崔露瑩 陳明麗 余文 李志遠(yuǎn) 巫升鑫 李東徽 蓋夢琦 解敏敏 龔達(dá)平 程崖芝

摘? 要：為驗(yàn)證NtHDZIV8在腺毛發(fā)育過程中的功能，在紅花大金元中克隆了NtHDZIV8基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量PCR（qRT-PCR）探究了NtHDZIV8的表達(dá)模式，進(jìn)一步利用亞細(xì)胞定位與病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)初步驗(yàn)證了NtHDZIV8基因?qū)煵菹倜l(fā)育的調(diào)控作用。結(jié)果表明，NtHDZIV8進(jìn)化高度保守，具有典型的HD-LZ、START和SAD結(jié)構(gòu)域，屬于HDZIP IV家族。表達(dá)模式分析表明，NtHDZIV8在腺毛中高表達(dá)，并受植物激素NAA、GA3和MeJA的誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NtHDZIV8定位于細(xì)胞核。病毒誘導(dǎo)本氏煙中NbHDZIV8基因沉默導(dǎo)致長柄腺毛的柄細(xì)胞基部膨大，而不影響短柄腺毛形態(tài)和腺毛密度。該研究表明NbHDZIV8對煙草腺毛形態(tài)具有調(diào)控作用，為解析煙草腺毛發(fā)生發(fā)育調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；HDZIV8；腺毛；基因沉默

中圖分類號：S572.03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1007-5119（2023）02-0007-08

Abstract： To verify the function of NtHDZIV8 in the development of glandular trichomes， the coding sequence （CDS） of? NtHDZIV8 was cloned from Honghuadajinyuan and further used in bioinformatics analysis. The expression pattern of NtHDZIV8 was analyzed by qRT-PCR， and the role of NtHDZIV8 in development of glandular trichomes was verified using subcellular localization and virus-induced gene silencing （VIGS）. The results showed that NtHDZIV8 was highly conserved and contained typical HD-LZ， START and SAD domains， belonging to the HD-ZIP IV family. The expression pattern analysis showed that NtHDZIV8 was highly expressed in glandular trichomes， and was induced by plant hormones GA3， NAA and MeJA. Subcellular localization results showed that NtHDZIV8 was located in the nucleus. The results of VIGS analysis showed that NbHDZIV8 gene regulated basal expansion of stalk cells in long glandular trichomes， but did not affect the morphology and density of short glandular trichomes in N.benthamiana. The results in this study demonstrate that NtHDZIV8 regulates the development of long glandular trichomes in tobacco， which provides a theoretical basis for the analysis of the regulatory mechanism of tobacco trichome development.

Keywords： tobacco; HDZIV8; trichomes; virus induced gene silencing （VIGS）

植物毛狀體是植物表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，具有多種重要的功能，包括減少蒸騰作用、調(diào)節(jié)葉片溫度、阻礙昆蟲和病原體的攻擊[1-2]。普通煙草毛狀體通常分為3種類型，即長柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和保護(hù)毛[3]。本氏煙中有2種類型的腺毛：短柄腺毛與長柄腺毛，沒有保護(hù)毛[4]。腺毛通常是多細(xì)胞的，由3部分組成：基部、柄與腺體。煙草腺毛是大量代謝物生物合成和儲(chǔ)存的場所，如二萜化合物、糖脂和抗性蛋白，它們可以影響香氣品質(zhì)，提高煙草的抗蚜蟲能力[5-6]，減少葉片真菌感染[7]。已有研究表明HD-ZIP IV亞家族的成員在植物毛狀體發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。HD-ZIP家族成員按照結(jié)構(gòu)特征、保守結(jié)構(gòu)域和生理功能可分為HD-ZIP I、HD-ZIP II、HD-ZIP III和HD-ZIP IV 4個(gè)亞家族。其中，HD-ZIP IV亞家族包含了HD、LZ、START與SAD 4種結(jié)構(gòu)域[10]。目前，HD-ZIP IV亞家族成員參與腺毛發(fā)育的相關(guān)研究主要集中在擬南芥、番茄和青蒿中[11-13]。在青蒿中2個(gè)HD-ZIP IV轉(zhuǎn)錄因子即AaHD1和AaHD8正向調(diào)控腺毛的形成[14]。在番茄中，AaHD8的同源基因SICD2的功能缺失突變體葉片表面VI型腺毛密度降低[15]。Wo也是HDZIP IV家族成員，番茄的Wo等位突變體wolly腺毛數(shù)量顯著增加[16]。當(dāng)在煙草中異位表達(dá)SIWo時(shí)，煙草植株毛狀體密度增加[9]。HDZIP IV家族另一成員SIHDZIV8基因沉默后的植株表皮毛顯著減少，I型腺毛柄細(xì)胞基部膨大[17]。

研究表明番茄SIHDZIV8基因能夠影響腺毛密度與形態(tài)發(fā)育[17]，但在煙草中的同源基因尚未開展研究。因此，本研究通過對普通煙草NtHDZIV8基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并在本氏煙中誘導(dǎo)NbHDZIV8基因沉默來研究NtHDZIV8基因在煙草腺毛發(fā)育中的功能，為闡明煙草腺毛發(fā)生的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的植物材料包括普通煙草紅花大金元和本氏煙。在25 ℃，光周期16 h/d條件下種植，在普通煙草紅花大金元現(xiàn)蕾期，收集腺毛、根、莖、腋芽、幼葉和成熟葉片等組織，液氮速凍后于–80 ℃保存；本氏煙生長至4葉期時(shí)進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1 NtHDZIV8基因克隆? 以番茄SIHDZIV8 （Solyc03g098200）蛋白序列作為query序列，通過BLAST比對，獲得煙草候選基因NtHDZIV8（Ntab0234150），設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，上游引物為5'-ATGGAGTACGGCAGCGGA-3'，下游引物為5'-TCAAGAAGTGGAGCAATTCAAGG-3'。以普通煙草紅花大金元cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得完整CDS序列。

1.2.2? NtHDZIV8的生物信息學(xué)分析 利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測NtHDZIV8基因編碼蛋白質(zhì)序列的分子量、親水值和理論等電點(diǎn)；在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）與茄科數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics. net/）中下載番茄、辣椒、馬鈴薯、擬南芥、葡萄、水稻、玉米和大豆的蛋白質(zhì)序列，使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對。使用MGEA X構(gòu)建進(jìn)化樹（Neighbor-Joining，NJ tree）；采用GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）分析基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用MEME（http：//meme-suite.org/）對保守基序（motif）進(jìn)行分析。利用在線軟件Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動(dòng)子順式作用元件，并將結(jié)果用TBtools可視化[18]。

1.2.3? NtHDZIV8的亞細(xì)胞定位? 根據(jù)NtHDZIV8基因去掉終止密碼子的CDS序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。上游引物為5'-GACTCTAGAGGATCCATG GAGTACGGCAGCGGA-3'，下游引物為5'-GCTCA CCATGGATCCAGAAGTGGAGCAATTCAAGGC-3'，以紅花大金元cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，目的片段回收后連接pCAMBIA1300-GFP載體。在本氏煙中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，黑暗處理24 h，處理3 d后觀察熒光信號[19]。

1.2.4? NtHDZIV8表達(dá)模式分析? 通過qRT-PCR檢測不同組織NtHDZIV8基因的表達(dá)量。根據(jù)NtHDZIV8 CDS序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增qRT-PCR引物，上游引物為：5'-GCAATTGATGTATGAAG AATTGCA-3'，下游引物為5'-CTTGCAAGAAGTG TTAGAATACAGA-3'。以煙草26S rRNA基因作為內(nèi)參，最后依據(jù)2-ΔΔCt算法進(jìn)行基因表達(dá)差異分析[20]。

1.2.5? NtHDZIV8基因沉默? 從候選基因NbHDZIV8（Niben101Scf02108g00002.1）選取300 bp片段，使用本氏煙cDNA為模板，用特異性引物（上游引物5'-TAAGGTTACCGAATTCTCAGGGGCT CTAGTAGTGTA-3'，下游引物為5'-AGACGCG TGAGCTCGGTACCAACAGTGCTGCCTATAAGGT-3'）擴(kuò)增目的片段。通過同源重組將PCR純化產(chǎn)物與線性化pTRV2載體連接，將重組載體轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并通過測序驗(yàn)證，搖菌提取質(zhì)粒。將pTRV2：NbHDZIV8、pTRV2和pTRV1載體通過熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。

按照于靜[21]的方法，分別挑取pTRV2： NbHDZIV8、pTRV2和pTRV1單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，搖菌至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用重懸液重懸菌體。28 ℃避光靜置2～3 h后，將pTRV1與pTRV2、pTRV2：PDS、pTRV2：NbHDZIV8等體積混合，注射本氏煙葉片。待本氏煙生長20 d左右進(jìn)行基因表達(dá)量檢測及腺毛表型觀察。

1.2.6? 植物激素處理? 普通煙草品種紅花大金元種子經(jīng)消毒處理播種在裝有滅菌土壤的花盆中，在幼苗長至四葉期時(shí)，進(jìn)行激素處理：分別噴施100 μmol/L的赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、萘乙酸（NAA）、脫落酸（ABA）和乙烯利（ETH），用蒸餾水噴灑對照幼苗。在處理前和處理后1、3、6、12、24、48和72 h收集葉片放入液氮速凍，–80 ℃保存。通過qRT-PCR鑒定NtHDZIV8基因在不同激素處理下的表達(dá)量。

2? 結(jié)? 果

2.1? HDZIV8基因的序列比對及進(jìn)化分析

對煙草NtHDZIV8蛋白序列與番茄、擬南芥、馬鈴薯等物種中相似基因進(jìn)行多重序列比對（圖1），結(jié)果顯示不同物種中HDZIV8蛋白質(zhì)序列高度保守，屬于HDZIP IV亞家族，具有典型的HD-LZ、START和SAD結(jié)構(gòu)域，說明HDZIV8在不同物種中進(jìn)化保守，可能具有功能上的相似性。為了揭示不同物種中HDZIV8的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA X構(gòu)建進(jìn)化樹用于系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明（圖2），煙草NtHDZIV8與番茄SlHDZIV8、辣椒CaHDG11親緣關(guān)系最近。使用GSDS在線程序?qū)Σ煌锓N中的HDZIV8基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其外顯子與內(nèi)含子數(shù)目均相同。利用MEME軟件分析，發(fā)現(xiàn)不同物種中HDZIV8保守基序的種類與組織形式一致，暗示了HDZIV8轉(zhuǎn)錄因子同源基因間進(jìn)化保守性和功能相似性。

2.3? NtHDZIV8基因全長CDS序列克隆及序列分析

基于以上生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，以紅花大金元的總cDNA為模板擴(kuò)增NtHDZIV8基因，目的片段約2100 bp（圖3）。將目的片段進(jìn)行純化回收并連接TA克隆載體，挑取單克隆測序。結(jié)果表明NtHDZIV8基因CDS序列全長2154 bp，編碼了717個(gè)氨基酸。利用ProtParam分析NtHDZIV8蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，該蛋白相對分子量為79.03 kDa，蛋白親水值為–0.280，理論等電點(diǎn)為6.27。

2.4? NtHDZIV8轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位

通過構(gòu)建35s：：NtHDZIV8：：GFP融合載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙葉片，檢測NtHDZIV8融合GFP表達(dá)蛋白的分布情況（圖4）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入35s：：GFP融合載體的對照組中，綠色熒光信號存在于細(xì)胞核與細(xì)胞膜中；轉(zhuǎn)入35s：：NtHDZIV8：：GFP融合載體的試驗(yàn)組中，綠色熒光信號只在細(xì)胞核中存在，DAPI染色后觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核被染成藍(lán)色，表明NtHDZIV8定位在細(xì)胞核中。

2.5? NtHDZIV8表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步探究NtHDZIV8的功能，通過qRT-PCR對NtHDZIV8基因在不同組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖5）。結(jié)果顯示，NtHDZIV8在根（R）中不表達(dá)，在幼葉（YL）、花蕾（FB）、腋芽（LB）和腺毛（GL）等部位中均有表達(dá)，在腺毛（GL）中表達(dá)量最高，說明NtHDZIV8基因可能參與煙草腺毛發(fā)育過程。

2.6? NtHDZIV8基因功能鑒定

PDS基因?yàn)榘藲浞鸭t素脫氫酶，沉默PDS基因后，植株葉片會(huì)出現(xiàn)白化現(xiàn)象。在注射本氏煙20 d時(shí)，PDS沉默植株新葉上出現(xiàn)大面積漂白，從對照植株和NbHDZIV8沉默植株上取與白化葉片相同位置的葉片（圖6A）進(jìn)行表達(dá)量鑒定（圖6B）；

在NbHDZIV8沉默植株中選擇表達(dá)量降低50%以上單株的進(jìn)行表型觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，NbHDZIV8沉默植物短柄腺毛形態(tài)未發(fā)生變化，但是長柄腺毛柄細(xì)胞基部膨大（圖6C、6D）；腺毛密度沒有明顯差異（圖6E）。這些結(jié)果表明煙草NbHDZIV8參與調(diào)節(jié)腺毛的形態(tài)發(fā)育。

2.7? NtHDZIV8基因?qū)Σ煌参锛に氐捻憫?yīng)

通過qRT-PCR探究植物激素對NtHDZIV8基因的調(diào)控作用。結(jié)果表明（圖7），NtHDZIV8響應(yīng)多種植物激素，其中對NAA與GA3響應(yīng)最為明顯。在NAA處理?xiàng)l件下，NtHDZIV8在24 h基因表達(dá)量是0 h的3倍；在GA3處理?xiàng)l件下，表達(dá)量在24 h上升，48 h表達(dá)量降低，72 h表達(dá)量達(dá)最高，是對照的4倍。此外，ETH處理過程中，該基因24 h基因表達(dá)量最高，但不超過0 h兩倍。MeJA處理過程中，該基因表達(dá)量在24 h之前逐漸降低，而在48 h之后升高。上述結(jié)果表明NtHDZIV8受植物激素NAA、GA3和MeJA的誘導(dǎo)。

3? 討? 論

HD-ZIP IV基因在進(jìn)化過程中是保守的，植物特異性HD-ZIP IV參與了表皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，毛狀體和氣孔的模式化[9， 15]。本試驗(yàn)從普通煙草中克隆獲得NtHDZIV8基因，生物信息學(xué)分析表明NtHDZIV8具有HD、LZ、START和SAD結(jié)構(gòu)域，蛋白序列高度保守。通過亞細(xì)胞定位顯示NtHDZIV8蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。HD-ZIP IV轉(zhuǎn)錄因子已被證明在許多植物的毛狀體發(fā)育中起關(guān)鍵作用。作為NtHDZIV8同源基因，擬南芥AtHDG11與番茄SIHDZIV8均參與毛狀體的發(fā)育。AtHDG11突變體中表皮毛分支增多，AtHDG12增強(qiáng)了AtHDG11突變體中毛狀體的過度分支形態(tài)[22]。番茄中SIHDZIV8 RNAi植株I型腺毛柄細(xì)胞基部膨大，I、III和V型毛狀體密度顯著降低[17]。SIHDZIV8主要在幼葉和毛狀體中表達(dá)，AtHDG11在幼葉和花蕾中的表達(dá)量較高，其根部也有表達(dá)[22]。對不同組織部位的NtHDZIV8表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在腺毛、幼葉、花蕾和腋芽中表達(dá)較高，而莖與成熟葉片表達(dá)較低，在根中不表達(dá)；煙草幼嫩葉片、花蕾和腋芽表面密布腺毛，成熟葉片腺毛密度下降[23]，NtHDZIV8表達(dá)模式與煙草腺毛的分布部位結(jié)果一致，與SIHDZIV8表達(dá)模式相似，與擬南AtHDG11在根部表達(dá)量存在差異。NtHDZIV8在煙草根部不表達(dá)說明NtHDZIV8可能不參與根毛發(fā)育，只與腺毛發(fā)育有關(guān)，因此推測NtHDZIV8可能與SIHDZIV8功能相似，是一個(gè)潛在的腺毛正調(diào)控因子。為了探究NtHDZIV8對煙草腺毛的影響，本試驗(yàn)從本氏煙中克隆了NbHDZIV8基因，通過VIGS技術(shù)驗(yàn)證NbHDZIV8基因功能，發(fā)現(xiàn)NbHDZIV8沉默的本氏煙長柄腺毛柄細(xì)胞基部膨大，呈典型的葫蘆狀，與番茄中發(fā)生扭曲的腺毛表型一致；短柄腺毛形態(tài)沒有變化。番茄I型腺毛頂端有一個(gè)較小的腺體與一個(gè)多細(xì)胞的頸部，是7種番茄毛狀體中最長的[24]；本氏煙長柄腺毛與番茄I型腺毛形態(tài)相似，屬于多細(xì)胞腺毛，推測NbHDZIV8基因主要影響多細(xì)胞腺毛柄細(xì)胞中細(xì)胞板形成。番茄中SIHDZIV8 RNAi植株腺毛密度降低，但在NbHDZIV8 RNAi植株中沒有觀察到腺毛密度的顯著變化，推測該基因在不同物種中功能存在差異。

植物激素是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究證明生長素[25]、赤霉素[26]、茉莉酸[14，27]能夠參與毛狀體發(fā)育。研究表明，青蒿中AaHD1轉(zhuǎn)錄活性被AaJAZ8抑制[14]；在番茄中，SIJAZ2過表達(dá)降低腺毛密度[27]；SIARF4抑制SIMYB75表達(dá)，增加番茄II、V和VI型毛狀體密度[25]。脫落酸響應(yīng)基因AtSVB、AtSVB2[28]與乙烯受體ETR2[29]是擬南芥毛狀體發(fā)育的重要調(diào)控因子。本研究通過qRT-PCR檢測NtHDZIV8在煙草植株受到5種不同激素處理后的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)植物激素GA3、NAA和MeJA能夠影響NtHDZIV8的表達(dá)。通過啟動(dòng)子順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)NtHDZIV8具有MYB結(jié)合位點(diǎn)與茉莉酸響應(yīng)元件，推測NtHDZIV8可能通過JA途徑調(diào)控?zé)煵菹倜螒B(tài)發(fā)育。并且這些激素是植物應(yīng)對非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號，可能通過調(diào)控基因表達(dá)影響植株發(fā)育，NtHDZIV8基因可能是提高作物對非生物脅迫耐受性的良好靶基因。

4? 結(jié)? 論

研究證明，NtHDZIV8在進(jìn)化過程中高度保守，在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，屬于HDZIP IV家族。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)NtHDZIV8在煙草莖、葉、花蕾、腋芽組織中都有表達(dá)，在腺毛中表達(dá)量高于其他組織，并受到激素GA3和NAA和MeJA誘導(dǎo)。沉默NbHDZIV8使本氏煙中長柄腺毛基部細(xì)胞膨大，證實(shí)NbHDZIV8能夠調(diào)控?zé)煵菹倜螒B(tài)發(fā)育。為闡明NtHDZIV8在煙草腺毛發(fā)育中功能及分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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