趙佳福,周明帥,徐 暢,楊秀遠,陳 祥

(1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025)

【研究意義】黔北麻羊作為貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一,具有生長發(fā)育快、體型大、性成熟早、肉質(zhì)香嫩鮮美、無膻味和皮張品質(zhì)好等特點,深受消費者的歡迎和喜愛[1]。研究發(fā)現(xiàn),黔北麻羊繁殖力較強,產(chǎn)羔率可達196%,高于貴州白山羊(160%)和貴州黑山羊(152%)。繁殖率是肉羊養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟性狀[2],因此,研究黔北麻羊繁殖性狀對提高其養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要作用?！厩叭搜芯窟M展】組織蛋白酶 K(Cathepsin K,CTSK)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶,屬于木瓜蛋白酶超家族成員,存在于溶酶體細胞內(nèi),是蛋白酶中一個細胞外基質(zhì)降解酶[3],廣泛存在于病毒、細菌、真菌、原生動物及原蟲、植物、哺乳動物和人體中,通過氨基酸活性部位調(diào)節(jié)對應(yīng)蛋白的催化活性。對綿羊的研究發(fā)現(xiàn),在綿羊妊娠的40～120 d可在其子宮胎盤組織中檢測到多種組織蛋白酶mRNA的表達,CTSK蛋白在妊娠后期主要分布于子宮內(nèi)膜腺間和胎盤間,表明在綿羊子宮胎盤組織中CTSK蛋白可能參與綿羊子宮內(nèi)膜重塑以及胎盤的形成[4]。纖連蛋白(Fibronectin,FN)是一種分子量為440 kDa的高分子量細胞外基質(zhì)糖蛋白,是纖維連接蛋白家族的一個成員,其分子結(jié)構(gòu)中含有多種結(jié)構(gòu)域,可選擇性地與細胞外基質(zhì)中多種大分子如膠原、肝素、纖維蛋白及細胞表面受體結(jié)合,在細胞黏附、遷移、生長、分化及基質(zhì)重塑等多種細胞過程中起至關(guān)重要作用[5],FN1在腫瘤、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎等疾病中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能[6]?！颈狙芯壳腥朦c】圍繞前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測結(jié)果,以單羔黔北麻羊卵巢中差異表達的CTSK和FN1基因為切入點,研究CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達規(guī)律,解析CTSK和FN1基因與黔北麻羊繁殖之間的表達調(diào)控關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】闡明CTSK、FN1基因不同表達模式與黔北麻羊繁殖率之間的相互作用關(guān)系,為黔北麻羊多胎品系的選育尋找潛在的關(guān)鍵候選基因和分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、試劑及主要儀器

1.1.1 試驗動物 黔北麻羊(Qianbei Ma goat)由貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司提供。選擇健康無病、繁殖性能正常,體重相近的1～2歲單羔(連續(xù)2胎產(chǎn)單羔)和多羔(連續(xù)2胎產(chǎn)雙羔以上)黔北麻羊各3只,屠宰后分別采集單羔、多羔母羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個性腺組織,使用滅菌的錫箔紙包裹組織樣品,貼好標(biāo)簽置于液氮中運回實驗室,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo Fisher科技公司,qPCR Mix購于美國BIO-RAD公司,膠回收試劑盒購于Axygen生物技術(shù)有限公司,DNA Marker 2000購于大連寶生物工程有限公司,LB培養(yǎng)基粉末購于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,液氮、氯仿、50×TAE 緩沖液、異丙醇、無水乙醇、瓊脂糖、氨芐青霉素等購自貴州西寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 包括超微量紫外分光光度計(NANODROP 2000,美國Thermo Fisher)、恒溫搖床(MaxQ4000,美國ThermoScientific)、電泳儀(DYY-2C 型,北京六一)、PCR 擴增儀(C1000 TouchTM、美國BIO-RAD)、熒光定量PCR儀(CFX 96,美國BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR,美國BIO-RAD)、微量瞬時離心機(D1008E,大龍)、斡旋混勻儀(VORTEX-1,歐萊博)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)Genbank公布的山羊CTSK(XM_005677656.3)、FN1(XM_005676508.3)及β-acting基因 mRNA序列,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量 PCR引物,由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列信息見表1。

表1 qPCR引物序列信息Table 1 Primer sequence information of qPCR

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 利用TRIZOL法提取組織RNA,超微量紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量,隨后通過HiFi Saript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,體系為5×RT Buffer 4 μL、RibolockRnose Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLURT 1 μL、RNase-Free water補充至20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃,60 min;70 ℃,5 min,最后將反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)浜罄m(xù)試驗。

1.2.3 qPCR檢測 采用qPCR檢測CTSK、FN1基因在單羔、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮性腺組織中表達水平。將逆轉(zhuǎn)錄得到的各組織cDNA稀釋至等濃度作為模板,反應(yīng)體系為10 μL:qRT-PCR mix 5 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物(100 μmol/L)各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 2 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火 30 s,70 ℃延伸30 s并添加機器自帶的熔解曲線,以β-acting為內(nèi)參基因,每組3個重復(fù)進行qPCR反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

qPCR數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,圖表采用GraphPad Prism5進行處理。在t檢驗中,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);在進行多重比較分析時,不同字母表示差異極顯著(P< 0.01),相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)。使用Expasy網(wǎng)站中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析CTSK、FN1蛋白理化性質(zhì);運用SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號肽;使用PSOR(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測蛋白亞細胞定位;SOPMA和SWISS預(yù)測蛋白二級和三級結(jié)構(gòu);使用Megalign進行不同物種同源性比較;用MEGA7.0構(gòu)建不同物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達水平

從圖1看出,CTSK基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達。在單羔組中,CTSK基因在卵巢組織中的表達最高,極顯著高于其他組織,在垂體和輸卵管中的表達最低;在多羔組中,CTSK基因在卵巢中表達最高,極顯著高于其他組織,在輸卵管、下丘腦、子宮和垂體中的表達較低且差異不顯著。CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達差異不顯著。FN1基因在單羔組及多羔組卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達。在單羔組中,FN1基因在輸卵管中的表達量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在垂體、下丘腦和子宮中的中的表達量較低,且差異不顯著。在多羔組中,FN1基因在子宮組織中的表達量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在輸卵管和垂體中的表達量最低。FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達量顯著高于單羔組,垂體和輸卵管中的表達量極顯著低于單羔組。

圖1 CTSK和FN1基因在黔北麻羊單羔及多羔性腺軸中的表達量Fig.1 Expression of CTSK gene and FN1 gene in gonadal axis of monotocous and polytocous lambs of Qianbei Ma goat

2.2 黔北麻羊CTSK和FN1基因蛋白理化性質(zhì)

黔北麻羊CTSK基因共編碼330個氨基酸,相對分子質(zhì)量37160.25,化學(xué)式C1649H2566N458O490S16,理論PI為8.82,在哺乳動物體中的半衰期約為30 h。其中帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)34個,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為41個,說明該基因編碼的氨基酸序列帶負電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為31.67,為穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)<40),脂肪族指數(shù)為77.12,總平均親水性為-0.523,為親水性蛋白。

黔北麻羊FN1基因共編碼2478個氨基酸,相對分子質(zhì)量272 070.51,化學(xué)式C11912H18545N3317O3814S88,理論PI為5.37,在哺乳動物體中的半衰期約為30h。其中帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)為266個,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為206個,說明該基因編碼的氨基酸序列帶負電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為41.14,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)>40),脂肪族指數(shù)為69.79,總平均親水性為-0.496,為親水性蛋白。

2.3 黔北麻羊CTSK和FN1基因的亞細胞定位

使用PSOR II Prediction在線軟件預(yù)測CTSK、FN1蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示,CTSK蛋白定位在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為33.3%,定位在線粒體中的可能性為22.2%,定位在囊泡的可能性為11.1%。FN1蛋白定位在細胞核的可能性60.9%,定位在線粒體及細胞外的可能性均為13.0%,小概率定位在囊泡(8.7%)和細胞質(zhì)(4.3%)中。說明CTSK蛋白可能主要在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.4 黔北麻羊CTSK和FN1基因信號肽預(yù)測

從圖2看出,黔北麻羊CTSK蛋白在16～17位(SFA-LY)氨基酸位置有86.23%的可能性出現(xiàn)信號肽切割位點,且是Sec/SPI信號肽的可能性為96.33%;黔北麻羊FN1蛋白在27～28位(AGA-SK)氨基酸位置有34.92%的可能性出現(xiàn)信號肽切割位點,且是Sec/SPI信號肽的可能性為99.35%。說明CTSK和FN1蛋白信號肽均由Sec轉(zhuǎn)運子運輸,由信號肽酶Ⅰ(Lep)切割而成,與信號識別有關(guān)。

圖2 CTSK和FN1蛋白信號肽預(yù)測Fig.2 Signal peptide prediction of CTSK protein and FN1 protein

2.5 CTSK和FN1基因的二級和三級結(jié)構(gòu)

從圖3看出,黔北麻羊CTSK蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(32.7%)、β-轉(zhuǎn)角(5.45%)、無規(guī)則卷曲(58.47%)與延伸鏈(29.82%)組成;FN1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(5.73%)、β-轉(zhuǎn)角(5.97%)、無規(guī)則卷曲(45.45%)與延伸鏈(16.35%)組成。CTSK蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成,FN1蛋白質(zhì)則主要為無規(guī)則卷曲及延伸鏈構(gòu)成,預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)一致。

圖3 CTSK和FN1蛋白的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 Secondary structures(A) and tertiary structures (B) of CTSK protein and FN1 protein

2.6 CTSK和FN1基因同源性及遺傳距離

將黔北麻羊CTSK、FN1基因氨基酸序列與不同物種氨基酸序列進行同源性比對結(jié)果顯示,黔北麻羊CTSK基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、兔、人、鼠和雞的同源性分別為99.5%、98.4%、95.9%、95.9%、95.4%、94.7%、94.2%、85.7%和74.9%(圖4-A);黔北麻羊FN1基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、人、兔、鼠和雞的同源性分別為99.7%、99.1%、95.8%、95.2%、95.1%、93.9%、93.3%、91.6%和83.2%(圖4-B)。由此可見,黔北麻羊CTSK和FN1基因編碼氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性,均與反芻動物綿羊、牛的同源性最高,與小型動物或非哺乳動物鼠和雞中的同源性最低。從構(gòu)建的不同物種CTSK、FN1基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果證實,黔北麻羊CTSK(圖5-A)和FN1(圖5-B)基因與綿羊、牛等反芻動物遺傳距離最近,與鼠和雞的遺傳距離最遠。

圖4 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的同源性Fig.4 Amino acid sequence homology of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

圖5 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

3 討 論

CTSK基因作為組織蛋白酶家族中被研究得較少的一類,近年來較多的研究方向均為與骨質(zhì)疏松或牙周炎[7-9]和腫瘤發(fā)生[10]等有關(guān),Feng等[11-13]研究認為,CTSK基因是一種骨質(zhì)疏松靶向蛋白酶,活化的破骨細胞特異性表達成熟CTSK基因,且有助于骨組織的重塑與再吸收,CTSK基因缺乏的骨細胞防止乳汁誘導(dǎo)的骨丟失和甲狀旁腺激素抑制,而雌激素可以下調(diào)CTSK基因的表達。魏巍等[3]發(fā)現(xiàn),CTSK基因不僅參與機體正常生理調(diào)節(jié),而且在多種疾病如實體瘤、關(guān)節(jié)炎、椎間盤退行性改變等中均異常表達。Li等[14]研究表明,CTSK基因被確定為腸道菌群失衡與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移之間的重要中介,與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)。但近年來CTSK基因在家畜、山羊上的研究則比較少見。Balatsky等[15]研究表明,肌肉內(nèi)脂肪含量和嫩度受CTSK等位基因變異的影響,CTSK基因可能與優(yōu)質(zhì)瘦肉的生產(chǎn)特別相關(guān)。Suárez-Vega等[16]研究發(fā)現(xiàn),CTSK基因還可能與綿羊的奶酪量與品質(zhì)性狀有關(guān)。本研究中,qPCR結(jié)果顯示,CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,這與 Balboula[17]的研究一致;Balboula等研究發(fā)現(xiàn),與質(zhì)量較差的胚胎相比,優(yōu)質(zhì)胚胎或優(yōu)質(zhì)卵裂球表現(xiàn)出更強的自噬活性和較少的CTSK基因活性,且抑制CTSK基因會降低IVP牛胚胎的發(fā)育率(增加囊胚和孵化率)和質(zhì)量(增加細胞總數(shù)和降低凋亡細胞百分比),此外,下丘腦-垂體-卵巢軸通過調(diào)節(jié)激素分泌對哺乳動物卵巢卵泡的發(fā)育具有重要影響[18-20],而CTSK基因在單羔組卵巢和下丘腦組織中高表達,說明CTSK基因可能與胚胎質(zhì)量和卵泡發(fā)育具有負向調(diào)控關(guān)系。

FN1基因作為纖維連接蛋白家族中的一員,是一種參與細胞粘附和遷移過程的糖蛋白,被普遍研究認為與癌癥的發(fā)生途徑有關(guān)。在癌癥病例中,FN1基因的高表達往往被視為預(yù)后不良,FN1基因在GAC腫瘤組織中的表達水平均顯著高于正常組織[21]。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),FN1在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)進展中發(fā)揮重要作用,可能作為PTC預(yù)后的標(biāo)志物。在生殖過程中FN1基因也發(fā)揮著不同的功能,如受精和著床。FN1基因的表達從桑椹胚到囊胚早期顯著增加,這表明FN1基因可能也參與了早期囊胚的形成。Goossens等[23]研究認為,FN1可能在囊胚形成過程中發(fā)揮特定的功能,胚胎FN1基質(zhì)具有黏附性,將細胞連接在一起,并為細胞層遷移提供底物。Cai等[24]研究發(fā)現(xiàn),敲低FN1基因能顯著抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移;樊慶燦[25]對雞胚的研究表明,FN1基因通過結(jié)構(gòu)域與細胞表面受體、纖維蛋白等特異性結(jié)合,調(diào)控細胞的遷移、分化和黏附,參與胚胎細胞分化和器官形成,在胚胎發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究表明,FN1基因在多羔組下丘腦、子宮和卵巢組織中的表達均顯著高于單羔組,推測FN1可能通過卵巢及子宮細胞的增殖及遷移,促進胚胎發(fā)育,與動物繁殖性狀可能具有正向調(diào)控關(guān)系。因此,CTSK和FN1基因作為影響黔北麻羊繁殖力高低的重要候選基因還需作進一步的研究。

4 結(jié) 論

CTSK、FN1基因分別編碼330和2478個氨基酸,理論PI分別為8.82和5.37,CTSK是一種具有信號肽的穩(wěn)定親水性蛋白,而FN1是一種具有信號肽的不穩(wěn)定親水性蛋白;亞細胞定位結(jié)果說明:CTSK蛋白可能主要在細胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用;高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,CTSK和FN1蛋白均主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成;與其他動物相比,黔北麻羊CTSK、FN1基因均與反芻動物綿羊及牛的親緣關(guān)系最近。qPCR表明:CTSK和FN1基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達;CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達差異不顯著(P>0.05);FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05),在垂體和輸卵管中的表達量極顯著低于單羔組。CTSK基因表達量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的負相關(guān),FN1基因表達量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的正相關(guān),兩者均與動物繁殖性狀密切相關(guān)。