黃上書，羅宇琴，宋葉，范耀耀，雷欣荷，2，李國衛(wèi)，陳向東

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室/廣東（?。┙逃龔d高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

牛膝和川牛膝為我國常用中藥，均有補(bǔ)益肝腎和行瘀達(dá)下的功效，其中牛膝以補(bǔ)益肝腎為主，而川牛膝以行瘀達(dá)下為主，臨床上需區(qū)別使用[1-2]。兩者藥材差異明顯，均能通過性狀、顯微鑒別[3-5]、理化鑒別[6]、指紋圖譜如紅外光譜法或X 射線衍射法[7]等進(jìn)行區(qū)分。牛膝、川牛膝配方顆粒分別由牛膝Achyranthes bidentataBl.、川牛膝Cyathula of‐ficinalisKuan[3]飲片經(jīng)水提、濃縮、制粒等現(xiàn)代工藝制成，已不具備中藥飲片性狀、顯微特征[8-9]等，加之兩者化學(xué)成分類似，均以三萜皂苷類、甾酮類、糖類等成分為主，其紫外光譜和蛋白質(zhì)指紋圖譜也相似[7]，難以通過傳統(tǒng)鑒別方法進(jìn)行區(qū)分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，尚風(fēng)琴等[10]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）建立了兩者的指紋圖譜，通過圖譜的含量、結(jié)構(gòu)信息能夠區(qū)別牛膝和川牛膝藥材。孟虎彪等[11]報(bào)道了適用于配方顆粒的牛膝、川牛膝特異性PCR 鑒別方法，能進(jìn)行牛膝和川牛膝配方顆粒的特異性鑒別，但該法未能解決牛膝和川牛膝互相摻偽的問題。因牛膝和川牛膝的臨床適用差異較大，且兩者在外觀形態(tài)上相似，易被誤用[12]，特別是制成配方顆粒后，鑒別難度進(jìn)一步加大。因此，為進(jìn)一步完善質(zhì)量控制體系，需建立一種能夠快速同時(shí)鑒別牛膝和川牛膝配方顆粒的方法。

多重PCR 可同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)片段，可鑒別多個(gè)物種是否存在相互摻雜。該法已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如對(duì)石斛[13]、九里香[14]、海馬[15]等多基原中藥的鑒別，對(duì)蒼耳子[16]、重樓[17]、金錢白花蛇[18]、地龍[19]及其偽品的鑒別，以及對(duì)人參、三七、西洋參[20]等的摻雜檢測(cè)。本研究旨在建立一種能夠同時(shí)鑒別牛膝和川牛膝原料及配方顆粒的多重位點(diǎn)特異性PCR 鑒別方法，通過一次PCR 反應(yīng)即可對(duì)牛膝、川牛膝及其互相摻偽進(jìn)行鑒別。

1 材料

1.1 儀器

BioSpec-nano 紫外分光光度計(jì)（島津公司）；StepOne Real-time PCR 儀（Thermo Scientific公司）；ABI MiniAmp Plus 型PCR 儀（Thermo Scientific 公司），T100 PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試劑和試藥

2×Pfu PCR Master Mix DNA（批號(hào)：KP201）、2 ×Taq PCR Master Mix（批號(hào)：KT201）聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司，2×M5 Supper Fast‐Taq PCR Master Mix（批號(hào)：MF164）購自北京聚合美生物科技有限公司，Multiplex PCR 5×Master Mix（批號(hào)：M0284S）購自NEU ENGLAND Biolabs 公司；DNA Marker DL1000（批號(hào)：3591A）購自Takara公司；高效植物基因組DNA 提取試劑盒（批號(hào)：DP350）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 供試品

牛膝和川牛膝藥材各10批，來自河南、內(nèi)蒙古、河北、四川、重慶、湖北等不同地區(qū)；牛膝和川牛膝配方顆粒各10 批，均來自廣東一方制藥有限公司。藥材樣本經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任鑒定。樣本信息見表1。

表1 牛膝和川牛膝樣本信息表Table 1 Sample information of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[11]所選牛膝引物進(jìn)行研究，并下載NCBI數(shù)據(jù)庫的牛膝和川牛膝ITS序列，比對(duì)并篩選出兩者的SNP 位點(diǎn)，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)了川牛膝特異性鑒別引物。引物信息見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 牛膝和川牛膝特異性引物Table 2 Specific primers of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.2 DNA提取

2.2.1 牛膝和川牛膝藥材 取藥材細(xì)粉0.1 g，使用改良CTAB 法[11]提取總DNA，使用BioSpec-nano 測(cè)定DNA，調(diào)整濃度至100 ～300 ng/μL。

2.2.2 牛膝和川牛膝配方顆粒 取配方顆粒細(xì)粉0.3 g 于15 mL 離心管中，加入預(yù)熱的CTAB 沉淀液（2.0% 十六烷基三甲基溴化銨，100 mmol/L Tris-鹽酸pH 8.0，20 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉pH 8.0)5 mL，混勻，65 ℃水浴加熱1 h（期間混勻2～4次），離心，12 000 r/min，5 min，棄去上清液；再加入CTAB沉淀液5 mL，重復(fù)操作1次；沉淀置于新的2 mL離心管中，再使用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.3 單重引物特異性驗(yàn)證

分別對(duì)牛膝及川牛膝配方顆粒的特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證，其中牛膝參考文獻(xiàn)[11]條件，川牛膝PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×MightyAmp Buffer 12.5 μL，引物F/R 各0.3 μL，Mighty Amp（1.25 U/μL）0.3 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。待PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR 產(chǎn)物6 μL 經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)GelRed 顯色，最后于凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。其中牛膝特異性PCR 結(jié)果見圖1，川牛膝特異性PCR結(jié)果見圖2?？梢姡Ｏゼ按ㄅＯヌ禺愋訮CR 均在目標(biāo)條帶有單一的DNA目標(biāo)條帶，說明該方法特異性較好。

圖1 牛膝位點(diǎn)特異性PCR法樣品電泳圖Figure 1 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Achyranthes bidentata

圖2 川牛膝位點(diǎn)特異性PCR法樣品電泳圖Figure 2 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Cyathula officinalis

2.4 多重PCR條件考察

將牛膝及川牛膝確定的特異性PCR 引物組合進(jìn)行調(diào)試，通過單因素試驗(yàn)分別考察不同退火溫度、不同循環(huán)次數(shù)、不同引物量、不同PCR 儀及不同DNA 聚合酶對(duì)多重PCR 鑒別的影響。反應(yīng)體系25 μL：2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，川牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，滅菌超純水9.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)31次（95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s），最后72 ℃再延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)GelRed 預(yù)染的3%的瓊脂糖凝膠電泳，于成像儀觀察結(jié)果。

2.4.1 退火溫度 分別考察退火溫度為56、58、60 ℃時(shí)，對(duì)牛膝和川牛膝配方顆粒的鑒別影響，結(jié)果見圖3，牛膝和川牛膝分別獲得187 bp 和164 bp 的條帶，且陰性及空白無干擾，為保證方法的穩(wěn)定性，確定多重PCR退火溫度為58 ℃。

圖3 退火溫度及循環(huán)次數(shù)對(duì)牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 3 Effect of annealing temperature and cycles on identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

2.4.2 循環(huán)次數(shù) 當(dāng)循環(huán)次數(shù)為29～33 次時(shí)，牛膝及川牛膝均可獲得相應(yīng)的目標(biāo)條帶，見圖3，為保證方法的穩(wěn)定性，選擇31次循環(huán)。

2.4.3 引物量 分別考察牛膝和川牛膝引物量均為0.8、1.0、1.2 μL 時(shí)對(duì)多重PCR 的影響，結(jié)果見圖4，牛膝及川牛膝均可獲得相應(yīng)的目標(biāo)條帶，因此確定牛膝和川牛膝引物用量均為1.0 μL。

圖4 不同引物量及不同儀器對(duì)牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 4 Effect of different primers and instruments on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.4.4 PCR 儀 使用上述確定的PCR 方法在不同PCR 儀上考察方法的耐用性。結(jié)果見圖4，使用不同型號(hào)的PCR 儀，均能獲得正確的鑒別結(jié)果，由于多重PCR 對(duì)退火溫度較為敏感，應(yīng)對(duì)PCR 儀進(jìn)行溫度校正[19]。

2.4.5 DNA聚合酶體系 使用上述確定的PCR方法考察不同酶（2×Pfu PCR Master Mix、2×Taq PCR Master Mix、2×M5 Supper FastTaq PCR Master Mix、Multiplex PCR 5×Master Mix）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果見圖5，使用2×Pfu 酶能夠獲得正確的結(jié)果，因此選擇2×Pfu PCR Master Mix DNA聚合酶體系。

圖5 不同DNA聚合酶對(duì)牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 5 Effect of different DNA polymerases on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5 適用性與靈敏度試驗(yàn)

2.5.1 適用性考察 采用建立的方法對(duì)上述牛膝和川牛膝藥材及配方顆粒樣品進(jìn)行多重位點(diǎn)特異性鑒別，結(jié)果見圖6，牛膝供試品均可獲得187 bp 的特異性條帶，川牛膝供試品均可獲得164 bp 的特異性條帶，陰性及空白無干擾。

圖6 牛膝和川牛膝多重PCR鑒別適用性試驗(yàn)Figure 6 Applicability test of multiplex PCR for identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5.2 靈敏度考察 為考察方法的靈敏度，分別取牛膝及川牛膝藥材、牛膝及川牛膝配方顆粒DNA樣品以99∶1、95∶5、90∶10、80∶20、50∶50、20∶80、10∶90、5∶95、1∶99 比例混合，按“3.1”項(xiàng)下確定的方法進(jìn)行多重PCR 鑒定，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，在牛膝藥材中摻入1%川牛膝藥材，在川牛膝藥材中摻入5%牛膝藥材，均能明顯檢出；在牛膝配方顆粒中摻入50%川牛膝配方顆粒，在川牛膝配方顆粒中摻入10%牛膝配方顆粒，均能明顯檢出。

圖7 牛膝和川牛膝多重PCR鑒別摻偽檢測(cè)限考察Figure 7 Detection limit for adulteration of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

3 討論

本研究以配方顆粒的摻偽或混偽鑒別為目的，通過多重PCR 法建立了牛膝和川牛膝配方顆粒的鑒別體系，能有效地從藥材-配方顆粒進(jìn)行傳遞，保證從源頭到成品基原的準(zhǔn)確性。在DNA 提取考察中，牛膝和川牛膝配方顆粒均含有大量多糖，其水提取物黏性較大，且DNA提取過程中殘留的輔料可能對(duì)PCR 擴(kuò)增存在一定影響。本研究使用CTAB沉淀液進(jìn)行樣品的預(yù)處理，降低輔料干擾，再通過試劑盒或其他方法純化DNA，獲得的DNA 質(zhì)量較好。說明該方法適用于含多糖較高樣品的DNA提取。

建立的多重PCR 鑒別方法中牛膝和川牛膝分別可擴(kuò)增出187 bp 和164 bp 的特異性條帶，說明該方法的鑒定準(zhǔn)確率為100%，對(duì)牛膝藥材以及川牛膝藥材的最低檢測(cè)限為均為5%（6 ng），且在牛膝藥材中摻入1%川牛膝藥材，在川牛膝藥材中摻入5%牛膝藥材，均能明顯檢出，說明該方法能有效用于原料的控制。

此外，在牛膝配方顆粒中摻入50%川牛膝配方顆粒，在川牛膝配方顆粒中摻入10%牛膝配方顆粒，也均能明顯檢出。表明該方法對(duì)于牛膝或川牛膝配方顆粒的摻雜鑒定靈敏度均較低，可能與配方顆粒經(jīng)過加熱提取后大部分DNA 被破壞有關(guān)。此外，川牛膝藥材多重PCR 鑒別結(jié)果在400～700 bp 存在非特異性擴(kuò)增條帶，而單重特異性鑒別中僅164 bp 存在目標(biāo)條帶，說明兩者藥材多重PCR 方法中存在非特異性擴(kuò)增，但在配方顆粒中非特異性擴(kuò)增干擾較小，因此該法對(duì)配方顆粒的鑒別較好。本研究建立的牛膝和川牛膝配方顆粒多重PCR 鑒別方法能夠通過一次PCR 反應(yīng)即可對(duì)牛膝、川牛膝及其互相摻雜進(jìn)行鑒別，為牛膝和川牛膝配方顆粒的質(zhì)量控制提供了參考。