李小鳳,阮志華,石勇麗,武曉倩,韋 悠,萬麗軍,謝志勤,任紅玉,謝芝勛

(廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室/廣西獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,南寧 530001)

【研究意義】禽腺病毒(FADV)屬于腺病毒科腺病毒屬,可分為5種基因型(FADV-A～FADV-E)及12個血清型(1～7,8a,8b,9～11)[1-2]。1987年禽腺病毒疫病在巴基斯坦發(fā)生,隨后在世界各地暴發(fā)流行,傳播速度快且致死率高[3]。2015年我國山東暴發(fā)血清4型禽腺病毒疫病[4]。血清4型禽腺病毒(FAdV-4)主要攻擊3～6周齡肉雞,傳染率高,并引起嚴重的心包積水肝炎綜合征(HHS),其典型癥狀是肝臟腫脹、局部壞死且伴有點出血,心臟包囊腫大,內(nèi)含透明黃色液體,給家禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1],FAdV-4 的Ⅷ蛋白(Protein Ⅷ,pⅧ)屬于核衣殼蛋白,具有穩(wěn)定病毒粒子結(jié)構(gòu)的作用[5],但至今對有關(guān)FAdVs復(fù)制過程中pⅧ與宿主間的相互作用了解甚少。因此,從天然免疫視角探討FAdV-4 pⅧ對宿主天然免疫相關(guān)基因mRNA表達量的影響,明確pⅧ的作用及解析FAdV-4編碼蛋白與宿主天然免疫激活的關(guān)聯(lián)機制,對進一步闡釋FAdV-4致病機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】FAdV-4基因組由43～45 kb雙鏈DNA組成,編碼13個結(jié)構(gòu)蛋白和11個非結(jié)構(gòu)蛋白,這些蛋白參與子代腺病毒的衣殼形成、DNA組裝和成熟[6]。在FAdV-4編碼產(chǎn)物中,hexon蛋白具有中和表面抗原的功能,是血清分型的主要蛋白[7]。Penton蛋白可與細胞內(nèi)其他蛋白結(jié)合,而介導(dǎo)病毒進入細胞[8]。Fiber蛋白包括長纖突蛋白(fiber-1)和短纖突蛋白(fiber-2),其中,fiber-2具有良好的抗原性,可誘導(dǎo)保護性抗體產(chǎn)生,有效抵抗腺病毒感染[9],是疫苗研制和檢測試劑盒研發(fā)的首選蛋白[10]。100K蛋白協(xié)助hexon蛋白組裝折疊成三聚體結(jié)構(gòu),促使新的病毒粒子產(chǎn)生[11]。可見,FAdV-4編碼蛋白在影響病毒感染復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。宿主的先天免疫系統(tǒng)是抵御病原體的第一道防線,在細菌、病毒等病原微生物的病原體入侵時,宿主細胞表面的模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR)精確辨別病原體,并激活先天免疫系統(tǒng)發(fā)生級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)分泌細胞因子以抵抗病毒復(fù)制[12-14]。模式識別受體包括Toll樣受體(Toll-like receptors,如TLRS、TLR3、TLR5和TLR9)、RIG樣受體(RIG-I like receptors,如RIG-I和MDA5)和DNA受體(Deoxyribonucleic acid like receptors,如IFI16和cGAS-STING)等。其中,病原DNA被胞質(zhì)中的DNA感受器cGAS識別并結(jié)合,生成能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的2′,3′-cGAMP。2′,3′-cGAMP將上游接收到的信號傳遞給接頭蛋白STING。隨后STING招募TANK連接酶1(TBK1)[15-16],并使TBK1蛋白磷酸化,為干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)提供結(jié)合平臺,促使Ⅰ干擾素和細胞因子表達,進而抑制病毒復(fù)制[17];MDA5識別病毒RNA,激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,同時招募TBK1,促進IRF7磷酸化,活化的IRF7和NF-κB進入細胞核,誘導(dǎo)核內(nèi)干擾素和炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達,從而抑制病毒復(fù)制。蛋白是細胞生理功能的具體執(zhí)行者,通常以蛋白復(fù)合體或與核酸相互作用的形式發(fā)揮作用[18]。在病毒復(fù)制過程中,病毒蛋白與宿主蛋白間的相互作用對疾病產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起關(guān)鍵作用?！颈狙芯壳腥朦c】FAdV-4全病毒感染雞肝癌細胞(LMH)后可促進天然免疫相關(guān)基因表達,表明FAdV-4感染對宿主天然免疫具有調(diào)控作用[19-20],但FAdV-4 pⅧ是否參與調(diào)控宿主的天然免疫作用尚未清楚,需要進一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以pⅧ為研究對象,構(gòu)建pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染LMH細胞,利用實時熒光定量PCR檢測12種天然免疫因子的轉(zhuǎn)錄水平,探明FAdV-4 pⅧ和宿主天然免疫間的相互作用,為進一步闡釋FAdV-4感染致病機制和免疫應(yīng)答機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病毒與細胞:FAdV-4(FAdV-4-GX2019-010株)、LMH細胞和PEF1α-HA載體均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存提供。主要試劑及儀器:2×TransTaq-T PCR Super Mix、病毒DNA/RNA純化試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自全式金(北京)生物技術(shù)有限公司,T4DNA連接酶、EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司,DMEM/F12細胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國賽默飛世爾科技有限公司,Universal Genomic DNA Kit購自北京康為世紀生物科技公司,Gene JET RNA Purification Kit和2×SYBR Green Master Mix購自美國英杰生命技術(shù)公司;凝膠成像分析儀(型號Gel DocTMXR+)購自美國Bio-Rad公司,超微量分光光度計(型號NanoDrop2000)和實時熒光定量PCR儀(型號Quant Studio 5)購自美國賽默飛世爾科技公司,倒置熒光顯微鏡(型號ECLIPSETi2-U)購自日本Nikon公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室分離FAdV-4-GX2019-010株(登錄號MW439040)已測得的Ⅷ基因編碼區(qū)序列,利用Oligo 7.37軟件設(shè)計PCR擴增引物。上游引物為5′-ccg-gaattcGGATGAACCTCTTGAACGCCGCACCC-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點),下游引物為5′-cccggtaccTTAACCCTGCCAGAACACCGG-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點),引物委托深圳華大基因公司合成。

1.2.2Ⅷ基因編碼區(qū)序列PCR擴增 按照病毒DNA/RNA純化試劑盒說明對FAdV-4病毒液樣本進行DNA提取。以提取的DNA為模板對FAdV-4基因編碼區(qū)序列進行PCR擴增。反應(yīng)體系50 μL:2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL(引物濃度10 μmol/L),DNA模板3 μL,無核酸酶水18 μL。擴增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,進行34個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.3 pEF1α-HA-Ⅷ表達載體構(gòu)建 參照E.Z.N.A Gel Extration Kit試劑盒說明對目的片段進行膠回收,將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體于16 ℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的樣品送至深圳華大基因公司測序,測序正確的菌株按照Plasmid Mini Kit說明提取質(zhì)粒(重組克隆載體),置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。pEF1α-HA載體和重組克隆載體同時采用EcoRⅠ與KpnⅠ限制性內(nèi)切酶于37 ℃雙酶切4 h,切膠回收目的片段,并將二者16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒,將雙酶切及測序驗證均正確的重組表達質(zhì)粒命名為pEF1α-HA-Ⅷ。

1.2.4 pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細胞 按1×106個/mL的細胞數(shù)量接種LMH細胞于6孔細胞培養(yǎng)板,長至單層后棄掉培養(yǎng)基。將去內(nèi)毒素質(zhì)粒pEF1α-HA-Ⅷ(試驗組)和pEF1α-HA(對照組)按照Lipfectamine 3000 Transfection Kit試劑盒說明轉(zhuǎn)染LMH細胞(1 μg/孔),作用2 h,補加2 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),按試驗需求收集細胞樣品,每組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.5 Western blotting和間接免疫熒光驗證 重組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用4%脫脂乳室溫封閉4 h,分別加入1∶2000稀釋的HA標記小鼠源單克隆抗體,4 ℃過夜孵育,次日用PBST洗膜4次,再分別加入1∶2000稀釋的HRP標記山羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h,用PBST洗膜4次,用DAB增強型試劑顯色拍照。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細胞48 h后,棄除培養(yǎng)基,依次加入4%多聚甲醛、通透液(Triton X-100)和封閉液,500 μL/孔,每一種試劑單獨孵育15 min。棄除封閉液,按500 μL/孔加入HA標記小鼠源單克隆抗體(1∶500),4 ℃過夜孵育。棄除一抗,PBS洗3遍,按500 μL/孔加入FITC標記兔抗鼠二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h。棄除二抗,PBS洗3遍,用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 實時熒光定量PCR測定天然免疫基因 參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說明進行RNA抽提,用超微量分光光度計測定濃度,進行一步法反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,無核酸酶水補至20 μL。每個基因進行3次生物學重復(fù)。反轉(zhuǎn)錄程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以得到的cDNA稀釋10倍后為模板進行實時熒光定量PCR檢測,反應(yīng)體系20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free水6 μL。擴增程序:50 ℃激活2 min,95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,進行40 個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因[20-21],檢測STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-κB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平,引物信息見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.3 統(tǒng)計分析

將獲得的試驗組和對照組目的基因及β-actin的Ct值代入2-ΔΔCt中計算相對表達量,用SPSS 2.0對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,并以Prism 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅷ基因編碼區(qū)序列PCR擴增及產(chǎn)物鑒定

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離可獲得大小約760 bp的條帶(圖1),與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示,FAdV-4的Ⅷ基因開放閱讀框(ORF)長744 bp,共編碼247個氨基酸殘基,與GenBank的血清4型禽腺病毒Ⅷ基因(登錄號MN577984.1)核苷酸序列相似性為100%。

M: DL 2000 DNA Marker;1～4: Ⅷ基因擴增產(chǎn)物。M:DL 2000 DNA Marker; 1-4: Ⅷ gene PCR amplification products.圖1 FAdV-4 Ⅷ基因PCR擴增電泳Fig.1 Electrophoretic profile of FAdV-4 Ⅷ gene PCR amplification

2.2 pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定

pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后得到744和4622 bp 2個片段,說明Ⅷ基因目的片段已正確插入pEF1α-HA載體(圖2)。深圳華大基因公司測序結(jié)果顯示插入的Ⅷ基因大小、位置、閱碼框架均正確,說明pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M: Trans 8K DNA Marker;1～4: pEF1α-HA-Ⅷ雙酶切產(chǎn)物。M: Trans 8K DNA Marker; 1-4:Double enzyme digestion of pEF1α-HA-Ⅷ products.圖2 pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of pEF1α-HA-Ⅷ recombinant plasmid

2.3 Ⅷ重組蛋白Western blotting和間接免疫熒光驗證

從圖3可看出,以pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒(試驗組)和pEF1α-HA空質(zhì)粒(對照組)轉(zhuǎn)染LMH細胞,pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞裂解出來的蛋白與鼠源HA標記單克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng),在34 kD處有一特異條帶,而對照組在此處未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LMH細胞可觀察到大量綠色熒光,而對照組無綠色熒光(圖4)。說明Ⅷ重組蛋白在LMH細胞中正確表達。

M: 蛋白 Marker(11～180 kD);1: pEF1α-HA空質(zhì)粒;2:pEF1α-HA-Ⅷ質(zhì)粒。M: Protein Marker(11-180 kD);1: pEF1α-HA empty plasmid;2:pEF1α-HA-Ⅷ plasmid.圖3 Ⅷ重組蛋白Western blotting驗證Fig.3 Western blotting identification of recombinant protein Ⅷ

A: pEF1α-HA空質(zhì)粒B: pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒。A:pEF1α-HA empty plasmid;B:pEF1α-HA-Ⅷ recombinant plasmid.圖4 Ⅷ重組蛋白的間接免疫熒光驗證(100×)Fig.4 Indirect immunoflurescence identification of recombinant protein Ⅷ(100×)

2.4 Ⅷ重組蛋白對LMH細胞天然免疫基因表達的影響

與對照組相比,pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,模式受體STING和MDA5基因的mRNA表達水平上調(diào),其中,STING基因的相對表達量較對照組顯著提高了5.6倍(P<0.05,下同),MDA5基因的相對表達量較對照組提高了30%;pⅧ促進接頭蛋白TBK1和MAVS的mRNA水平表達,表現(xiàn)為,MAVS基因相對表達量上調(diào)倍數(shù)較大,較對照組顯著提高2.4 倍,TBK1基因相對表達量較對照組顯著提高1.5倍;pⅧ促進轉(zhuǎn)錄因子IRF7的mRNA水平表達,較對照組顯著提高3.4倍,而NF-κB的mRNA水平表達與對照組相比下調(diào)2%(圖5)。

各模式受體、接頭蛋白和轉(zhuǎn)錄因子圖柱上*表示差異顯著(P<0.05)。* on the column of pattern recognition receptors,adaptor proteins and transcription factors indicated significant differences(P<0.05).圖5 Ⅷ重組蛋白對模式受體、接頭蛋白、轉(zhuǎn)錄因子相對表達量的影響Fig.5 Effect of recombinant protein Ⅷ on the relative expressions of the pattern recognition receptors,adaptor proteins and transcription factors

與對照組相比,pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,干擾素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-6、IL-8、IL-1β、IL-15)的mRNA水平呈上調(diào)表達,其中IFN-α和IFN-β的相對表達量分別極顯著高于對照組19.2和14.4倍(P<0.01);白介素中IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的相對表達量分別顯著高于對照組4.1、2.1、6.0和7.9倍(圖6)。說明FAdV-4 pⅧ對激活宿主天然免疫通路具有積極作用。

細胞因子圖柱上*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。* on the column of cytokines indicated significant differences(P<0.05), ** indicated extremely significant differences (P<0.01).圖6 Ⅷ重組蛋白對細胞因子相對表達量的影響Fig.6 Effect of recombinant protein Ⅷ on the relative expressions of cytokines

3 討 論

FAdV-4感染過程中,FAdV-4編碼蛋白發(fā)揮著不同作用。Gao等[22]研究發(fā)現(xiàn),hexon蛋白與T復(fù)合物多肽1亞單位(CCT7)結(jié)合可抑制病毒復(fù)制;Medina-Kauwe等[23]研究表明,peton蛋白中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD)與整合素結(jié)合,介導(dǎo)病毒進入細胞,并刺激宿主產(chǎn)生保護抗體;Bewley等[24]研究顯示,fiber1與細胞受體(CAR)結(jié)合,介導(dǎo)FAdV-4 感染宿主并促進病毒表達;Zhao等[25]研究證實,pX蛋白是誘導(dǎo)肝細胞壞死的主要因子;Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn),100K蛋白與宿主的熱休克蛋白作用能促進病毒復(fù)制。目前,關(guān)于FAdV-4-Ⅷ基因的功能研究較少。因此,本研究從天然免疫的視角分析FAdV-4 pⅧ和宿主間的相互作用,以此探討pⅧ在FAdV-4感染和致病過程中的作用和意義。

本研究在LMH細胞中過表達 pⅧ,檢測12種重要的天然免疫因子,結(jié)果顯示所有的免疫因子均發(fā)生一定程度的變化,其中一些細胞因子轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)表達,說明Ⅷ重組蛋白在LMH細胞中表達,對天然免疫信號通路激活發(fā)揮一定作用;模式受體STING和MDA5基因呈上調(diào)表達,提示這2個受體在FAdV-4調(diào)控天然免疫中發(fā)揮重要作用。值得注意的是,二者上調(diào)表達的幅度并不一致,說明在Ⅷ重組蛋白進入LMH細胞后,對模式受體的選擇存在偏好性。同時猜測Ⅷ重組蛋白作為病毒編碼蛋白具有一定的病原相關(guān)特征被模式識別受體識別,與加入的FADV-4 病毒競爭結(jié)合識別受體。

接頭蛋白在病毒感染誘導(dǎo)宿主反應(yīng)起關(guān)鍵作用,接頭蛋白分子一旦被激活,將招募下游的信號激酶復(fù)合物,進而磷酸化或激活I(lǐng)RF7和NF-κB等通路,誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生[27]。在本研究中,TBK1和MAVS基因的表達水平在pEF1α-HA-Ⅷ重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細胞后較穩(wěn)定;轉(zhuǎn)錄因子IRF7和NF-κB的表達量變化有所不同,IRF7基因呈上調(diào)表達,而NF-κB基因表達量有所下調(diào),推測Ⅷ蛋白抑制由NF-κB轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號通路。已有研究報道,FAdV-1的Gam-1通過NF-κB轉(zhuǎn)錄因子信號通路抑制由TNF-α誘導(dǎo)的Dark細胞凋亡[28],馬立克氏病毒編碼的RLORF4蛋白與NF-κB蛋白的Rel結(jié)構(gòu)域結(jié)合,阻止馬立克氏病毒入核;HADV-5的早期蛋白E1A與NF-κB結(jié)合抑制TNF-α誘導(dǎo)細胞凋亡[29]。因此推測,FAdV-4后期能利用Ⅷ蛋白抑制NF-κB通路來逃逸宿主的天然免疫。

本研究結(jié)果表明,在LMH細胞中過表達Ⅷ蛋白能促進IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等基因的表達,IFN-α、IFN-β、IL-6和IL-8基因的表達趨勢與FAdV-4全病毒誘導(dǎo)的上調(diào)結(jié)果相似,但這些因子上調(diào)幅度低于FAdV-4全病毒誘導(dǎo),可能與FAdV-4編碼多個蛋白及多個蛋白協(xié)同作用誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答有關(guān),而單個Ⅷ蛋白轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能力有限,與Zhao等[30]對FAdV-4感染雞后在脾臟和肝臟中的檢測結(jié)果一致。已有研究證實,IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β和IL-15等細胞因子與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)[31-32],可能作為抗病毒反應(yīng)的主要成分發(fā)揮抗病毒感染作用[32-33],表明Ⅷ蛋白在FAdV-4調(diào)控宿主的天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要作用。本研究中,IL-1β和IL-15呈上調(diào)表達,與FAdV-4全病毒感染LMH細胞后抑制表達相反,究其原因可能是全病毒毒性太強,炎癥因子表達量下調(diào)來降低對宿主的損傷,與炎性因子大量表達導(dǎo)致死亡[34]的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

在LMH細胞中過表達FAdV-4 pⅧ,STING、MDA5、TBK1、MAVS、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等天然免疫相關(guān)基因呈上調(diào)表達,表明Ⅷ蛋白對FAdV-4激發(fā)宿主的天然免疫具有一定促進作用。