殷小冬 李其勝 賈艷艷 楊文飛 杜小鳳 文廷剛 顧大路

摘 要 通過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)研究了巨大芽孢桿菌ACCC 02979的促生指標(biāo)及其對(duì)小麥種子發(fā)芽的影響。結(jié)果表明，巨大芽孢桿菌可同時(shí)利用無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷，培養(yǎng)液中可溶性磷含量分別為66.59 mg·L-1和

0.26 mg·L-1，另外其產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力為3.13 mg·L-1。巨大芽孢桿菌發(fā)酵液及其稀釋液對(duì)小麥種子發(fā)芽率具有積極的作用，其中T2、T3和T5處理（菌株發(fā)酵液與水體積比分別為1∶20、1∶30、1∶50）的小麥種子發(fā)芽率最高，相較于對(duì)照均提高了11.8%。該菌株為一株促生菌，可應(yīng)用于微生物肥料的研發(fā)。

關(guān)鍵詞 巨大芽孢桿菌；有機(jī)磷；無(wú)機(jī)磷；吲哚乙酸

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.02.065

植物促生菌是指能夠活化土壤營(yíng)養(yǎng)元素，如固氮、解磷和解鉀，或者產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸（IAA）等植物激素的一類(lèi)細(xì)菌，主要包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、布克霍爾德氏菌屬等[1]。這些細(xì)菌在提升土壤肥力、改善土壤理化性狀，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。邢嘉韻等研究了不同比例巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的混合菌劑對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，混合菌劑提高了馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片的光合作用能力及抗氧化酶活性，收獲期的水分利用率和土壤中的微生物數(shù)量都有顯著提高[4]。 聶振等從南方水稻土中篩選到366株解磷菌，其中一種菌解磷含量高達(dá)147.3 mg·L-1，能利用多種碳源和氮源，具有改善土壤退化的潛力[5]。陳巖巖等從板栗的根際土壤中篩選高效解磷促生菌，篩選到P6菌株的解磷量為75.98 mg·L-1。在其后的盆栽試驗(yàn)中接種該菌株，結(jié)果表明土壤中堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均比對(duì)照提高145%以上，板栗的株高、莖粗均有所提高，植物體內(nèi)的含磷量比對(duì)照提高了50%[6]。

巨大芽孢桿菌是一類(lèi)重要的促生菌，在土壤元素活化，鹽堿土改良，植物抗病、抗寒、抗旱，微生物肥料研發(fā)等方面發(fā)揮著重要作用，且其對(duì)人畜無(wú)害，具有重要的利用價(jià)值。為探究巨大芽孢桿菌的應(yīng)用效果，筆者從中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)了一株巨大芽孢桿菌，研究其促生特性及其對(duì)小麥種子發(fā)芽的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗(yàn)菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium de?Bary），采購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC），菌株編號(hào)為ACCC 02979。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

2）無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基。葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O

0.3 g，MnSO4·4H2O ?0.03 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水1 000 mL，

pH值為7.0～7.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

3）有機(jī)磷培養(yǎng)基。葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O?0.3 g，MnSO4·4H2O ?0.03 g，卵磷脂0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 供試小麥

小麥品種為淮麥20。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）功能測(cè)定

將菌株分別接種于50 mL含有L-色氨酸（100 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1、30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d。吸取5 mL菌液于離心管，6 000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液并加入2 mL

的SalkowskiS顯色劑于5 mL離心管中，避光靜置30 min，出現(xiàn)粉紅色為陽(yáng)性，說(shuō)明有IAA產(chǎn)生，以未接種菌株的培養(yǎng)液為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定其OD530值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算單位體積發(fā)酵液中IAA的含量。

1.2.2 解磷能力測(cè)定

從保存培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌種接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃活化培養(yǎng)24 h。按2%接種量分別裝入裝有50 mL蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基和蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以接入相同接種量培養(yǎng)基空白為對(duì)照，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d。吸取10 mL發(fā)酵液到離心管中，5 000 r·min-1離心10 min。吸取上清液5 mL于50 mL容量瓶中，用水稀釋至20 mL，緩緩加入2，6-二硝基酚指示劑2～3滴，之后滴加氫氧化鈉溶液或稀硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH，調(diào)節(jié)至溶液顏色剛呈微黃色。加入鉬銻抗顯色劑5 mL，搖勻之后用蒸餾水定容。在室溫下放置30 min后在700 nm處用分光光度計(jì)比色，以空白作為對(duì)照。

1.2.3 小麥種子發(fā)芽試驗(yàn)

從保存培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到LB固體平板培養(yǎng)基中，在30 ℃環(huán)境中活化48 h。待其長(zhǎng)出單菌落后，用鑷子夾住100 ?L黃槍頭挑取單菌落放入裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30 ℃、180 r·min-1環(huán)境中培養(yǎng)72 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不加菌的液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。待其OD值為0.8～1.0，吸取1 mL液體轉(zhuǎn)移到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，30 ℃，180 r·min-1環(huán)境中培養(yǎng)48 h。將巨大芽孢桿菌菌株發(fā)酵液與無(wú)菌水分別按照1∶0，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，0∶1的體積比配制成7個(gè)濃度，分別記為T(mén)0、T1、T2、T3、T4、T5、CK2，同時(shí)設(shè)置LB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，為CK1，共計(jì)8個(gè)處理。將小麥種子用75%乙醇消毒3 min，1%次氯酸鈉消毒10～15 min。將小麥種子用不同濃度的發(fā)酵液浸泡24 h。在培養(yǎng)皿上放2層濾紙，加入15 mL無(wú)菌水潤(rùn)濕，放入28℃培養(yǎng)箱中，24 h后測(cè)定種子發(fā)芽率，持續(xù)測(cè)定7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌的促生特性

如表1所示，巨大芽孢桿菌在解有機(jī)磷及無(wú)機(jī)磷方面均存在一定的積極作用，其中解無(wú)機(jī)磷的能力較強(qiáng)，對(duì)磷酸三鈣的解磷能力達(dá)到66.59 mg·L-1，而對(duì)以卵磷脂為主要有機(jī)磷源的分解能力不強(qiáng)。巨大芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中也會(huì)分泌一定量的IAA，達(dá)到3.13 mg·L-1。

2.2 巨大芽孢桿菌對(duì)小麥種子發(fā)芽的影響

如表2所示，巨大芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)小麥種子發(fā)芽存在一定的促進(jìn)作用。在沒(méi)有稀釋的情況下，在發(fā)酵液里浸泡的小麥種子第4 d發(fā)芽率達(dá)到90.0%，比對(duì)照提升了5.8%。隨著發(fā)酵液的稀釋比例的擴(kuò)大，小麥種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)出不同的變化。當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵液稀釋10倍時(shí)，小麥種子發(fā)芽率最低。當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍、30倍和50倍時(shí)，小麥種子發(fā)芽率達(dá)到最大，為95%。

3 結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌是一種應(yīng)用廣泛的植物有益菌，對(duì)環(huán)境安全無(wú)害，因此長(zhǎng)期受到廣泛關(guān)注。巨大芽孢桿菌的促生作用主要體現(xiàn)在它的解磷作用。磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，是植物體內(nèi)核酸、ATP、植素、輔酶等物質(zhì)的組成部分。磷元素還能通過(guò)提高植物體內(nèi)可溶性糖和磷脂的含量增強(qiáng)植物自身的抗寒能力[7-8]。

土壤中的磷元素大多數(shù)以難溶性磷的形式存在，植物不能直接吸收利用。而巨大芽孢桿菌的分泌物中含有蘋(píng)果酸、酒石酸、草酸等有機(jī)酸，可以降低土壤pH值并與Ca、Fe、Al等金屬離子發(fā)生螯合作用，將土壤中的磷元素釋放出來(lái)供植物吸收利用。本試驗(yàn)中巨大芽孢桿菌降解無(wú)機(jī)磷的能力較強(qiáng)，在土壤中可降解無(wú)機(jī)磷釋放速效養(yǎng)分。吲哚乙酸（IAA）是植物體內(nèi)存在的一種天然激素，能夠促進(jìn)種子發(fā)芽和不定根的形成，促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)。1979年，科研人員發(fā)現(xiàn)巴西固氮螺菌可以分泌IAA。此后，大量科研人員加強(qiáng)了對(duì)產(chǎn)IAA菌的篩選。我國(guó)科研人員在鹽堿地、黃棕壤、潮土等各類(lèi)土壤中也篩選出許多產(chǎn)IAA的細(xì)菌。在本實(shí)驗(yàn)中，巨大芽孢桿菌具有一定的產(chǎn)IAA能力，且對(duì)小麥種子發(fā)芽也存在一定的促進(jìn)作用。

本研究中的巨大芽孢桿菌在生物有機(jī)肥方面表現(xiàn)出巨大的潛力，是生物有機(jī)肥的主要菌種來(lái)源。將巨大芽孢桿菌與秸稈、菇渣等農(nóng)林廢棄物發(fā)酵成生物有機(jī)肥，在田間施用含巨大芽孢桿菌的生物有機(jī)肥的過(guò)程中，生物有機(jī)肥逐漸發(fā)生礦化，陰離子脫羧基化并逐漸釋放出大量堿性物質(zhì)，同時(shí)本身含有的堿性離子可以與土壤中的H+結(jié)合，可以弱化酸性土壤，提高其pH值。因此，含巨大芽孢桿菌的生物有機(jī)肥可以配施土壤改良劑從而改善酸性土壤的理化性質(zhì)，避免土壤酸化進(jìn)一步加劇。生物有機(jī)肥含有的芽孢桿菌是有益微生物，一方面它可以加快土壤氮磷鉀等元素的礦化過(guò)程，增強(qiáng)蛋白酶、脲酶、酸性磷酸酶的活性，進(jìn)一步提高土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷和速效鉀的含量；另一方面它能夠定殖在作物根系表面，刺激根系生長(zhǎng)，提高根尖數(shù)、根系表面積、根系體積等指標(biāo)，從而提高植物養(yǎng)分吸收能力。巨大芽孢桿菌生物有機(jī)肥同樣也能與生物炭進(jìn)行復(fù)配。生物炭炭化后具有多微孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，其多孔結(jié)構(gòu)有益于微生物存活，所以?xún)烧呖梢孕纬苫パa(bǔ)結(jié)構(gòu)，微生物依賴(lài)于生物炭在土壤養(yǎng)分利用和作物生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要功效。在育苗基質(zhì)中添加生物炭和菌肥，其蔗糖酶和過(guò)氧化氫酶活性提高，有效提高基質(zhì)中微生物數(shù)量和活性，提高基質(zhì)對(duì)有害因子的抵御能力。生物炭和菌肥復(fù)配可以降低基質(zhì)容重，增加基質(zhì)總孔隙度，提高基質(zhì)透氣性。另外，由于生物炭化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定不易分解，可以長(zhǎng)期作為肥料的載體，緩慢吸收釋放養(yǎng)分，提高作物肥料利用率。生物炭和菌肥復(fù)配處理下基質(zhì)中的有機(jī)碳、堿解氮、酶活性提高，葉綠素含量增加，有效提高光合作用，進(jìn)一步提高其生物量。

本研究通過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)研究了巨大芽孢桿菌的解磷特性和產(chǎn)IAA能力，在應(yīng)用方面也進(jìn)行了一些研究。研究表明，該巨大芽孢桿菌具有較強(qiáng)的解無(wú)機(jī)磷能力，可以產(chǎn)生一定量的IAA，對(duì)小麥種子發(fā)芽率具有積極作用，在土壤改良、促進(jìn)植物生長(zhǎng)及微生物肥料方面表現(xiàn)出一定的潛力。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）