崔慶豐，李嫦娥，王 芳

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.秦皇島軍工醫(yī)院，河北 秦皇島 066000）

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。蛇床子素是一種提取自蛇床子的呋喃類香豆素化合物，能在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[1-3]。蛇床子素可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]，增強(qiáng)腎癌小鼠免疫系統(tǒng)功能，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[5]。但是蛇床子素在結(jié)腸癌中的作用需要進(jìn)一步研究。研究表明，Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/髓樣細(xì)胞分化因子88（myeloid differentiation factor，MyD88）/核因子κB（nuclear factor，NF-κB）信號(hào)通路在結(jié)腸癌中被激活，穿心蓮內(nèi)酯能通過(guò)抑制該信號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用[6]。本實(shí)驗(yàn)擬探討蛇床子素是否能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞系 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系（批號(hào)：FS-0374）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑 蛇床子素（純度≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB6894）；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：12634010）、胰蛋白酶（批號(hào)：25200-056）、胎牛血清（批號(hào)：6140079）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：C0009）；BCA試劑盒（批號(hào)：PC0020-500）、ECL發(fā)光液（批號(hào)：PE0010）均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人TLR4 抗體（批號(hào)：ab22048）、兔抗人MyD88 抗體（批號(hào)：ab133739）、兔抗人NF-κB抗體（批號(hào)：ab141406）、兔抗人GAPDH抗體（批號(hào)：ab8245）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗兔二抗（美國(guó)Biovision公司，批號(hào)：6903-250）。

1.3 主要儀器 SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；CKX-41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）；CLM-050B-8型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（青島佳鼎分析儀器有限公司）；MINI Space1000全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 常規(guī)培養(yǎng)SW480細(xì)胞至第3代，制備單細(xì)胞懸液，取200 μL接種于6孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別用含不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白孔（只加入培養(yǎng)基），培養(yǎng)24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，重新培養(yǎng)4 h后，加入二甲基亞砜150 μL，震蕩混勻，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=[（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）]×100%。

2.2 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細(xì)胞后，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，培養(yǎng)14 d，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗培養(yǎng)板2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，風(fēng)干后，計(jì)算各組細(xì)胞菌落數(shù)。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細(xì)胞后，制成單細(xì)胞懸液，密度為3×105/mL，取200 μL單細(xì)胞懸液接種于鋪滿基質(zhì)膠的上室中，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基，將小室置于培養(yǎng)箱中24 h后，取出小室，濕棉簽擦去多余未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)。

SW480細(xì)胞遷移能力測(cè)定：除Transwell上室中不鋪滿基質(zhì)膠外，其余操作同上。

2.4 蛋白印跡法檢測(cè)TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá) 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細(xì)胞24 h后，加入裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑=8 cm），提取細(xì)胞中總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性。120 V電泳2 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，室溫封閉1 h，分別加TLR4、MyD88和NF-κB抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光液顯影，Image J分析條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以（x±s）描述，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞存活率比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細(xì)胞存活率低于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低（P＜0.05）。（見表1）表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖。

表1 各組細(xì)胞存活率比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞存活率比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

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3.2 各組細(xì)胞菌落數(shù)比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細(xì)胞菌落數(shù)少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，細(xì)胞菌落數(shù)逐漸減少（P＜0.05）。（見表2、圖1）表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖。

圖1 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

表2 各組細(xì)胞菌落數(shù)比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞菌落數(shù)比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

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3.3 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組遷移細(xì)胞數(shù)少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P＜0.05）。（見表3、圖2）表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移。

圖2 結(jié)晶紫染色檢測(cè)遷移細(xì)胞數(shù) （×200）

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

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3.4 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組侵襲細(xì)胞數(shù)少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P＜0.05）。（見表4、圖3）表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲。

圖3 結(jié)晶紫染色檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù) （×200）

表4 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表4 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

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3.5 各組TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P＜0.05）。（見表5、圖4）表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)。

圖4 各組細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

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4 討論

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床上常采用手術(shù)、化療及靶向治療等方法治療本病，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，化療存在較大毒副作用，且仍存在預(yù)后效果差、患者生存率低等問(wèn)題。故探討結(jié)腸癌發(fā)生的具體機(jī)制、尋找有效的治療藥物具有重要意義[7]。

蛇床子素化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，又稱為甲氧基歐芹酚。蛇床子素具有抗炎、抗氧化及鎮(zhèn)痛等多種藥理學(xué)活性[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有廣泛的抗腫瘤活性。楊娟等[11]研究表明蛇床子素可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，且體內(nèi)研究表明蛇床子素可抑制裸鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)。蛇床子素可使前列腺癌LNCaP細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和衰老[12]。此外，蛇床子素可抑制舌鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞自噬，損傷細(xì)胞自噬途徑[13]。蛇床子素能通過(guò)促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，阻礙卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14]。由此可見，蛇床子素可通過(guò)多種途徑對(duì)惡性腫瘤發(fā)揮抑制作用，但是蛇床子素在結(jié)腸癌中的作用鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示：SW480細(xì)胞經(jīng)不同濃度蛇床子素處理后細(xì)胞存活率降低，平板克隆實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞菌落數(shù)隨蛇床子素濃度升高而減少，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)隨蛇床子素濃度升高而減少。以上結(jié)果表明蛇床子素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，普遍存在著TLRs家族。該家族屬于模式識(shí)別受體，行使著識(shí)別病原體相關(guān)模式分子的功能[15]。TLR4憑借特異性識(shí)別功能，使其能夠結(jié)合脂多糖（LPS）；TLR4活化對(duì)促進(jìn)固有免疫系統(tǒng)的抗原提呈細(xì)胞功能性成熟，并觸發(fā)促炎介質(zhì)釋放具有重要作用[16-18]；TLR4在細(xì)胞膜上識(shí)別并結(jié)合LPS后，LPS-TLR4復(fù)合物能在細(xì)胞膜啟動(dòng)MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，使級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生核移位進(jìn)入細(xì)胞核后，可調(diào)控早期炎癥介質(zhì)的合成分泌[19-21]。TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在惡性腫瘤中異常表達(dá)。LI C等[22]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路激活，降低宮頸癌炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)。姜黃素能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路降低腎細(xì)胞癌炎癥反應(yīng)，促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗腎細(xì)胞癌作用[23]。金剛烷連接的異硫脲衍生物能通過(guò)抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路抑制實(shí)驗(yàn)性肝癌生長(zhǎng)[24]。參苓白術(shù)散可降低Lewis肺癌小鼠TLR4、MyD88蛋白表達(dá)水平，增加Caspase-3蛋白表達(dá)水平，并能通過(guò)調(diào)控TLR4/MyD88通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。由此可見，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。因此，本研究通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)蛇床子素對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明：TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量隨蛇床子素濃度的升高逐漸降低，說(shuō)明蛇床子素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路激活。

綜上所述，蛇床子素可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其可能是通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。