duì)衰老小鼠對(duì)血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影響 與正常組相比，模型組血清SOD、GSH、GSH-Px顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，牛樟葉總多糖各劑量組和陽(yáng)性組SOD、GSH、GSH-Px均顯著升高（P<0.05），結(jié)果詳見(jiàn)表2。

1.2.2 牛樟葉總多糖對(duì)衰老小鼠腦組織勻漿MDA水平的影響 與空白組相比，模型組MDA水平明顯升高（P<0.05），與模型組相比，陽(yáng)性給藥組及各劑量給藥組MDA明顯降低（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表3。

1.3 牛樟葉總多糖對(duì)各組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 正常組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限清晰可見(jiàn)、核仁明顯；與正常組比較，模型組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核濃染、形態(tài)不規(guī)則，與模型組比較，牛樟葉總多糖各劑量組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，核濃染和固縮的程度降低。這表明牛樟葉總多糖可有效改善D-半乳糖所致的衰老小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞受損，結(jié)果如圖1所示。

4 討論

隨著社會(huì)向老齡化的趨勢(shì)發(fā)展，對(duì)于抗衰老藥物的需求量越來(lái)越大［9-11］，中草藥多成分多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)在抗衰老作用上表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，大量的研究表明，中草藥多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)成分、皂苷類(lèi)成分等有明顯的抗衰老活性［12］。課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牛樟葉水提取物可延緩小鼠衰老進(jìn)程，但是發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)卻未進(jìn)一步研究。本文基于前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，在水提取液的基礎(chǔ)上，研究牛樟葉總多糖的純化工藝，以最大程度富集牛樟葉總多糖成分。課題組采用純化后的牛樟葉總多糖溶液進(jìn)行灌胃給藥，開(kāi)展行為學(xué)、海馬組織病理學(xué)檢查及各細(xì)胞因子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步明確牛樟葉發(fā)揮抗衰老作用的有效成分及其作用機(jī)制。

由小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型小鼠的逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)明顯減少，給予牛樟葉總多糖藥物干預(yù)后，小鼠的上述指標(biāo)較模型組均有顯著改善，表明小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯的提高。

機(jī)體衰老過(guò)程涉及許多內(nèi)外因素，活性氧自由基（ROS）是在衰老過(guò)程中最常見(jiàn)的內(nèi)源性生化因子，其能與生物膜中不飽和脂肪酸形成過(guò)氧化脂質(zhì)，引起神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致機(jī)體功能下降，產(chǎn)生記憶能力衰退等衰老癥狀［13］。機(jī)體相關(guān)抗氧化酶如SOD、GSH-Px、GSH等活性下降使機(jī)體清除自由基的能力下降，加速衰老進(jìn)程［14］。由此可推知，抗衰老的能力在一定程度與抗氧化的能力有關(guān)，提高抗氧化能力，有利于延緩衰老［15］。

D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型同時(shí)作為一種腦老化的模型日益得到認(rèn)可［16］。本研究通過(guò)腹腔注射D-半乳糖建造衰老動(dòng)物模型，從海馬組織的病理檢查結(jié)果可知，衰老模型小鼠的海馬組織與正常對(duì)照組的形態(tài)學(xué)上有明顯的差異，而給予牛樟葉多糖藥物干預(yù)后，藥物干預(yù)組的海馬組織形態(tài)學(xué)與模型組相比也有明顯的差異，這表明，通過(guò)D-半乳糖建造的動(dòng)物模型可作為腦老化模型，而給予牛樟葉總多糖干預(yù)后，腦老化的程度有所減輕。

通過(guò)對(duì)各組小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px以及腦組織勻漿MDA的檢測(cè)結(jié)果可知，血清SOD、GSH、GSH-Px的活力，模型組與正常組相比，指標(biāo)均下降（P＜0.05），牛樟葉總多糖各劑量藥物干預(yù)組與模型組相比，指標(biāo)均上升（P＜0.05），而腦組織勻漿MDA含量，模型組與正常組相比，指標(biāo)均上升（P＜0.05），牛樟葉總多糖各劑量藥物干預(yù)組與模型組相比，指標(biāo)均下降（P＜0.05）。結(jié)果提示牛樟葉總多糖能升高D-半乳糖致衰老小鼠模型血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，同時(shí)降低MDA的水平，在一定程度上提高了機(jī)體清除自由機(jī)的能力，削弱了脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)腦組織的損傷作用，從而達(dá)到抗衰老的目的。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)牛樟葉發(fā)揮抗衰老作用的活性成分為多糖類(lèi)成分，而至于是哪一種多糖仍需進(jìn)一步分離研究。通過(guò)對(duì)抗氧化酶活性及過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA的含量檢測(cè)結(jié)果可推測(cè)，牛樟葉多糖確能通過(guò)抗氧化作用降低腦內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)的含量，起到腦組織的保護(hù)作用，進(jìn)而延緩衰老的發(fā)生，至于是通過(guò)激活哪條通路發(fā)揮作用，有待課題組進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］陳厚早，劉德培.衰老的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀與干預(yù)策略［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，43（10）：1261-1265.

［2］YANG Z，WANG J，LI J，et al.Antihyperlipidermic and hepatoprotective activities of polysaccharide fraction from Cyclocarya paliurus in high-fat emulsion-induced hyperlipidaemic mice［J］Carbohydrate Polymers，2018，183（3）：111-20.

［3］LIU Y，LI H，SHA Q，et al.Effects of maternal underutrition on the growth，development and antioxidant atatus of ovine placentome subtypes during late pregnancy［J］.Theriogenology，2018，110（4）：96-102.

［4］WU W，WEI W，LU M，et al.Neuroprotective Effect of Chitosan Oligosaccharide on Hypoxic-Ischemic Brain Damage in Neonatal Rats［J］.Neurochemical Research，2017，42（111）：3186-3198.

［5］安紅梅，史云峰，胡兵，等.地黃益智方對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織SA-β-gal活性的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（3）：547-549.

［6］張蓓，余瀟苓，覃開(kāi)羽，等.牛樟葉水提取物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠的作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2021，30（3）：18-21.

［7］黃飛娟，程德金，吳正治，等.阿爾茨海默病病理鼠模型研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（6）：588-590.

［8］周勇，劉晶，陳剛.淫羊藿對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老模型小鼠p53/p21信號(hào)通路的影響［J］.2019，37（9）：2159-2162.

［9］WANG L J，DU J L，ZHAO F Y，et al.Tillium tschonoskii maxim saponin mitigateds D-galactose-induced brain aging of rats through rescuing dysfunctional autophagy mediated by Rheb-mTOR signal pathway［J］.Biomed Phamacother，2018（98）：516-522.

［10］張忠立，左月明.延齡草提取物對(duì)異質(zhì)性及多因性阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶與抗氧化能力的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016，36（14）：3362-33364.

［11］詹光杰，黃發(fā)軍，肖本見(jiàn).頭頂一顆珠對(duì)D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2013，15（10）：1-4.

［12］王子禮，陳顯兵，趙方毓，等.頭頂一顆衰老小鼠認(rèn)知及海馬BNDF、TrkB的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2020，40（11）：1373-1377.

［13］翟春梅，薛迎鳳，高利權(quán)，等.白術(shù)對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶和抗氧化能力的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2021，49（7）：26-31.

［14］范紅艷，顧饒勝，劉師兵，等.苦參總黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2015，40（21）：4240-4244.

［15］WU C H，WU C F，HUANG H W，et al.Naturally occurring flavonoids attenuate high gulcose-induced expression of proinflammatory cytokines in human moncytic THP-1 cells［J］.Mol Nutr Food Res，2009（53）：984-995.

［16］SHWE T，PRATCHAYASAKUL W，CHATTIPAKORN N，et al.Role of D-galactose-induced brain aging and its potential used for therapeutic inteventions［J］.Exp Gerontol，2018（101）：13-36.

（收稿日期：2022-08-23 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：柳州市陽(yáng)和工業(yè)新區(qū)應(yīng)用技術(shù)研究開(kāi)發(fā)與科技創(chuàng)新項(xiàng)目合同（2019007）。

作者簡(jiǎn)介：張蓓（1984—）女，漢族，碩士，副主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)及活性成分研究。E-mail：zhangbei8402@126.com