婁亞楠，王召軍，楊欣玲，張洪映，牛德新，楊永鋒，崔紅

1 河南農業(yè)大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002；2 河南中煙工業(yè)有限責任公司，鄭州市隴海東路72號 450000

腺毛是植物表皮細胞的特化結構，在植物防御反應及次生產物生產中具有重要作用[1]。腺毛形態(tài)功能多樣，一般分為非分泌型腺毛（non-glandular trichome, NGT）和分泌型腺毛（glandular trichome,GT）兩大類：NGT由單細胞或多細胞組成，營養(yǎng)缺乏，質地堅硬，構成了植物的物理防線[2]；GT結構復雜，具有合成和分泌多種化合物的能力，既是植物的化學防線，也是生產高附加值次生產物的“生物化工廠”[3-4]。煙草（Nicotiana tabacum）的腺毛有3種類型：（1）長柄分泌型腺毛由3～5個細胞的腺柄和1～12個細胞的腺頭組成，是煙草主要香氣前體物質西柏烷和賴百當化合物合成和分泌的主要場所[5-6]；（2）短柄分泌型腺毛由單細胞的腺柄和4-細胞的腺頭組成，是煙草葉面抗性蛋白（T-phylloplain）的合成場所[7]；（3）非分泌型腺毛為不具備分泌能力的多細胞矛狀結構。由此可見，腺毛的密度和類型與煙株抗性和煙葉品質密切相關，因此闡明煙草腺毛的發(fā)生機制對煙草品種改良具有重要意義。

茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）及其衍生物茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonic Acid, MeJA）作為重要的植物激素，廣泛參與植物生長發(fā)育調控以及植物對環(huán)境脅迫的應答反應[8-10]。已有研究表明，JA對擬南芥（Arabidopsis thaliana）單細胞非分泌型腺毛發(fā)生具有調控作用，噴施JA能顯著提高擬南芥的非分泌型腺毛密度[11]，阻斷擬南芥內源JA的生物合成也可顯著降低其非分泌型腺毛密度[12]。與擬南芥不同，煙草等茄科植物腺毛多為混合型，由多種分泌型與非分泌型腺毛組成，JA對其腺毛發(fā)生的影響作用則更為復雜。番茄(Solanum lycopersicum)有7種類型的腺毛，包括4種分泌型（I, IV, VI, VII）和3種非分泌型（II,III, V）[13]，JA對番茄分泌型腺毛的發(fā)生，尤其是VI型腺毛，具有明顯的誘導作用[14-16]。栽培煙草“中煙100”在MeJA處理之后，長柄分泌型腺毛密度也有明顯增加[17]。表明JA對茄科植物分泌型腺毛發(fā)生具有一定促進作用，但對非分泌型腺毛發(fā)生的影響還很少有報道。這主要是因為在混合型植物中，分泌型腺毛比非分泌腺毛更加引人關注；另外，也與混合型植物的腺毛種類繁多、相互作用復雜、難于觀察有關。

對于腺毛為混合型的植物來說，腺毛突變體材料的發(fā)現(xiàn)和利用是研究腺毛發(fā)生機制的捷徑。普通煙草Tobacco Introduction 1112（T.I.1112）為非分泌型突變型；Tobacco Introduction 1068（T.I.1068）為高分泌型突變型，二者常用于煙草葉面化學、抗性及香氣改良的研究[18-20]。本研究分別以T.I.1112和T.I.1068為材料，在無菌條件下噴施不同濃度的MeJA并進行腺毛形態(tài)的比較觀察，旨在解析其對煙草分泌型和非分泌型腺毛形態(tài)發(fā)生的影響，為闡明煙草腺毛發(fā)生的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草T.I.1068和 T.I.1112裸種，來源于牛津煙草種質庫（Oxford Tobacco Research Station, in Oxford, North Carolina, USA）。種子經10%次氯酸鈉消毒后接種在MS培養(yǎng)基上，在人工氣候室內進行培養(yǎng)，溫度控制在28/22℃（晝/夜）， 相對濕度 75 ± 5%，光周期 14/10 h（晝/夜），光合有效輻射（PAR）為400 μmol /m-2.s-1。

1.2 MeJA處理

用無水乙醇助溶MeJA配制1.5 M的標準母液，再用蒸餾水分別稀釋至1 mM、3 mM和5 mM，然后過濾滅菌（0.22 μm的濾膜）至離心管中，備用。

選擇長勢一致的六葉期無菌苗，分別噴施2 mL不同濃度的MeJA溶液，使葉片充分濕潤。對照組用無菌水處理。每7 d噴施一次，共噴施3次。

1.3 腺毛形態(tài)觀察

待種子萌發(fā)至子葉期、四葉期和六葉期時，分別取子葉、第一片真葉和莖（上胚軸），利用超景深顯微鏡（基恩士VHR-5000，日本）進行表面觀察；在MeJA處理21 d后，每個濃度處理隨機選取3株，取新生葉進行組織化學染色、腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計。

腺毛組織化學染色法參考Lin和Wagner的方法[21]，并稍加改動。取小于5 cm的新生幼葉，在0.2%（w/v）羅丹明B 水溶液中浸染30 min，后用蒸餾水漂洗3次，沖洗掉未結合的染料。吸干表面水分，利用超景深顯微鏡對葉片表面進行觀察，并在上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度統(tǒng)計分析。

1.4 數(shù)據處理和統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據采用SPSS 22軟件進行分析，用新復極差法分析均值差異的顯著性，顯著性水平P＜ 0.05，以a、b、c、d表示其差異性，不同字母表示差異有統(tǒng)計學意義；采用Excel 2007軟件繪圖制表。

2 結果

2.1 T.I.1068和T.I.1112腺毛形態(tài)觀察

在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中，分別對T.I.1068和T.I.1112的子葉、第一片真葉和莖（上胚軸）表面腺毛進行形態(tài)觀察，結果如圖1所示?？梢钥闯觯诜N子萌發(fā)過程中，無論是T.I.1068還是T.I.1112，子葉上都無腺毛的發(fā)生(圖1-1,7），隨著真葉的形成各種類型腺毛也開始出現(xiàn)，并隨著葉片的伸展而不斷地發(fā)生、發(fā)育（圖1-2,3,8,9）。T.I.1068葉片上的腺毛具有1至多個腺頭細胞，皆為分泌型。其中，一種含有多個柄細胞，為長柄分泌型（A），另一種僅有單個柄細胞，為短柄分泌型（B）（圖1-2,3）。T.I.1112葉片上也有2種腺毛，一種具多個柄細胞，無腺頭細胞，為非分泌型腺毛（C），一種為短柄分泌型腺毛（B）（圖1-8,9）。T.I.1068莖上的腺毛為單一的長柄分泌型，隨著煙株發(fā)育腺頭逐漸增大、腺柄伸長，腺毛密度增加（圖1-4,5,6）。在T.I.1112莖上的腺毛最初類似于單腺頭的分泌型腺毛（圖1-10,11），但發(fā)育至6葉期時，則表現(xiàn)為典型的非分泌型保護毛形態(tài)（圖1-12）。單腺頭的分泌型腺毛可能是非分泌腺毛發(fā)育過程中出現(xiàn)的過度形態(tài)，這也說明對莖部腺毛類型的觀察應該在6葉期之后進行。

圖1 T.I.1068和T.I.1112腺毛形態(tài)觀察Fig.1 Trichome observation of T.I.1068 and T.I.1112

2.2 MeJA對T.I.1068腺毛發(fā)生的影響

在6葉期選取生長一致的T.I.1068幼苗，分別噴施濃度為1 mM、3 mM、5 mM的MeJA溶液，3周后對新生葉片和莖進行糖酯染色和腺毛形態(tài)觀察?？梢钥闯?，隨著MeJA濃度的逐漸升高，煙株生長并沒有明顯變化，但5 mM MeJA處理的煙苗有葉片發(fā)黃和早衰現(xiàn)象（圖2）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，T.I.1068葉面、莖上的腺毛皆為分泌型，腺頭部分可被羅丹明染成紅色，表明其含有較多的糖酯類化合物（圖3-1，5）。隨著MeJA濃度的升高，葉邊緣腺毛數(shù)量逐漸增多，腺頭的體積逐漸增大，著色也逐漸加深（圖3-2,3,4）。莖表面的腺毛隨MeJA濃度變化的趨勢與葉面腺毛一致。在5 mM MeJA處理下，莖表腺毛的密度、長度、腺頭大小及著色程度都達到了最高值（圖3-6,7,8）。另外，在所有的MeJA處理中，T.I.1068腺毛的類型都未發(fā)生改變，依然是由長柄和短柄的分泌型腺毛組成，并無非分泌型腺毛的產生。對葉上表皮腺毛密度統(tǒng)計也表明，隨著MeJA處理濃度的升高，長柄分泌型腺毛的密度逐漸增加，短柄腺毛密度變化不大且有隨MeJA濃度逐漸降低的趨勢，而非分泌型腺毛則完全缺失（圖4）。

圖2 MeJA處理對T.I.1068煙株生長的影響Fig.2 Influence of exogenous methyl jasmonate treatment on T.I.1068 growth

2.3 MeJA對T.I.1112腺毛發(fā)生的影響

選取生長一致的6葉期T.I.1112幼苗，分別噴施不同濃度的MeJA，3周后取新生葉片和莖進行糖酯染色和腺毛形態(tài)觀察。隨著MeJA濃度增加，T.I.1112幼苗的生長受到明顯抑制，5 mM MeJA處理的煙苗葉片明顯發(fā)黃、早衰（圖5）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，T.I.1112的腺毛大部分是非分泌型腺毛，不能被羅丹明染色表明其糖酯類化合物合成能力較弱（圖6-1,5）。從葉邊緣來看，MeJA處理后，腺毛數(shù)量雖無明顯變化，但腺毛類型發(fā)生了改變，新出現(xiàn)了能夠被羅丹明染色的長柄分泌型腺毛。而且，隨著MeJA濃度的升高，長柄分泌型腺毛的數(shù)量增加、著色程度加深（圖6-2,3,4）。在莖上，長柄分泌型腺毛同樣被MeJA所誘導，且隨MeJA濃度的升高而增多。在5 mM MeJA處理下，莖表面長柄分泌型腺毛的數(shù)量多、腺頭體積大且著色深（圖6-6,7,8）。對葉片上表皮腺毛密度的統(tǒng)計也表明，MeJA處理成功地誘導了長柄分泌型腺毛的發(fā)生，其密度隨MeJA濃度的提高而增加；與之相反，短柄分泌型腺毛密度稍有降低，而非分泌型腺毛的密度在MeJA處理前后無明顯變化（圖7）。

圖3 不同濃度外源MeJA處理對T.I.1068腺毛發(fā)生的影響Fig.3 Effect of different concentrations of exogenous methyl jasmonate on glandular trichome morphogenesis on T.I.1068

圖4 MeJA處理對T.I.1068葉面腺毛密度的影響Fig.4 Effects of methyl jasmonate treatment on leaf trichome density of T.I.1068

圖5 MeJA處理對T.I.1112煙株生長的影響Fig.5 Influence of exogenous methyl jasmonate treatment on T.I.1112 growth

圖6 不同濃度外源 MeJA處理對T.I.1112腺毛發(fā)生的影響Fig.6 Effect of different concentrations of exogenous methyl jasmonate on glandular trichome morphogenesis on T.I.1112

圖7 MeJA處理對T.I.1112葉片腺毛密度的影響Fig.7 Effects of methyl jasmonate treatment on leaf trichome density of T.I.1112

3 討論和結論

腺毛作為植物防御體系的重要組成部分，在阻礙病蟲害侵襲、耐受干旱、寒冷、紫外線等逆境脅迫中發(fā)揮著積極作用。煙草腺毛形態(tài)多樣、功能各異，對煙株抗性和煙葉品質具有較大影響[7，22-24]。因而，對煙草不同類型腺毛發(fā)生機制和影響因素的研究具有重要意義。

在非分泌型腺毛植物擬南芥中，關于JA對腺毛發(fā)生的促進作用已積累了充分的證據，其分子調控機制也逐步得以闡明[25]。純粹的分泌型腺毛植物在自然界中很稀少，大部分植物為混合型?；旌闲椭参镏蟹置谛拖倜c非分泌型腺毛共存，相互之間不可避免地存在復雜的競爭與抑制作用，使得研究難度加大。而各種腺毛突變體的應用，無疑有助于闡明混合型植物不同類型腺毛對JA的應答反應。分泌型番茄突變體hl經MeJA處理后，分泌型腺毛密度提高了85.7%，無非分泌型腺毛發(fā)生；非分泌型突變體wolly中，非分泌型腺毛密度提高了37.8%，分泌型腺毛無明顯變化；而在各自的野生型中，僅分泌型腺毛受到MeJA的誘導，非分泌型腺毛密度無明顯變化[26]。本研究對普通煙草分泌型突變體T.I.1068和非分泌型突變體T.I.1112進行MeJA處理，發(fā)現(xiàn)T.I.1068中長柄分泌型腺毛增加，短柄分泌型腺毛無明顯變化，無非分泌腺毛的發(fā)生；在T.I.1112中，非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛數(shù)量并無明顯變化，而原本不存在的長柄分泌型腺毛在MeJA的誘導下大量發(fā)生。這表明MeJA對煙草分泌型腺毛發(fā)生具有誘導作用，而對非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的發(fā)生并無顯著影響，這與栽培煙草“中煙100”的研究結果相一致[17]。由此看來，煙草、番茄等多細胞非分泌型腺毛與擬南芥的單細胞非分泌型腺毛不同，二者對JA信號的不同反應表明其調控機制存在一定差異；而煙草的長柄分泌型腺毛發(fā)生所表現(xiàn)出的對JA信號的敏感性，表明其與擬南芥非分泌型腺毛發(fā)生機制相似。最近，在青蒿研究中發(fā)現(xiàn)了HD-ZIP IV家族轉錄因子AaHD1，該基因受到JA信號的誘導并與Jasmonate ZIM-domain 8 (AaJAZ8)蛋白互作，正向調控分泌型腺毛的發(fā)生，證明分泌型腺毛與擬南芥非分泌型腺毛具有類似的調控機制[27]。但AaHD1對青蒿分泌型腺毛和非分泌型腺毛發(fā)生都具有促進作用，這與煙草和番茄又不相同。這充分說明了植物腺毛發(fā)生機制的復雜性，因此對多細胞非分泌型腺毛發(fā)生調控機制還需進一步研究。

JA對腺毛發(fā)生的影響具有一定的濃度效應。在本研究中，無論T.I.1068還是T.I.1112，腺毛的形態(tài)變化隨著MeJA處理濃度的提高而更加明顯。在5 mM MeJA處理中，T.I.1068腺毛密度、腺頭體積及著色深度都達最大值，T.I.1112中所產生的長柄分泌型腺毛數(shù)量最多、著色也最為明顯。Rowe等[28]也報道，低濃度MeJA（0.1 mM）對向日葵分泌型腺毛發(fā)生無影響，高濃度MeJA（1 mM）可引起分泌型腺毛密度增加，但不排除MeJA抑制葉片發(fā)育所產生的影響。前人研究發(fā)現(xiàn)，JA會影響植物的生長發(fā)育，如引起葉片早衰[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)用5 mM MeJA處理時，葉片表現(xiàn)出發(fā)黃、早衰的現(xiàn)象。為此，實驗中取小于5 cm的新生葉片進行觀察，基本可以忽略因葉片發(fā)育程度不同而產生的對腺毛密度的影響。

T.I.1068和T.I.1112是重要的普通煙草腺毛突變體類型，但其突變產生的原因還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)MeJA可以誘導T.I.1112長柄分泌型腺毛的發(fā)生，暗示該非分泌突變體的形成可能與JA生物合成途徑受阻有關，這些結果為解析煙草中最為重要的腺毛類型——長柄分泌型腺毛的發(fā)生調控機制奠定了基礎。煙草腺毛發(fā)生分子機制的解析，將有利于創(chuàng)制不同類型、不同密度的煙草腺毛育種模塊，可望通過對煙草葉面化學成分和含量的定向調控來實現(xiàn)對煙草品質和抗性的改良。

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