羅嘉俊 黃曉桃 吳云霞

1華中科技大學同濟醫(yī)學院第二臨床學院,武漢 430030

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬湖北省婦幼保健院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430070

3華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院生物藥學系,武漢 430030

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)系育齡期婦女常見疾病,世界范圍內(nèi)約有15%的女性受其困擾[1]?；加蠵COS的女性因雄激素分泌過多、排卵不規(guī)則導(dǎo)致生育能力低下且容易合并多種并發(fā)癥,包括2型糖尿病、肥胖、精神疾病等。成年女性被診斷為PCOS需要滿足以下3個標準中的2個:①高雄激素血癥;②排卵減少;③符合鹿特丹標準的PCOS形態(tài)[2]。高雄激素血癥在PCOS的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。雄激素可抑制卵泡成熟并導(dǎo)致大量小竇卵泡的出現(xiàn)及無排卵[3],并表現(xiàn)出家族遺傳性,預(yù)估遺傳率為70%,但在PCOS中只有一部分遺傳性可通過已確定的易感位點來解釋[4]。PCOS臨床表現(xiàn)存在高度異質(zhì)性,且其病因復(fù)雜,涉及遺傳、生殖、內(nèi)分泌代謝及環(huán)境等多種因素,而PCOS動物模型有利于促進我們對PCOS病因?qū)W和病理生理學的理解。嚙齒動物因體型小、繁殖周期短,用于實驗研究較為方便,成為目前建立PCOS模型最常用的實驗動物。本文主要總結(jié)PCOS嚙齒動物模型特點并對PCOS中醫(yī)證候模型進行探索,以便為將來更好地評價藥物特別是中藥防治PCOS提供借鑒與參考。

1 PCOS嚙齒動物模型

1.1 雄激素造模

1.1.1 DHEA造模法 脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是青春期女性體內(nèi)首個出現(xiàn)的雄激素,也是第一種用于誘發(fā)PCOS動物模型的藥物。當經(jīng)外源性途徑增加體內(nèi)DHEA水平致使雄烯二酮水平升高時,雌酮和睪酮也隨之升高,從而引起高雄激素血癥,并出現(xiàn)卵泡發(fā)育不佳、排卵障礙以及卵巢多囊樣改變等癥狀[5]。Lee等[6]在1991年通過對大鼠皮下注射DHEA成功誘導(dǎo)出了PCOS模型。

1.1.2 TP造模法 在高雄激素環(huán)境中垂體對下丘腦的刺激不敏感,致使黃體生成素(luteinizing hormone,LH)持續(xù)性分泌,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的促排卵作用由于雌激素持續(xù)分泌產(chǎn)生負反饋效應(yīng)而受到抑制,因此出現(xiàn)排卵障礙等PCOS相關(guān)癥狀[5]。Azeemuddin等[7]對大鼠給予溶于橄欖油的丙酸睪丸酮(testosterone propionate,TP)溶液1.25 mg/d發(fā)現(xiàn),模型組出現(xiàn)睪酮升高、體質(zhì)量增加、動情周期不規(guī)則及胰島素抵抗等PCOS樣癥狀。

1.1.3 DHT造模法 雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)是睪酮在體內(nèi)非芳香化的代謝產(chǎn)物,有較高的雄激素活性,能減少顆粒細胞的數(shù)量和降低芳香化酶的活性,導(dǎo)致雌激素合成減少和卵泡閉鎖[5]。Gao等[8]選用21日齡雌性SD大鼠并連續(xù)給藥DHT,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、卵泡閉鎖、激素水平改變及代謝紊亂等PCOS癥狀。

1.2 基因敲除模型

1.2.1 ErbB4基因敲除小鼠 在與PCOS相關(guān)的20個單核苷酸多態(tài)性中有表皮生長因子受體4(ErbB4)基因[9]。根據(jù)人類蛋白質(zhì)圖譜,ErbB4在大腦、內(nèi)分泌器官和女性組織中強烈表達。有研究將顆粒細胞中的ErbB4條件性刪除,以確定它是否促進PCOS樣生殖功能障礙的發(fā)展,并研究相關(guān)分子機制[10]。將帶有柔化ErbB4基因的小鼠與Amh-Cre小鼠雜交,并特異性地刪除卵巢中的該基因發(fā)現(xiàn),ErbB4-Amh cre雌鼠出現(xiàn)發(fā)情周期中斷、排卵延遲和次級階段卵泡阻滯及低生育力,表明ErbB4信號參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育[10]。

1.2.2 DENND1A基因敲入和敲除小鼠 DENND1A是另一個與PCOS相關(guān)的易感位點。為了建立過表達人DENND1A的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,有研究使用了3個啟動子:CMV、Lhcgr和Tet[11]。這些都沒有導(dǎo)致DENND1A.V2蛋白的過表達,可能其他技術(shù)如CRISPR/Cas9,能成功將人類DENND1A.V2樣基因引入小鼠。值得注意的是,在DENND1A基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)ε咛グl(fā)育至關(guān)重要[12]。因此通過敲入和敲除基因來確定易感位點在PCOS生殖、代謝和行為表型中的作用,對于理解PCOS模型也有重要價值。

1.3 女性產(chǎn)前雄激素暴露模型

通過小鼠產(chǎn)前DHT暴露,可了解母體雄激素過量對后代生育健康的影響。產(chǎn)前DHT暴露會導(dǎo)致生殖功能障礙,睪酮和LH升高,女性月經(jīng)周期不規(guī)則和PCOS樣形態(tài)[13-15]。近期研究表明,產(chǎn)前雄激素暴露小鼠的神經(jīng)激肽B和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核細胞中雄激素受體增加,孕激素受體和強啡肽蛋白表達減少,表明孕激素負反饋受損[16]。研究認為,早期開始抗雄激素治療可增加PCOS婦女自發(fā)受孕和分娩的可能性[17]。此外,雄激素受體缺陷保護雌性F1后代在成年時不會發(fā)展成PCOS樣表型[18-19],這提示通過雄激素受體介導(dǎo)PCOS樣發(fā)展的重要性。

1.4 女性產(chǎn)前AMH暴露模型

研究表明,產(chǎn)前抗繆勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)暴露引發(fā)母親促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)驅(qū)動的雄激素過量,導(dǎo)致PCOS樣生殖障礙表型,如陰道發(fā)育和青春期延遲、動情周期不規(guī)則,成年雌性后代在5個月時出現(xiàn)LH、睪酮和AMH的升高[20]。另一方面,產(chǎn)前AMH暴露的雄性后代盡管青春期開始延遲,但是循環(huán)中的LH、睪酮或AMH與雌性后代相比沒有差別,這表明產(chǎn)前AMH暴露的效應(yīng)在性別上有差異[20]。研究表明,產(chǎn)前AMH暴露的影響通過GnRH途徑介導(dǎo),但并不能排除雄激素受體途徑的作用[20-21]。為此,研究人員使用了吻素蛋白(kisspeptin,KISS)特異性雄激素受體缺陷小鼠[20],并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前暴露于AMH的KISS特異性雄激素受體缺陷小鼠在F1雌性和F1雄性后代中均不受PCOS樣生殖特征的影響,這表明AMH和雄激素在產(chǎn)前存在密切的相互作用。

2 PCOS的中醫(yī)病因病機

2.1 腎虛

《素問·上古天真論》曰:“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長;二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時下,故有子”。腎藏先天之精,主生殖,為人體生命之本原。腎具有貯存、封藏精氣的作用。腎所藏之精稱為腎精,可分為先天之精和后天之精。先天之精稟受于父母,是人體生長發(fā)育和生殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。后天之精來源于脾胃化生的水谷之精,可化生五臟精氣,維持臟腑的生理功能,并下輸腎中,充養(yǎng)先天之精。二者相互作用,共同促進人的生長發(fā)育和生殖。腎精化生腎氣,又稱元氣,是化生臟腑之氣的根本。人出生以后隨著腎氣的充盈而產(chǎn)生天癸,天癸來至,女子月經(jīng)來潮,生殖器官發(fā)育成熟。腎氣分為腎陰和腎陽,腎陽為一身陽氣之本,能溫煦臟腑,促進精血津液運行。若腎陽虛衰,其溫煦作用減弱,則脾土不溫,氣血生化無力,致血?？仗?胞宮失養(yǎng),可導(dǎo)致女子月經(jīng)不調(diào)、宮寒不孕。陰無陽不生,若陽氣虧虛,則陰精生化無源,卵子生長發(fā)育缺乏物質(zhì)基礎(chǔ),難以成熟;又因陽氣虛衰,推動和激發(fā)作用減弱,則排卵受阻。

又腎主水,具有主司和調(diào)節(jié)全身水液代謝的作用。若腎陽不足,氣化無力,升降失司,則水濕停聚,日久則成痰濕。故《證治匯補》曰:“痰之源,出于腎,故勞損之人,腎中火衰,不能收攝,邪水、冷痰上泛”。痰濕為陰邪,其性黏滯,易襲陰位,故易壅塞、阻滯胞宮,卵巢無法正常排卵,導(dǎo)致孕育困難。研究表明,瘀血滯留可明顯增加PCOS的發(fā)病[22]。流行病學研究顯示,臨床有40%～50%PCOS患者被辨證為腎虛痰濕型[23];曾倩等[24]的研究顯示,在PCOS患者中,單一證型出現(xiàn)頻率最高是腎虛證,占94.7%。由此可知,PCOS主要病機為腎虛。

2.2 脾虛失運

《素問·太陰陽明論》曰:“脾與胃以膜相連”。脾胃同居中焦,脾主運化,胃主收納,共同完成消化飲食、化生水谷精微的作用,故稱脾胃為“倉廩之本”。脾主運化,一可運化水谷,若脾失健運,則水谷不化,氣血不充,臟腑失于濡養(yǎng)、功能受損;二可運化水液,若脾失健運,轉(zhuǎn)輸功能失常,則水液停聚,以致水濕痰飲,痰濕困于胞宮則致女子不孕。《萬氏女科》載:“婦人女子,經(jīng)閉不行,乃脾胃損”。張瓊[25]報道PCOS從痰論治,每獲良效?！夺t(yī)鏡》載:“肥人多濕,其痰易結(jié),亦有因濕而血滯者”。李娜[26]運用補腎化痰方藥治療PCOS實驗動物模型,發(fā)現(xiàn)其對改善內(nèi)膜容受性有較好的效果。

2.3 肝郁

肝主疏泄,可疏通、暢達全身氣血津液。肝主疏泄,調(diào)暢各臟腑經(jīng)絡(luò)之氣的升降出入。若肝失疏泄,則肝氣不舒,氣機郁結(jié),可導(dǎo)致情緒抑郁不樂、焦慮,或肝郁化火,癥見性情急躁、易怒。當情志受各種誘因波動反饋至下丘腦的情緒調(diào)節(jié)中樞時,下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸作用于內(nèi)分泌系統(tǒng)而引起卵巢的一系列變化。因肝克脾,肝郁可致脾失健運,運化失司則水濕匯聚成痰;又因肝腎同源,肝郁氣滯日久病變可累及腎臟,造成肝腎同病。肖雯暉等[27]研究表明,七情中的情志不舒因素最容易導(dǎo)致PCOS,并引起激素分泌紊亂和激素水平低下。

2.4 沖任虛損

沖任二脈均起于胞中,任脈在腹面正中線走行,與各陰經(jīng)均有聯(lián)系,故被稱為“陰脈之?！?。其可調(diào)節(jié)全身陰經(jīng)氣血,亦可調(diào)節(jié)女子生殖功能,又有“任主胞胎”之稱。沖脈則容納和調(diào)節(jié)十二經(jīng)脈的氣血,故被稱為“十二經(jīng)脈之?！?又被稱為“血?！?。天癸可調(diào)節(jié)任脈和沖脈的盛衰,天癸充足才能任脈通、沖脈盛,進而接受來自各經(jīng)脈的氣血,注入胞宮以維持生殖功能。若任、沖二脈氣血虧虛或氣滯血瘀,則會影響女性生殖功能,出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、不孕等癥狀。

3 PCOS相關(guān)中醫(yī)證候模型探討

上述提到并已建立的西醫(yī)PCOS動物模型均較為成熟且符合人類PCOS的表現(xiàn)。而目前中醫(yī)根據(jù)腎虛、肝郁、脾虛等證候特點已廣泛建立相應(yīng)的動物證候模型,但尚無中西醫(yī)結(jié)合PCOS模型的報道,而單用西醫(yī)的PCOS模型來評價中藥的療效明顯有其局限性,因此本文提出,嘗試運用二者相結(jié)合的模型用于中藥的篩選和機制研究,以符合中醫(yī)的辨證思想和特點,具體探索如下:

3.1 PCOS腎虛模型探討

有研究者[28]通過肌肉注射氫化可的松和灌胃甲狀腺片的方式分別制造腎陽虛和腎陰虛大鼠模型,并觀測造模后大鼠與正常大鼠的行為活動差異、體重和體溫的變化、cAMP/cGMP比值變化,以判斷造模是否符合腎陽虛和腎陰虛的特點。另有學者通過灌胃腺嘌呤[29]、雷公藤多苷[30]等直接損傷腎組織,使實驗動物表現(xiàn)出腎虛證候。另有通過手術(shù)摘除腎臟[31]、甲狀腺[32]、卵巢[33]等,影響機體相關(guān)激素的分泌,以達到建造腎虛模型的目的。而根據(jù)“恐傷腎”的中醫(yī)理論,可通過驚嚇或恐嚇實驗動物的方式使動物出現(xiàn)腎虛相關(guān)證候。沈雁等[34]利用“貓嚇鼠”的方式制造腎虛模型,并發(fā)現(xiàn)造模后實驗動物出現(xiàn)生殖功能受損的情況。另外,“勞則氣耗”,通過強迫實驗動物游泳而過度勞累的方式也可使動物出現(xiàn)腎虛證候[35]。在實驗中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述腎虛造模方法中的一種或多種相結(jié)合來模擬PCOS腎虛模型。

3.2 PCOS肝郁模型探討

呂愛平等[36]用鉗夾大鼠尾部激怒大鼠使其處于斗爭狀態(tài),模型復(fù)制后大鼠出現(xiàn)易怒撕咬的表現(xiàn)。李楊等[37]分離大鼠頸部迷走神經(jīng)后連接生物信號分析系統(tǒng)進行刺激,發(fā)現(xiàn)造模后大鼠出現(xiàn)食欲減低、倦怠乏力、毛發(fā)變暗等表現(xiàn)。張小麗等[38]用0.2 mL 0.1%腎上腺素灌胃刺激大鼠后,大鼠出現(xiàn)煩躁不安、激怒、相互撕咬,幾日后毛色變黃、精神萎靡、飲食變少等表現(xiàn)。在實驗中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述肝郁造模方法中的一種或多種相結(jié)合來模擬PCOS肝郁模型。

3.3 PCOS脾虛模型探討

董一昕等[39]采用利血平構(gòu)建脾虛模型,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)倦怠乏力、反應(yīng)淡漠、喜歡蜷縮等癥狀,提示脾虛模型成功。李婷婷等[40]發(fā)現(xiàn)大黃水煎液灌胃7 d的動物模型存在結(jié)腸黏膜水腫等病理損傷。孫瑜嬬等[41]采用飲食不節(jié)加勞倦過度法制備脾虛大鼠模型,發(fā)現(xiàn)大鼠唾液腺組織形態(tài)和唾液生化指標發(fā)生改變。孫勝振等[42]采用苦寒瀉下法——冰水復(fù)合大黃水煎液灌胃復(fù)制小鼠脾虛泄瀉模型,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的小腸推進率和血漿血管活性腸肽含量明顯升高,胃殘留率和血漿中的胃動素含量明顯降低。在實驗中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述脾虛造模方法中的一種或多種相結(jié)合來模擬PCOS脾虛模型。

4 結(jié)語與展望

目前PCOS動物模型的建立已經(jīng)有一定的成果,包括注射雄激素法、產(chǎn)前雄激素暴露法和基因編輯等均取得較為滿意的效果,但各種造模方法的具體表現(xiàn)不盡相同,比如:來曲唑誘導(dǎo)的大鼠模型有血清中孕酮濃度降低的特點,而雄激素造模的動物模型血清中睪酮明顯增高;但均能符合人類PCOS的表現(xiàn)。中醫(yī)根據(jù)腎虛、肝郁、脾虛等證候的特點已經(jīng)廣泛建立相應(yīng)的證候模型,但目前尚沒有與PCOS的直接關(guān)聯(lián)報道。目前,中醫(yī)藥在PCOS的預(yù)防和治療上發(fā)揮越來越重要的作用,因此有必要制造適合評價中醫(yī)藥療效的動物模型,而有關(guān)中西醫(yī)結(jié)合的PCOS動物模型尚未見報道。若能將中醫(yī)PCOS模型與現(xiàn)代醫(yī)學模型結(jié)合,比如利用組織特異性雄激素受體敲除結(jié)合中醫(yī)腎虛、脾虛和肝郁等特點分別造模或聯(lián)合造模,創(chuàng)建出既符合中醫(yī)證候又滿足現(xiàn)代醫(yī)學評價標準的PCOS動物模型,對于評價中醫(yī)藥治療PCOS的療效和推進相關(guān)研究將有重要的作用。