周志東,王曉瑜,張 同,李 琪,楊之帆,陳 俊

(1. 武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢,430081;2. 湖北大學(xué)省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢,430062)

蘋果酸是一種四碳二羧酸,被廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[1],常用的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、固定化酶催化法及發(fā)酵法等?；瘜W(xué)合成法是將苯或丁烷在高溫高壓下氧化后再利用馬來酸的水合作用產(chǎn)生D-蘋果酸和L-蘋果酸外消旋混合物[2],其中L-蘋果酸存在于從細(xì)菌到人類的所有生物體中,而D-蘋果酸在自然界中很少見且難以被人體吸收利用,故被禁止添加至嬰幼兒及老年人食品中。酶催化法是利用固定化的富馬酸酶或表達(dá)富馬酸酶的全細(xì)胞,以富馬酸為底物催化產(chǎn)生L-蘋果酸[3],使用該法雖可獲得單一的L-蘋果酸,但富馬酸酶的純化成本較高,另外,產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸與反應(yīng)殘留的底物富馬酸較難分離,所得L-蘋果酸純度不高。近年來,利用基因工程菌發(fā)酵已成為獲取L-蘋果酸的重要途徑[4]。將來自解甘露醇羅爾斯頓菌的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶導(dǎo)入pta突變型的大腸桿菌菌株WGS-10,經(jīng)12 h好氧發(fā)酵后,所得L-蘋果酸產(chǎn)量可達(dá)9.25 g/L[5]。除此之外,利用蘋果酸酶催化丙酮酸也可以生成蘋果酸。不過,丙酮酸是多種代謝途徑的關(guān)鍵底物,將其轉(zhuǎn)化為蘋果酸并非易事。Dong等[6]通過敲除大腸桿菌W3110的ldhA、poxB、pflB、pta及ackA等基因來阻斷丙酮酸的旁路消耗,再輔以蘋果酸酶的過表達(dá),所得蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到21.7 g/L。本課題組[7]敲除大腸桿菌MG1655的poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB以及pfkA等基因后,將所得工程菌株搖瓶發(fā)酵48 h,相應(yīng)L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到9.893 g/L。利用基因敲除或過表達(dá)構(gòu)建多基因的從頭合成途徑時(shí),常面臨中間產(chǎn)物的快速擴(kuò)散和降解、對(duì)宿主細(xì)胞的毒害以及底物利用率低等問題,最終導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量降低[8]。已有研究表明,通過模仿自然代謝控制機(jī)制,將途徑酶共定位,在空間上形成多酶復(fù)合體,提高代謝物的局部濃度,在多酶復(fù)合體內(nèi)形成底物通道,能減少底物在不同活性位點(diǎn)間的擴(kuò)散距離,將代謝通量引向目標(biāo)通路從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率[9-13]。Dueber等[14]直接截取后生動(dòng)物信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用域并融合表達(dá)后構(gòu)建了一種(GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z蛋白支架體系,通過優(yōu)化蛋白支架中配體的比例、順序以及酶的化學(xué)計(jì)量數(shù),將最終產(chǎn)物滴度提高了77倍。Liu等[15]利用纖維素小體,將3種NAD+依賴性的脫氫酶于酵母表面組裝來實(shí)現(xiàn)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),以甲醇作為底物所得NADH的最終產(chǎn)率達(dá)到了組裝前相應(yīng)值的5.1倍。Ji等[16]利用相互作用的蛋白PDZ和PDZ ligand將黃岑素和野黃岑素合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵途徑酶進(jìn)行自組裝,目標(biāo)產(chǎn)物最終滴度分別提高了6.6和1.4倍。有鑒于此,本文選取遺傳背景清楚且易于進(jìn)行分子操作的大腸桿菌MG1655,借助RIAD-RIDD人工蛋白支架,將L-蘋果酸生成途徑關(guān)鍵酶Pykf和maeB進(jìn)行共定位以形成酶復(fù)合體,再通過丙酮酸的積累來實(shí)現(xiàn)maeB的逆向催化,進(jìn)而提高L-蘋果酸的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、引物及儀器和試劑

大腸桿菌 DH5α、大腸桿菌 MG1655(DE3)和大腸桿菌 BL21(DE3)購于武漢力博瑞生物科技有限公司,載有熒光報(bào)告蛋白的支架片段以及N端或C端帶有支架蛋白標(biāo)簽的目的基因片段由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,質(zhì)粒載體pET-23a和PRSFDuet-1為本實(shí)驗(yàn)室保存,構(gòu)建載體所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本研究所用菌株、質(zhì)粒以及引物分別列于表1及表2,所用主要儀器有:Bio-Rad C1000型PCR儀,Sigma 1-14K型高速冷凍離心機(jī),D-30M型高壓細(xì)胞破碎儀,C006169(5 ml)和C006197(20 ml)重力型蛋白純化空柱,Milipore超濾管,P680型高效液相色譜儀;主要試劑有:牛血清白蛋白,購自武漢天源生物技術(shù)有限公司,PIPES,購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,卡那霉素、壯觀霉素,購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司,DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、2×ESTaqMaster Mix,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品,購自Sigma公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 引物

1.2 酶支架系統(tǒng)的驗(yàn)證

1.2.1 熒光蛋白基因的裝配

將紅色熒光蛋白mCherry和綠色熒光蛋白sfGFP分別與RIDD和RIAD的C端融合并裝配于載體pET23a上,構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒pET23a-RIAD-sfGFP和pET23a-RIDD-mCherry,sfGFP蛋白和mCherry蛋白靠近時(shí)會(huì)發(fā)出橙色熒光,由此判斷RIAD-RIDD蛋白支架系統(tǒng)的結(jié)合情況[17]。

1.2.2 熒光蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的熒光報(bào)告質(zhì)粒pET23a-RIDD-mCherry和pET23a-RIAD-sfGFP分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中,相應(yīng)得到菌株BL21(DE3)- RIDD-mCherry、BL21(DE3)- RIAD-sfGFP,于新鮮平板上分別挑取單菌落接種至5 mL氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下以200 r/min轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng),之后再以1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL相同氨芐青霉素濃度的LB液體培養(yǎng)基中,待OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG并在18 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)16～18 h,待誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體并置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 重組蛋白的純化

將充分誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后離心收集的大腸桿菌 BL21(DE3)-RIDD-mCherry、BL21(DE3)- RIAD-sfGFP菌體從冰箱取出并解凍,利用20 mL PBS緩沖液充分重懸后加入200 μL PMSF(0.01 mol/L)蛋白酶抑制劑,使用高壓細(xì)胞破碎儀充分破碎細(xì)胞釋放蛋白并收集上清液,將上清液移至重力柱中,再利用含有不同梯度濃度咪唑的PBS緩沖液洗脫后分別收集流出液,將純度較高的流出液組分移至相應(yīng)規(guī)格的超濾管中來進(jìn)一步純化濃縮目的蛋白。測定蛋白濃度后將其分裝至1.5 mL EP管中,經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.3 工程菌中目的基因的組裝

在丙酮酸激酶Pykf的C端和蘋果酸酶maeB的N端分別添加RIAD和RIDD肽段標(biāo)簽合成RIAD-Pykf和RIDD-maeB后克隆至pET-23a載體上,所構(gòu)建的載體依次為pET23a-Pykf-RIAD、pET23a-RIDD-maeB。借助特異性引物RSF-Pykf-RIAD-F/R,以質(zhì)粒pET23a-Pykf-RIAD為模板,擴(kuò)增獲得Pykf-RIAD片段;利用MCS2-RIDD-maeB-F/R引物,以質(zhì)粒pET23a-RIDD-maeB為模板,擴(kuò)增獲得RIDD-maeB片段。再以大腸桿菌 MG1655(DE3)基因組DNA為模板,分別使用引物RSF-Pykf-F/R、MCS2-maeB-F/R擴(kuò)增相應(yīng)的片段Pykf和maeB來構(gòu)建無組裝能力的對(duì)照組。圖1所示為重組質(zhì)粒pRSFDuet-Pykf-RIAD-RIDD-maeB的具體構(gòu)建過程,其關(guān)鍵在于將目的片段Pykf-RIAD和RIDD-maeB依次裝載到質(zhì)粒pRSFDuet-1的第一和第二個(gè)MCS。按同樣方法構(gòu)建pRSFDuet-Pykf-maeB、pRSFDuet-Pykf-RIDD-maeB以及pRSFDuet-Pykf-RIAD-maeB等重組質(zhì)粒。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件

配制卡那霉素濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基。將構(gòu)建成功的表達(dá)載體PRSFDuet-Pykf-RIAD-RIDD-maeB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 MG1655(DE3)得到工程菌株MG3,挑取單菌落接種至5 mL 的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃下培養(yǎng)過夜,再以1%的比例將種子液接種至200 mL的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃下培養(yǎng),待菌液OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí),取出一部分菌液分為若干組并加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG后分別于18、28、30、37 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)培養(yǎng)16～18 h,待誘導(dǎo)結(jié)束后破胞,使用SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況,以此確定重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度。同時(shí),將另一部分OD600達(dá)到0.8～1.0的菌液仍分為若干組,分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG,并轉(zhuǎn)移至30 ℃的恒溫?fù)u床以200 r/min的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)培養(yǎng)16～18 h,待誘導(dǎo)結(jié)束后破胞,使用SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況,以此確定重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)劑IPTG最佳濃度。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

確定最佳的培養(yǎng)溫度和IPTG誘導(dǎo)劑濃度后,進(jìn)行重組蛋白Pykf和maeB的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測,具體步驟參照熒光蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白的純化。

1.6 工程菌株搖瓶發(fā)酵及檢測

本研究采用好氧發(fā)酵方式。取出凍存的工程菌株,在添加了相應(yīng)抗性的LB平板上劃線,挑取單菌落接種于50 mL、卡那霉素濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng),之后再以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL、卡那霉素濃度為50 μg/mL、葡萄糖濃度為20 g/L的LBG液體培養(yǎng)基中,于37 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期,待OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí),加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG并轉(zhuǎn)移至30 ℃恒溫?fù)u床以200 r/min的轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)48 h,期間每隔6 h取出2 mL菌液,借助液相色譜儀檢測其中的有機(jī)酸,分析條件如下:色譜柱為AcclaimTM120C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為0.02 mol/L的KH2PO4,用H3PO4調(diào)節(jié)液體pH為2.8,進(jìn)樣量為20 μL,紫外檢測波長為210 nm,流速為0.5 mL/min,柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光蛋白的SDS-PAGE檢測

熒光蛋白R(shí)IAD-sfGFP和RIDD-mCherry的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖2所示,其中,泳道1為流穿液,泳道2和泳道3為10 mmol/L的咪唑洗脫液,泳道4和泳道5為30 mmol/L的咪唑洗脫液,泳道6和泳道7為50 mmol/L的咪唑洗脫液,泳道8為100 mmol/L的咪唑洗脫液,泳道9為300 mmol/L的咪唑洗脫液,箭頭指示目標(biāo)蛋白條帶。由圖2(a)可知,熒光蛋白R(shí)IAD-sfGFP的誘導(dǎo)表達(dá)效果較好,當(dāng)咪唑洗脫液濃度為30～100 mmol/L時(shí)(泳道4至泳道8),目標(biāo)蛋白條帶較單一,可以在此范圍內(nèi)收集蛋白;由圖2(b)可知,熒光蛋白R(shí)IDD-mCherry的誘導(dǎo)表達(dá)效果也較好,在咪唑洗脫液濃度30～300 mmol/L范圍內(nèi)(泳道4至泳道9),均能獲得較單一的目標(biāo)蛋白條帶,可在此范圍內(nèi)收集蛋白。

(a)RIAD-sfGFP

(b)RIDD-mCherry

2.2 蛋白支架功能完整性驗(yàn)證

將純化的RIAD-sfGFP和RIDD-mCherry蛋白適當(dāng)稀釋,在25 ℃水浴鍋中孵育30 min后分別取RIAD-sfGFP、 RIAD- mCherry以及二者的混合樣品各600 μL于藍(lán)光儀下觀察,結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,1號(hào)管中的RIDD-mCherry樣品發(fā)出紅色熒光,3號(hào)管中的RIAD-sfGFP樣品發(fā)出綠色熒光,而2號(hào)管中RIDD-mCherry與RIAD-sfGFP的混合樣品則發(fā)出橙色熒光,這表明,經(jīng)體外孵育后,sfGFP和mCherry蛋白可通過蛋白支架RIAD和RIDD結(jié)合在一起,形成呈現(xiàn)橙色熒光的蛋白支架復(fù)合物RIAD-sfGFP-RIDD-mCherry。

圖3 RIAD和RIDD的功能完整性驗(yàn)證

2.3 RIAD-sfGFP和RIDD-mCherry蛋白的互作驗(yàn)證

利用Native-PAGE檢測RIAD-sfGFP蛋白和RIDD-mCherry的蛋白互作情況,結(jié)果如圖4所示,其中泳道1為RIAD-sfGFP蛋白,泳道2為RIDD-mCherry蛋白,泳道3為二者復(fù)合體。從圖4中可見,泳道2中RIDD-mCherry蛋白的尺寸增倍,這是因RIDD在近生理?xiàng)l件下極易形成二聚體所致。泳道3中RIAD-sfGFP蛋白與RIDD-mCherry蛋白的混合孵育物在Native-PAGE上遷移最慢,表明二者形成了蛋白復(fù)合體,這也再次證明RIAD-sfGFP蛋白和RIDD-mCherry蛋白確實(shí)存在相互作用。

圖4 RIAD-sfGFP和RIDD-mCherry蛋白的Native-PAGE檢測

2.4 重組載體的PCR鑒定

圖5所示為重組載體的PCR檢測結(jié)果。在圖5(a)中,泳道1和泳道2分別以PRSFDuet-Pykf和PRSFDuet-Pykf-RIAD載體為模板,所用引物均為Duet-UP-1和Duet-Down-1;在圖5(b)中,泳道1和泳道2均以載體PRSFDuet-Pykf-maeB為模板,所用引物分別為Duet-UP-1、T7 Terminator Primer和 DuetUP2 Primer、Terminator Primer,泳道3和泳道4均以載體PRSFDuet-Pykf-RIDD-maeB為模板,所用引物分別為Duet-UP-1、T7 Terminator Primer和 DuetUP2 Primer、Terminator Primer;在圖5(c)中,泳道1和泳道2均以載體PRSFDuet-Pykf-RIAD-maeB為模板,所用引物分別為Duet-UP-1、T7 Terminator Primer和 DuetUP2 Primer、Terminator Primer,泳道3和泳道4均以載體PRSFDuet-Pykf-RIAD-RIDD-maeB為模板,所用引物分別為Duet-UP-1、T7 Terminator Primer和DuetUP2 Primer、Terminator Primer PCR。根據(jù)PCR檢測結(jié)果可知,所有擴(kuò)增的片段大小均符合預(yù)期,表明相應(yīng)的目的基因已成功克隆至PRSFDuet-1載體,經(jīng)測序驗(yàn)證全部正確。

(a)PRSFDuet-Pykf及PRSFDuet-Pykf-RIAD (b)PRSFDuet-Pykf-maeB及PRSFDuet-Pykf-RIDD-maeB (c)PRSFDuet-Pykf-RIAD-maeB及PRSFDuet-Pykf-RIAD-RIDD-maeB

2.5 重組蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化

在不同溫度下誘導(dǎo)后,重組蛋白表達(dá)情況的檢測結(jié)果如圖6所示,其中,圖6(a)中的泳道1和泳道2分別為重組蛋白于18 ℃誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道3和泳道4分別為重組蛋白于28 ℃誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,圖6(b)中的泳道1為未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌體,泳道2和泳道3分別為重組蛋白于30 ℃誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道4和泳道5分別為重組蛋白于37 ℃誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,箭頭指示目標(biāo)蛋白條帶。由檢測結(jié)果可知,重組蛋白于18 ℃或30 ℃下誘導(dǎo)后的表達(dá)量較好,考慮到重組菌株MG3后期發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)菌體生長速度及產(chǎn)酸的影響,最終確定重組蛋白誘導(dǎo)溫度為30 ℃。

(a)18、28 ℃ (b)30、37 ℃

經(jīng)不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)后,重組蛋白表達(dá)情況的檢測結(jié)果如圖7所示,其中泳道1為未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌體,泳道2和泳道3分別為重組蛋白經(jīng)0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道4和泳道5分別為重組蛋白經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道6和泳道7分別為重組蛋白經(jīng)0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道8和泳道9分別為重組蛋白經(jīng)0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道10和泳道11分別為重組蛋白經(jīng)1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,泳道12和泳道13分別為重組蛋白經(jīng)1.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)所得全菌體及破菌上清液,箭頭指示目標(biāo)蛋白條帶。由檢測結(jié)果可知,目的蛋白表達(dá)量隨著IPTG濃度的提高而逐漸減少,考慮到高濃度的IPTG會(huì)毒害菌體,而采用較低濃度的IPTG能適當(dāng)延長轉(zhuǎn)錄過程,有利于可溶性蛋白的表達(dá)[18],所以最終確定IPTG的濃度為0.2 mmol/L。

圖8 重組蛋白Pykf-RIAD和RIDD-maeB的Native-PAGE檢測

2.6 重組蛋白Pykf-RIAD和RIDD-maeB的互作驗(yàn)證

利用Native-PAGE檢測重組蛋白Pykf-RIAD和RIDD-maeB的互作情況,結(jié)果如圖8所示,其中,泳道1為經(jīng)過純化處理的Pykf-RIAD-RIDD-maeB蛋白樣品,泳道2為流穿液經(jīng)煮樣處理后的蛋白樣品,箭頭指示目標(biāo)蛋白條帶。由圖8可見,泳道2中的流穿液經(jīng)高溫處理后,蛋白支架間的結(jié)合作用解除,形成兩條單一的條帶分別對(duì)應(yīng)RIDD-maeB和Pykf-RIAD蛋白,通過與泳道1中的Pykf-RIAD-RIDD-maeB蛋白復(fù)合物檢測結(jié)果對(duì)比可知,重組蛋白maeB和Pykf在胞內(nèi)表達(dá)后,能夠通過蛋白支架RIDD和RIAD發(fā)生互作,形成Pykf-RIAD-RIDD-maeB蛋白復(fù)合物。

2.7 工程菌株發(fā)酵及產(chǎn)物檢測

菌株MG1、MG2和MG3的發(fā)酵生長情況及產(chǎn)酸量檢測結(jié)果分別如圖9和圖10所示,其中MG1為轉(zhuǎn)入空載體PRSFDuet-1的大腸桿菌 MG1655(DE3)菌株,MG2為轉(zhuǎn)入載體PRSFDuet-Pykf-maeB的大腸桿菌 MG1655(DE3)菌株,MG3為轉(zhuǎn)入載體PRSFDuet-Pykf-RIAD-RIDD-maeB的大腸桿菌 MG1655菌株。從圖9中可以看出,三組菌株的生長速度以MG3為最快,MG2次之,MG1最慢且與前兩者差距較大。由圖10可見,經(jīng)過48 h搖瓶發(fā)酵,MG1菌株的L-蘋果酸積累量極低,MG2菌株的L-蘋果酸積累量也僅為0.4886 g/L,而MG3菌株的相應(yīng)值則高達(dá)2.4012 g/L,同時(shí),其丙酮酸積累量也達(dá)到了1.1342 g/L,明顯高于菌株MG2(0.6409 g/L)與MG1(0.1290 g/L)的相應(yīng)值,檢測結(jié)果表明,借助蛋白支架實(shí)現(xiàn)Pykf和maeB共定位后,所形成的底物通道可有效促進(jìn)PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸,胞內(nèi)丙酮酸不斷積累有助于實(shí)現(xiàn)蘋果酸酶的逆向催化,從而大幅提高了L-蘋果酸的產(chǎn)量。

圖9 菌株的生長曲線

圖10 發(fā)酵液中的有機(jī)酸檢測

2.8 單一支架標(biāo)簽對(duì)工程菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

構(gòu)建重組菌株MG4(PRSFDuet-Pykf-RIAD-maeB)和MG5(PRSFDuet-Pykf-RIDD-maeB),以MG2(PRSFDuet-Pykf-maeB)為對(duì)照菌株,對(duì)三組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),相應(yīng)的生長情況及發(fā)酵48 h的產(chǎn)酸量檢測結(jié)果如圖11所示。由圖11可見,三組菌株的生長情況及蘋果酸產(chǎn)量差別不大,表明單一蛋白支架標(biāo)簽對(duì)菌株生長速度和產(chǎn)酸的影響較小,這也再次證實(shí),MG3菌株快速生長且L-蘋果酸產(chǎn)量大幅提高是Pykf和maeB共定位的結(jié)果,得益于蛋白支架RIAD、RIDD的相互作用。

(a)菌株的生長

3 結(jié)語

為了在L-蘋果酸與丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化中逆向催化丙酮酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸,進(jìn)而積累目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸,本研究采用RIAD和RIDD蛋白支架將L-蘋果酸合成途徑中的關(guān)鍵酶Pykf和maeB錨定在一起,形成底物通道以增加丙酮酸的積累,促使蘋果酸酶催化更多的丙酮酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。實(shí)際研究發(fā)現(xiàn),利用蛋白支架RIAD和RIDD將Pykf與maeB共定位(Pykf-RIAD-RIDD-maeB)形成復(fù)合物并導(dǎo)入大腸桿菌MG1655后,所得重組菌株生長速度明顯加快、L-蘋果酸積累量大幅提高,這應(yīng)歸因于積累的丙酮酸直接被引往生成L-蘋果酸的方向,減少了副產(chǎn)物如乙酸、乳酸等的產(chǎn)量,避免過多地消耗胞內(nèi)還原力,從而使菌株生長速度加快,同時(shí),蘋果酸酶在催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸時(shí)還可能伴隨著NAD(P)H的生成,蛋白支架的引入使該反應(yīng)過程加快,因此在胞內(nèi)產(chǎn)生更多的NAD(P)H,進(jìn)一步導(dǎo)致菌株生長加速,在菌株生長加速以及蛋白支架將酶共定位加速催化逆向反應(yīng)的雙重作用下,重組菌株的L-蘋果酸產(chǎn)量大幅增加,這對(duì)于構(gòu)建高產(chǎn)量的L-蘋果酸工程菌株具有一定的參考價(jià)值。