基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探討脊髓傷方治療脊髓損傷的作用機制

莫怡，卜若晨，唐福波，秦百君，卜保獻，麥威，鐘遠鳴，卜獻忠

1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨傷科，廣西 南寧 530023；

2.海南醫(yī)學院，海南 ?？?570102；

3.河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)脊柱外科，河南 洛陽 471002；

4.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，廣西 南寧 530021

脊髓損傷(spinal cord injury，SCⅠ)是由于脊髓的形態(tài)結構和生理功能遭受到創(chuàng)傷、炎癥、缺血缺氧等損傷后，致使損傷脊髓平面以下的運動、感覺以及自主神經(jīng)功能出現(xiàn)不可逆轉性的障礙[1]。僅2001年在全球范圍內SCⅠ患病率為15～40例/1 000 000 人[2]，2014年在中國患病率可高達23.7～60.6 例/1 000 000 人，2018 年僅在美國約28.8 萬病例，同時每年新增加1.7 萬例SCⅠ病例[3]，給患者及家屬造成巨大的經(jīng)濟負擔和心理陰影[4]。

中醫(yī)藥在我國治療脊髓相關疾病歷史悠久，尤其是SCⅠ的治療已具有豐富的經(jīng)驗與較強優(yōu)勢[5]。SCⅠ歸屬于中醫(yī)理論“體惰”、“痿癥”的范疇，其主要病機應歸屬為經(jīng)絡瘀阻、陽氣不足[6]。補陽還五湯源自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯·下卷·癱痿論》，也是益氣活血通絡的經(jīng)典方劑。該方是由黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、紅花、地龍、桃仁等7味中草藥構成，臨床中常將其用于治療“半身不遂，遺尿不禁”等疾病。課題組前期研究表明補陽還五湯能夠有效地激活SCⅠ后脊髓細胞自噬水平，減輕SCⅠ后脊髓神經(jīng)元的損害程度，從而促進大鼠運動功能的恢復[7]。脊髓傷方是以補陽還五湯為基礎，加丹參、大黃、牛膝、血竭四味藥材而成，長期臨床應用發(fā)現(xiàn)該方可增強了原方的活血化瘀通絡之功，更加符合SCⅠ的病理特點，對頸髓神經(jīng)功能的恢復具有一定促進作用[8]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓傷方還可促進胸腰椎骨折并截癱患者的下肢運動功能恢復，改善患者的生存質量[9]。然而，脊髓傷方治療SCⅠ的分子作用機制尚不完全清楚。研究表明，脊髓局部缺血缺氧、神經(jīng)遞質興奮性中毒、脂質過氧化、自由基形成以及炎癥反應等因素參與SCⅠ疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，在上述因素的作用下誘發(fā)神經(jīng)元細胞死亡與軸突脫髓鞘，促進膠質瘢痕的形成，最終阻礙神經(jīng)細胞的再生與神經(jīng)功能的修復[10]。目前，關于SCⅠ傳統(tǒng)研究方式主要盲目地采用手術、藥物干預SCⅠ，以探討其臨床療效或某種作用機制。顯然，上述研究方式缺乏目的性及全局性。網(wǎng)絡藥理學是現(xiàn)代中藥學的前沿，也是一種通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的方法來分析中藥復方與疾病相關性的一門科學，其通過將中藥藥效物質基礎與疾病病理機制有機結合起來，充分發(fā)揮中醫(yī)藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路等特性，使相關研究更具有目的性、整體性，這與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念不謀而合[11]，也彌補了傳統(tǒng)研究方式的不足。因此，本研究旨在運用網(wǎng)絡藥理學方法探討脊髓傷方治療SCⅠ的有效活性成分、核心作用靶點以及相關生物信號通路與潛在作用機制，以期為今后開展相關臨床和實驗研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 脊髓傷方活性成分及其作用靶點篩選 通過檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Ⅰnfrastructure, CNKⅠ)(http://www.cnki.net)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Tradition Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Plaform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(Biological Activity Database of Small Organic Molecules，PubChem) (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫獲取脊髓傷方的中藥成分，并通過TCMSP、PubChem 等數(shù)據(jù)庫進行化合物確證。TCMSP標準：同時滿足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18分析。

1.2 脊髓損傷疾病靶點獲取 以“Spinal cord injury”為檢索詞，運用人類基因數(shù)數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database，GeneCard)(https://www.genecards.org/)且滿足Relevance score ≥10、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù) 庫(Online Mendelian Ⅰnheritance in Man，OMⅠM)(https://www.omim.org/)、治療靶標數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫檢索獲取與SCⅠ相關的疾病靶點，并與脊髓傷方的活性成分靶點進行匹配，獲取脊髓傷方治療SCⅠ的交集靶點。通過Venny 2.1 平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)平臺進行映射取交集，獲取中藥與疾病的交叉作用基因。

1.3 構建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡 先將脊髓傷方的有效活性成分及其治療SCⅠ的交集靶點輸入Cytoscape 3.7.2 軟件中，以構建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡。再運用Cytoscape 軟件中插件Network Analyzer 進行網(wǎng)絡拓撲學分析，分析參數(shù)如分析節(jié)點(Nodes)、連接度值(Degree)等，其中，以Degree 值直接篩選整個網(wǎng)絡中的最核心活性成分。

1.4 構建蛋白互作(Protein Protein Ⅰnteraction network，PPⅠnetwork)網(wǎng)絡 先將脊髓傷方治療SCⅠ的交集靶點輸入至STRⅠNG 在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，以物種選擇為“Homo sapiens”，置信度評分為“High confidence≥0.9”為條件進行PPⅠ網(wǎng)絡分析。再將網(wǎng)絡相關作用參數(shù)保存為“tsv”格式文件以及導入Cytoscape 3.7.2軟件，進而重新構建PPⅠ圖。最后運用Cytoscape 軟件中的CytoHubba插件功能對Degree值進行排序篩選，以獲得互作能力最強的前10個靶蛋白。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)功能及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)通路富集分析 將脊髓傷方治療SCⅠ交集靶點上傳于DAVⅠD 在線平臺(https：//david.ncifcrf.gov/)進行富集分析。以統(tǒng)計學顯著性閾值設置在P＜0.01時，篩選前20個條目，運用R語言軟件運行相關程序包和Metascape(https://metascape.org/)對分別核心靶點進行GO與KEGG 富集分析，以闡釋脊髓傷方中活性成分治療SCⅠ的生物功能和相關信號通路。

1.6 分子對接驗證 先將在“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡核心活性成分(Degree 值排名前5)與在PPⅠ網(wǎng)絡中潛在核心作用靶點(Degree 值排名前5)進行分子對接；再通過結構生物信息學蛋白質數(shù)據(jù)庫研究協(xié)作室數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)獲取關鍵靶點的三維結構，運用PyMOL 2.4.0 軟件去除溶劑分子與配體。然后采用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性化合物的三維結構，并運用AutoDockTools1.5.6 軟件進行加氫、加電子等相關操作。最后運用Autodock-Vina1.1.2 軟件進行分子對接。當分子結合能值＜-5 kJ/mol 時采用PyMOL 軟件進行可視化分析。

2 結果

2.1 脊髓傷方治療脊髓損傷的潛在作用靶點 先以OB、DL 作為條件篩選對TCMSP、PubChem、CNKⅠ數(shù)據(jù)庫進行檢索及剔重后，最終檢索到138 個活性成分，見表1 (僅列出前10 項)。通過TCMSP、PubChem數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應的靶點，剔重后收集到490個作用靶點，其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到296 個，Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫檢索到517 個。通過OMⅠM、TTD、GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索、剔重后共獲得SCⅠ相關疾病靶點830 個，其中OMⅠM 數(shù)據(jù)庫101 個、TTD 數(shù)據(jù)庫7 個、GeneCards 數(shù)據(jù)庫745 個。將SCⅠ相關疾病靶點與脊髓傷方的活性成分作用靶點映射后取交集，上述交集靶點可能是脊髓傷方治療SCⅠ的潛在作用靶點，見圖1。

表1 脊髓傷方主要活性成分的基本信息(前10項)Table 1 Basic information of main active ingredients for Jisuishang Formula(Top 10)

圖1 脊髓傷方活性成分作用靶與疾病相關靶點的韋恩圖Figure 1 Potential therapeutic targets and disease-related targets of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.2 脊髓傷方治療脊髓損傷的“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡 先將最終檢索到138個活性成分和111個潛在作用靶點上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件，初步構建脊髓傷方治療SCⅠ的“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡，并Degree值越大，得分越高，則代表圖形面積越大，相互連接的線條越粗，見圖2。上述網(wǎng)絡中共存在249節(jié)點和776條邊，776個節(jié)點中包括137個活性成分、111 個潛在作用靶點，每個靶點平均與7.0個化合物存在聯(lián)系，每個化合物平均對應5.7個靶點存在聯(lián)系，其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素與相關靶點聯(lián)系最緊密，分別與64、30、21、20、16個靶點相互作用，可能是脊髓傷方治療SCⅠ的核心活性成分。

圖2 脊髓傷方治療脊髓損傷的“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡Figure 2 The network of“active compounds-potential targets”of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.3 脊髓傷方治療脊髓損傷的PPⅠ(protein-protein interaction network analysis)網(wǎng)絡 先將脊髓傷方-SCⅠ共有蛋白基因導入STRⅠNG在線平臺以初步獲得PPⅠ網(wǎng)絡，其中上述網(wǎng)絡共存在111個節(jié)點，2 415條邊，平均degree：43.5，平均聚類系數(shù)：0.705 (圖3A)；再將PPⅠ網(wǎng)絡原始數(shù)據(jù)文件導入Cytoscape3.7.2 軟件，重新進行PPⅠ網(wǎng)絡拓撲分析，Degree 值越大，得分越高，則代表蛋白的圓越大，相互連接的線條越粗，顏色越暖(圖3B)；最后運行Cytoscape3.7.2 軟件中Cytohubba 插件，篩選degree 高于平均數(shù)的前10位靶點作為脊髓傷方-SCⅠ的核心靶點，最終獲取白蛋白(albumin，ALB)、白介素6 (interleukin-6，ⅠL-6)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、轉錄3的信號換能器和激活子(transcription 3，STAT3)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉錄因子AP-1 (transcription factor AP-1，JUN)、白介素1B (interleukin-1B，ⅠL1B)等核心靶點(圖3)。

圖3 脊髓傷方治療脊髓損傷的PPI網(wǎng)絡Figure 3 The protein-protein interaction network analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.4 GO 功能富集分析 GO 功能富集分析共獲取GO條目2 602個(P＜0.01)，其中生物過程(biological process，BP) 2 330 個、細胞組分(cellular composition，CC)146 個、分子功能(molecular function，MF)126 個，圖4。BP 主要涉及氧化應激反應(response to oxidative stress)、凋亡信號通路的調節(jié)(regulation of apoptotic signaling pathway)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節(jié)(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、脂多糖反應(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、磷酸化(phosphorylation)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)等生物過程。CC 富集分析結果發(fā)現(xiàn)，關鍵活性成分主要集中于薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、神經(jīng)元細胞體(neuronal cell body)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、血小板α顆粒(platelet alpha granule)、樹突細胞質(dendrite cytoplasm)等部位。MF富集分析結果發(fā)現(xiàn)，關鍵活性成分的生物學分子功能主要包含脫氧核糖核酸-結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、信號受體激活活性(signaling receptor activator activity)、信號受體激活活性(receptor ligand activity)、生長因子結合(growth factor binding)、蛋白激酶調節(jié)活性(protein kinase regulator activity)、整合素結合(integrin binding)等方面。

圖4 脊髓傷方治療脊髓損傷的GO通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.5 KEGG生物信號通路 將脊髓傷方治療SCⅠ的核心靶點上傳至Metascape(http://metascape.org/)平臺，以進行KEGG 通路富集分析，共獲得條179 生物信號通路路(P＜0.01)，最具有顯著性的前20條，其主要涉及糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路[advanced glycation end product(AGE)-receptor for AGE (RAGE) signaling pathway in diabetic complications]、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 信號通路[phosphoinositide 3- kinase (PⅠ3K)- protein kinase B(AKT) signaling pathway]、缺氧誘導因子-1 信號通路[hypoxia-inducible factor-1 (HⅠF-1) signaling pathway]、叉頭盒O 信號通路[forkhead box O (FoxO) signaling pathway]、阿佩林信號通路[apelin (AP) signaling pathway]、松弛素信號通路[relaxin(RLX)signaling pathway]、甲狀腺激素信號通路[thyroid hormone(TH)signaling pathway]等，見圖5。

圖5 脊髓傷方治療脊髓損傷的KEGG 通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.6 分子對接驗證 先將PPⅠ網(wǎng)絡中的核心靶點ALB、ⅠL6、AKT1、VEGFA、CASP3 與蛋白互作網(wǎng)絡圖中核心活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素進行分子對接。通常認為結合能＜-5.0 kJ/mol，則說明分子配體分子與受體蛋白對接良好，分子構像越穩(wěn)定。結果顯示所有分子對接的結合能范圍為-17.54 ～-41.01 kJ/mol，表明均具備良好調節(jié)蛋白活性的功能，見表2。再將上述最小結合能值導入GraphPad Prism 8 軟件，以構建熱圖，見圖6。其中木犀草素與AKT1 結合能最低為-41.01 kJ/mol，且槲皮素與AKT1 的結合能也均低于其他配體結合能，同時將木犀草素、槲皮素與AKT1對接結果進行可視化，見圖7。表明上述活性成分與潛在靶點的分子構像存在良好的穩(wěn)定性，它們可能是在脊髓傷方治療SCⅠ中發(fā)揮重要作用的關鍵靶點。

表2 脊髓傷方的關鍵活性成分與關鍵靶點對接的結合能Table 2 Binding energy of key active components and key target docking of Jisuishang Formula

圖6 脊髓傷方治療脊髓損傷的核心靶點、活性成分的最低結合能熱圖Figure 6 Minimum binding energy heat diagram of the key target and active ingredients of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

圖7 槲皮素、異鼠李素與AKT1蛋白分子對接結果Figure 7 Molecular docking results of quercetin,isorhamnetin,and AKT1 protein

3 討論

研究表明，補陽還五湯因具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、促進血管生新等藥理作用，現(xiàn)臨床中多用于治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[12]。諸多研究還表明，補陽還五湯能夠通過改善損傷脊髓缺血狀態(tài)、抑制炎癥反應、降低氧自由基介導的脂質過氧化反應、減少神經(jīng)細胞凋亡、促進脊髓細胞自噬、減少瘢痕形成等作用，以促進脊髓神經(jīng)的恢復[7，13]。本研究采用的脊髓傷方是由補陽還五湯加入丹參、大黃、牛膝、血竭四味藥材而構成，其治療SCⅠ的藥理作用更佳。丹參具有改善脊髓缺血狀態(tài)與脊髓微循環(huán)，抑制氧化應激反應的作用[14]；大黃具有減輕氧化應激損傷，抑制炎癥反應等作用，進而保護SCⅠ后殘存的神經(jīng)細胞和有髓神經(jīng)纖維[15]；牛膝能夠通過抑制腦組織中神經(jīng)炎癥增強神經(jīng)元活力[16]；血竭可以通過抑制內質網(wǎng)應激來抑制內質網(wǎng)應激誘導的線粒體功能障礙，從而對促進軸突再生和改善SCⅠ的運動功能發(fā)揮保護作用[17]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析了脊髓傷方治療SCⅠ的有效活性成分、核心作用靶點、相關生物信號通路，以揭示其潛在的分子作用機制。

本研究運用數(shù)據(jù)庫挖掘的方法，最終從脊髓傷方中篩選獲得138 個活性成分、111 個靶點，并通過構建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡，分析獲得核心活性成分主要包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素。由此推測，上述活性成分可能是脊髓傷方治療SCⅠ的核心藥效物質基礎。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，其能夠通過抑制Toll 樣受體4/核因子-κB 信號通路減少腫瘤壞死因子-α和ⅠL-1β的產(chǎn)生，上調B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達，下調裂解的CASP3的表達，進而抑制炎癥反應、細胞凋亡、脊髓空洞的形成以及膠質瘢痕增生[18]，還能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化，抑制受損脊髓膠質瘢痕的形成，促進受損脊髓組織中軸突再生[19]。木犀草素作為一種天然的多酚類類黃酮化合物，其通過有效增強抗氧化活性，緩解了線粒體腫脹，抑制SCⅠ后促炎細胞因子的釋放與脊髓神經(jīng)細胞的凋亡等作用，進而減輕脊髓病理損傷的程度[20-21]。山奈酚是一種重要的黃酮類化合物，其能夠通過下調活性氧依賴性MAPKs-NF-κB和慢視信號通路以抑制氧化應激和炎癥反應，從而促進SCⅠ后下肢運動功能的修復[22]。漢黃芩素素具有顯著的抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、保護神經(jīng)等多種特性，其通過抑制STAT3信號通路能夠抑制炎癥和細胞凋亡，進而發(fā)揮保護SCⅠ的作用[23]。β-胡蘿卜素(Beta-carotene)素是類胡蘿卜素之一，其通過抑制/核因子-κB信號通路途徑激活，能夠減輕腫瘤壞死因子-α、ⅠL-1β、環(huán)加氧酶-2的表達量，進而抑制脊髓中星形膠質細胞的活化，同時下調丙二醛、一氧化氮和超氧化物歧化酶的表達，緩解SCⅠ誘導的氧化應激，最終有效地減少了SCⅠ后繼發(fā)性損傷事件的惡性進展[24]。

本研究通過對脊髓傷方治療SCⅠ的潛在作用靶點PPⅠ網(wǎng)絡拓撲分析及篩選，獲取到ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、EGF、JUN、ⅠL1B 以及STAT3等潛在核心靶點。膠質細胞活化、脊髓膠質瘢痕的形成、軸突再生障礙、神經(jīng)元凋亡等在SCⅠ的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。白蛋白(ALB)是星形膠質細胞產(chǎn)生油酸(oleic acid，OA)所必需的，經(jīng)ALB-OA治療后能夠抑制NR1 NMDA 受體磷酸化和小膠質細胞反應性，促進樹突與軸突生長，增加背角和腹角內的血清素纖維神經(jīng)支配區(qū)[25-26]。小膠質細胞極化伴M1/M2 表型偏移是SCⅠ誘導的繼發(fā)性損傷的重要促成因素，通過STAT1介導的核因子-κB 信號途徑乙酰化調節(jié)小膠質細胞極化能夠下調ⅠL-1β、ⅠL-6等促炎因子的表達水平，從而減弱炎癥反應，起到神經(jīng)保護的作用[27]。信號通路中的AKT1在神經(jīng)元凋亡中起著重要作用，上調AKT1的表達能夠有效減輕神經(jīng)損傷，抑制軸突變性[28]。VEGFA被認為與血管生成，神經(jīng)發(fā)生和運動能力的改善有關，通過增加VEGFA、血小板衍生生長因子B、血管生成素-1的表達量，可以增加內皮細胞和周細胞的增殖和存活率，進而發(fā)揮促進SCⅠ后軸突再生的作用[29]。CASP-3 是Caspases 家族中最重要的細胞凋亡執(zhí)行者之一，其在SCⅠ發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過降低CASP-3表達量，可以降低脊髓細胞的凋亡水平，從而發(fā)揮促進自發(fā)排尿和運動功能恢復的作用[30]。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，脊髓傷方治療SCⅠ的主要通路GE-RAGE 信號通路、PⅠ3K-AKT 信號通路、HⅠF-1信號通路等信號通路。AGE修飾的周圍神經(jīng)髓鞘能夠促進神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘，當晚期糖基化終產(chǎn)物對主要軸突細胞骨架蛋白的修飾時能夠引起軸突變性和軸突轉運受阻，AGEs 和AGE/RAGE 相互作用下可誘導氧化應激、誘導促炎反應，進而導致節(jié)段性脫髓鞘以及軸突功能障礙，故有效地調節(jié)AGEs-RAGE軸在緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制中起關鍵作用[31-32]。PⅠ3K-AKT 軸是調控脊髓細胞自噬、凋亡、炎癥反應、氧化應激反應的重要信號通路之一，有效地調控PⅠ3K-AKT軸能夠上調脊髓組織中自噬相關基因6、Bcl-2的表達水平，下調CASP-3、ⅠL-6、ⅠL-1β、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PⅠ3K)、AKT的表達水平，進而發(fā)揮保護SCⅠ的作用[33-34]。缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HⅠF-1)參與了SCⅠ后新生血管形成、細胞凋亡、細胞自噬、軸突再生等生理病理過程，激活HⅠF-1 信號通路可誘導脊髓細胞自噬，抑制細胞凋亡，改善神經(jīng)生存的微環(huán)境，最終發(fā)揮促進神經(jīng)軸突再生的作用[35]，當激活HⅠF-1/VEGF 信號通路時能夠促進SCⅠ后新生血管形成、改善缺氧缺血狀態(tài)，進而促進大鼠SCⅠ后神經(jīng)功能的修復[36]。骨骼肌萎縮是嚴重SCⅠ的標志，由神經(jīng)損傷和麻痹誘發(fā)。叉頭轉錄因子(forkhead box O，F(xiàn)oXO)的哺乳動物叉頭成員參與各種信號通路，F(xiàn)oxO信號通路與肌細胞凋亡、骨骼肌自噬和萎縮有關，說明FoxO信號通路可能參與了SCⅠ后骨骼肌萎縮的進展過程[37]。阿佩林(apelin，AP)一種結合G蛋白偶聯(lián)受體血管緊張素樣受體1 的內源性配體，有效地調控Apelin 信號通路能夠抑制脊髓細胞氧化應激反應、細胞自噬、炎癥反應(小膠質細胞和星形膠質細胞的活化)，對SCⅠ具有一定保護作用[38-39]。松弛素(relaxin，RLX)被認為是一種卵巢多肽激素,其通過調控PⅠ3K-AKT 信號通路能夠增加交感神經(jīng)活動[40]，進而誘發(fā)腦室旁核中棘突神經(jīng)元的激活[41]，這也可能是其對脊髓神經(jīng)元細胞發(fā)揮了激活作用。少突膠質細胞凋亡和存活軸突的脫髓鞘是SCⅠ繼發(fā)損傷的重要因素之一。研究表明，甲狀腺素信號(thyroid hormone，TH)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能發(fā)揮著至關重要的作用，當良性調控TH信號通路時能夠增強SCⅠ后的少突突形成和髓鞘形成[42]。

分子對接結果顯示，PPⅠ網(wǎng)絡中ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3與脊髓傷方中槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素相互之間的分子對接的結合能范圍為-17.54 ～-41.01 kJ/mol，均小于-5.0 kJ/mol。其中，槲皮素、異鼠李素均與AKT1之間存在較強的親和力。因此，筆者認為上述化合物與上述靶點蛋白的分子構象存在較好的穩(wěn)定性及結合活性，但其余化合物對于SCⅠ的治療活性究竟如何還需要更深入探討，并佐以生物實驗進行驗證。

綜上所述，脊髓傷方可能是通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素等核心活性成分，作用于ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、EGF、JUN、ⅠL1B 以及STAT3 等潛在核心靶點，進而參與細胞對氧化應激反應、凋亡信號通路的調節(jié)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節(jié)、細胞對化學應激的反應等生物過程，最終通過調控AGE-RAGE、PⅠ3K-AKT、HⅠF-1、FoxO、AP、RLX、TH等信號通路，發(fā)揮治療SCⅠ的作用。本研究通過利用網(wǎng)絡藥理學分析了脊髓傷方治療SCⅠ的潛在有效成分、靶點蛋白、信號通路及相關分子作用機制，進一步證實了中藥復方能夠從多靶點、多通路干預疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后，為我們研究中醫(yī)藥干預SCⅠ提供了新的理論依據(jù)和實驗基礎。