臍橙根際解磷菌的分離鑒定及全基因組測序分析

郭小丹 唐珊 余水靜

摘要：高效解磷菌的分離，可促進(jìn)實用型生物肥料的開發(fā)，是實現(xiàn)對作物的可持續(xù)性供磷以維護(hù)環(huán)境健康與土壤生產(chǎn)力的有力保障。以江西省贛州市某果園臍橙根際土壤作為試驗材料，用平板篩選法篩選分離12株具有解磷能力的菌株，并結(jié)合鉬銻抗比色法評估分離菌株的解磷能力，最終篩選出3株解磷菌（菌株編號為QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04），這些菌株表現(xiàn)出高溶磷指數(shù)（范圍為1.71～2.50）、強(qiáng)解磷能力（范圍為280.75～317.48mg/L）、低pH值（范圍為4.08～4.77）。結(jié)果顯示，pH值與解磷量呈負(fù)相關(guān)，表明酸化是3株解磷菌解磷的主要機(jī)制。對解磷能力最強(qiáng)的QCGJ-B01進(jìn)行全基因組測序分析，并基于管家基因鑒定得出，QCGJ-B01是新洋蔥伯克霍爾德菌。全基因組數(shù)據(jù)顯示，QCGJ-B01的基因組大小為8127322bp，G+C含量為66.98%，預(yù)測到7425個基因，所有預(yù)測和注釋的基因序列都分配到KEGG通路中，檢測了有機(jī)酸合成與磷酸鹽代謝相關(guān)基因。本研究發(fā)現(xiàn)，QCGJ-B01具有無機(jī)磷增溶基因（gdh、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gltA）和磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因（pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運蛋白的基因，可能使其無法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。QCGJ-B01高效的解磷能力有益于將其用作生物肥料，并且其全基因組數(shù)據(jù)有助于更好地理解其解磷性狀的遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：臍橙；根際解磷菌；篩選分離；解磷能力；全基因組測序

中圖分類號：S154.3；S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0039-09

磷（P）是植株生長發(fā)育必需的養(yǎng)分之一，在植株的干質(zhì)量中占比約0.2%［1］。磷素不僅參與生物大分子的合成（核酸、ATP、酶、磷脂），也對植物的各種生命活動（呼吸作用、光合作用和信號傳導(dǎo)）起著積極作用［2-4］。土壤中的總磷含量約占0.05%，可供植物吸收的有效磷含量則只占總磷含量的01%［5］，這與磷元素易被固定并且移動性極差有關(guān)［6-7］。土壤中磷素儲備的匱乏通常通過施加大量磷肥來彌補(bǔ)，可以保證作物吸收到充足的磷，以營求更高的產(chǎn)量，但是實際上作物對磷肥的利用率僅有5%～25%［8-9］，這是由于磷肥中的可溶性磷易與土壤中的陽離子（Ca2+、Fe3+、Al3+或Zn2+）結(jié)合而沉淀，與土壤固相表面（碳酸鈣、氧化鋁、氧化鐵和硅酸鋁）相互作用而被吸附，且易被其他土壤生物吸收轉(zhuǎn)化成有機(jī)磷而固定［10-11］，使得磷肥中70%～90%的可溶性磷都無法被植株吸收利用［12］。磷肥的大量施用也將導(dǎo)致環(huán)境污染問題，如有毒元素（硒、砷）的積累、土壤養(yǎng)分失衡甚至進(jìn)入地下水體引起水體富營養(yǎng)化［13-15］。為了避免使用磷肥帶來的負(fù)面影響，尋求一種環(huán)境友好、資源節(jié)約且可持續(xù)為作物供磷的方法意義重大。

解磷菌（phosphatesolubilizingbacteria，PSB）可通過酸解、酶解、呼吸作用和NH+4同化作用等方式將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化成有效磷，并且能防止釋放出的有效磷再次轉(zhuǎn)化成難溶性磷［16-18］。因此，將PSB作為化學(xué)磷肥的替代品，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。PSB可以分泌低相對分子量的有機(jī)酸（檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、草酸、葡萄糖酸等），而有機(jī)酸在環(huán)境基質(zhì)中自由擴(kuò)散，通過降低pH值和絡(luò)合金屬陽離子，能夠把土壤中的不溶性無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化成植物可利用的游離態(tài)磷酸鹽離子［19］。篩選出高效PSB并將其作為生物肥料回接入土壤中是促進(jìn)作物生長和提高作物產(chǎn)量的有效方法［20］。在過去幾十年里，研究者從土壤和植物根際分離了大量PSB，如假單胞菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、固氮菌屬、根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬、克雷伯氏菌屬和微球菌屬等菌株都是土壤中常見的高效PSB［8，21-22］。

基因的研究不僅能在更深層次理解生物個體的特殊性，也有助于揭示生物特殊功能的作用機(jī)制［23］。通過對菌株的全基因組測序可以獲得菌株的基因組序列，以此來注釋其重要的基因和蛋白，進(jìn)一步了解其功能、作用及調(diào)控機(jī)制。全基因組測序是目前研究微生物進(jìn)化和遺傳等機(jī)制及主要功能基因的關(guān)鍵工具［24］。眾多微生物都有解磷特性，但目前并沒有發(fā)現(xiàn)特異的解磷基因。關(guān)于提升PSB解磷能力的研究大多集中于篩選條件的選擇和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。本研究基于篩選的高效解磷菌株的全基因組序列，對菌株的磷代謝途徑和溶磷有關(guān)基因進(jìn)行分析，明確其功能和作用及調(diào)控機(jī)制，以期為探究其解磷性狀和遺傳背景提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1土樣采集

土壤樣品于2021年10月采自江西省贛州市某臍橙果園（地理位置：26°12′30″N，115°11′11″E），將果園劃分成6個區(qū)域，每個區(qū)域選取5棵優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)且對應(yīng)樹齡在10年以上的臍橙樹進(jìn)行取樣。在選定的臍橙樹滴水線區(qū)域向下挖20～30cm深度采集根際土壤，將采集的土壤樣品收納在滅菌塑料袋中，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2解磷菌的篩選

平板初篩：稱取5g過30目篩的土樣，加入95mL無菌水中，搖床振蕩30min（30℃，180r/min）制備母液。采用梯度稀釋法稀釋母液，取連續(xù)稀釋所得土壤懸浮液（稀釋倍數(shù)為103、104、105）100μL涂布到以磷酸三鈣（TCP）為唯一磷源的無機(jī)磷（IP）瓊脂培養(yǎng)基［含有10.00g/L葡萄糖、0.50g/L（NH4）2SO4、0.30g/LMgSO4·7H2O、0.30g/LNaCl、0.30g/LKCl、0.03g/LFeSO4·7H2O、0.03g/LMnSO4·H2O、5.00g/LCa3（PO4）2、5.00g/L瓊脂，pH值為7.0～7.5］上［25］。每個處理設(shè)3次重復(fù)，于（30±1）℃培養(yǎng)7d。出現(xiàn)清晰透明圈的菌落即認(rèn)為是具有溶解難溶性磷酸鹽能力的菌株［26-27］。將選中的菌株單獨以劃線法在IP瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)2～3代，純化后的菌落接種在IP斜面培養(yǎng)基上，于4℃保存以備進(jìn)一步的研究使用。

1.3菌株的溶磷能力分析

1.3.1菌株解磷能力的定性分析將分離所得菌株點接于IP瓊脂培養(yǎng)基上，在（30±1）℃培養(yǎng)7d，每個菌株設(shè)3次重復(fù)。隨著菌落的生長，其周圍逐漸出現(xiàn)的透明區(qū)域代表TCP發(fā)生溶解。溶磷指數(shù)（SI）=透明圈直徑（D）/菌落直徑（d），用SI初步評估不同菌株的解磷能力［28］。

1.3.2菌株解磷能力的定量分析用LB液體培養(yǎng)基活化解磷菌株來制備菌懸液（D600nm=0.7），按照2%的接種量接入裝有IP液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）的錐形瓶中。搖床培養(yǎng)［（30±1）℃，180r/min］7d后取樣，在6000r/min離心20min，取上清液，用鉬銻抗比色法測定上清液中的有效磷濃度［29］。每個處理重復(fù)3次，并以接種等量無菌水的IP液體培養(yǎng)基作為空白對照（CK）。

1.4菌株7d動態(tài)溶磷量和pH值的測定

有效磷濃度的測定方法同“1.3.2”節(jié)，pH值用pH計測定，每24h測定1次，連續(xù)測定7d。

1.5全基因組的測序和注釋

基于denovo測序技術(shù)對QCGJ-B01基因組進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)手段從頭組裝得到基因組序列。采用二代+三代即IlluminaHiseq+PacBio的測序方式，要求每個樣品同時提供不低于基因組100倍的PacBio測序數(shù)據(jù)和100×Illumina測序數(shù)據(jù)，保證更完整更精確的組裝，得到細(xì)菌基因組完成圖。用FastQC、Trimmomatic（Version0.36）等軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，用SOAPdenovo（Version2.04）完成基因組的組裝，用Glimmer（Version3.02）、barrnap（Version0.9）、tRNAscan-SE（Version2.0）等軟件對基因組進(jìn)行預(yù)測，用CGView（Version2）軟件構(gòu)建圈圖，對解磷菌株QCGJ-B01的基因組進(jìn)行展示。對預(yù)測和注釋的基因序列進(jìn)行分析，并根據(jù)與KEGG途徑的比較，通過人工檢查分配的基因功能，以確定有機(jī)酸合成和磷代謝途徑的存在。全基因組測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

基于菌株的31個管家基因（house-keepinggenes：dnaG、frr、infC、nusA、pgk、pyrG、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplK、rplL、rplM、rplN、rplP、rplS、rplT、rpmA、rpoB、rpsB、rpsC、rpsE、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsM、rpsS、smpB、tsf）序列，基于Blast+軟件在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的本地數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，選擇在種屬水平上最接近的19株菌株，通過MEGA6.0軟件選擇鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6統(tǒng)計分析

每個處理均設(shè)3次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1解磷菌的分離和篩選

將來自臍橙根際的菌株接種到IP瓊脂培養(yǎng)基上，菌株是否能生長與其能否利用TCP形式的無機(jī)磷有關(guān)。從平板上生長的66個菌落中挑取12個菌落結(jié)構(gòu)獨特的菌株，發(fā)現(xiàn)其周圍均產(chǎn)生了清晰的透明圈，這是由于菌落周圍區(qū)域的劇烈酸化導(dǎo)致TCP溶解。選擇其中4個菌落及其透明圈展示在圖1中。

由表1可以看出，12株P(guān)SB在菌落的形態(tài)特征上均有差異，根據(jù)菌落形態(tài)特征不同，認(rèn)為這12株菌株屬于不同菌種。這些分離株在IP瓊脂培養(yǎng)基上生長7d后，形成了大小明顯不同的透明圈和菌落。由表2可以看出，各菌株表現(xiàn)出不同的解磷能力，各菌株的溶磷指數(shù)（SI）范圍為1.048～2.500，其中QCGJ-B01的SI最大（2.500），其次是QCGJ-B04（2.043）和QCGJ-B02（1.706）。QCGJ-B04的透明圈直徑（2.35cm）和菌落直徑（1.15cm）都最大。

7d解磷量是評價菌株溶磷能力的又一個重要指標(biāo)。用IP液體培養(yǎng)基對12株解磷菌的進(jìn)一步篩選試驗結(jié)果（圖2）顯示，12株P(guān)SB的解磷量為6411～303.14mg/L，菌株QCGJ-B01具有最高的TCP溶解能力（解磷量為303.14mg/L），其次是QCGJ-B02（解磷量為280.84mg/L）。2個試驗結(jié)果均顯示，解磷菌株QCGJ-B01的解磷能力最強(qiáng)，其次是QCGJ-B02，而QCGJ-B04產(chǎn)生了直徑最大的透明圈和菌落，但其7d解磷量卻最低（64.11mg/L）。因此，將QCGJ-B01與QCGJ-B02、QCGJ-B04共3株P(guān)SB共同加入下部分試驗中。

2.23株P(guān)SB7d的動態(tài)解磷量和pH值

對菌株7d的動態(tài)解磷量和pH值的測定有助于進(jìn)一步了解菌株的解磷能力和明確有效磷濃度與pH值之間的相關(guān)性，從而初步判斷酸化是否是菌株解磷的主要策略。在7d培養(yǎng)過程中，3株P(guān)SB培養(yǎng)基中的有效磷濃度和pH值的變化見圖3?？梢钥闯?，隨著菌株解磷量的上升，pH值也隨之下降。菌株QCGJ-B01在培養(yǎng)48h達(dá)到最大解磷量（317.48mg/L）和最低pH值（4.08）。菌株QCGJ-B02在培養(yǎng)96h達(dá)到最大解磷量（283.50mg/L）和最低pH值（4.77）。菌株QCGJ-B04在培養(yǎng)24h達(dá)到最大解磷量（280.75mg/L）和最低pH值（443）。表明菌株通過分泌有機(jī)酸降低培養(yǎng)基pH值，釋放了大量有效磷。3株菌株在培養(yǎng)前24h解磷量的增速最快，培養(yǎng)24h后QCGJ-B01、QCGJ-B02菌株解磷量的增速放緩，達(dá)到最大值后有小幅度波動。與以上2株菌株不同的是，QCGJ-B04的解磷量在培養(yǎng)24h時達(dá)到最大值后便急劇下降，甚至比空白對照（CK）的解磷量（22.4mg/L）更低。QCGJ-B04的pH值也在培養(yǎng)24h后急劇上升，最高達(dá)8.25，高于空白對照的pH值（7.10）。在空白處理中檢測到很少的可溶性磷，pH值也十分穩(wěn)定，與初始pH值（7.08）相差不大。由圖4可知，解磷量與pH值間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r2=0.9433）。

2.3全基因組序列分析

2.3.1基因組特征與種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析測序結(jié)果顯示，菌株QCGJ-B01的基因組大小為8127322bp，G+C含量為67.58%，基因組特征的細(xì)節(jié)展示在圖5中。預(yù)測的QCGJ-B01基因總數(shù)為7425個，包括66個tRNA和4個rRNA編碼基

因。16SrRNA基因序列在同一細(xì)菌物種中高度保守，因此它們經(jīng)常用于識別和分類微生物。為了鑒定QCGJ-B01，使用BLASTn將16SrRNA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，通過比對發(fā)現(xiàn)，QCGJ-B01與洋蔥伯克霍爾德菌的相似性高達(dá)99.929%，QCGJ-B01與伯克霍爾德菌屬其他菌種的相似性匹配度也較高（99.788%～99.929%）。上述分析結(jié)果表明，菌株QCGJ-B01屬于洋蔥伯克霍爾德菌群，該菌群有不少于20種菌種，包括Burkholderiaanthina、新洋蔥伯克霍爾德氏菌（B.cenocepacia）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（B.cepacia）、污染伯克霍爾德氏菌（B.contaminans）、B.lata、吡咯伯克霍爾德菌（B.pyrrocinia）和穩(wěn)定伯克霍爾德菌（B.stabilis）等。16SrRNA基因無法清楚地區(qū)分洋蔥伯克霍爾德菌群中的菌種，而使用管家基因可以更好地輔助細(xì)菌物種的分類，并且已經(jīng)由許多研究證實［30］。因此，本研究基于管家基因創(chuàng)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹通過鄰接法獲得相關(guān)分類群的代表性菌株。由圖6可以看出，QCGJ-B01和新洋蔥伯克霍爾德菌（B.cenocepacia）的親緣關(guān)系最接近，序列相似性達(dá)99.2%。

2.3.2有機(jī)酸合成與磷代謝基因分析QCGJ-B01有許多與有機(jī)酸合成和磷酸鹽代謝有關(guān)的基因，賦予菌株相關(guān)性狀的基因見表3。葡萄糖酸（GA）被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)菌中負(fù)責(zé)溶解無機(jī)磷酸鹽的主要有機(jī)酸之一［31］。GA可由醌蛋白葡萄糖脫氫酶（GDH）及其輔因子吡咯喹啉醌合成蛋白（PQQ）共同作用而合成。QCGJ-B01是一株高效解磷菌株，基因組分析結(jié)果表明，QCGJ-B01具有編碼GDH的基因，并攜帶氧化還原輔因子pqq基因，包括pqqB、pqqC、pqqD、pqqE基因，缺乏pqqA基因。

pqqA是一種由24個氨基酸組成的短肽，是轉(zhuǎn)化為PQQ的前體［32］。但Toyama等的研究發(fā)現(xiàn)，在甲基桿菌PQQ的生物合成過程中，由pqqA編碼的酶是非必需的［33］。此外研究者還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有檸檬酸合成酶基因（gltA）。許多研究結(jié)果表明，磷酸酯的礦化是土壤有效磷的又一個主要來源，它是一種有機(jī)磷化合物，包含1個碳—磷（C—P）鍵，而不是眾所周知的磷酸酯鍵（C—O—P）［34］。phn基因簇指導(dǎo)合成的碳—磷鍵裂解酶可使菌株將磷酸酯水解成磷酸鹽和烷烴。QCGJ-B01具有phnA、phnB、phnW基因，其中phnA是膦酰乙酸降解所必需的，但是它缺失了大部分合成碳—磷鍵裂解酶復(fù)合物所需的基因，包括phnE～phnO，表明QCGJ-B01可能缺乏礦化磷酸酯的能力。

細(xì)菌對一般是通過質(zhì)膜上特定的磷化合物轉(zhuǎn)運蛋白完成對磷的吸收，包含通過pstS、pstC、pstA、pstB編碼基因合成的無機(jī)磷酸鹽特異性轉(zhuǎn)運蛋白和通過phnE、phnD、phnC編碼基因合成的磷酸酯轉(zhuǎn)運蛋白。QCGJ-B01具有pstS、pstC、pstA、pstB基因但未攜帶phnE、phnD、phnC基因，pstS、pstC、pstA、pstB編碼基因的激活受到磷缺乏響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的控制。QCGJ-B01的磷缺乏響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)由雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)phoR（磷酸鹽調(diào)節(jié)感應(yīng)激酶）-phoB（磷酸鹽調(diào)節(jié)反應(yīng)調(diào)控子）控制［35］。phoR通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子phoB來響應(yīng)磷酸鹽的缺乏，然后phoB與稱為phoBOX的DNA序列結(jié)合，以激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。除此之外，還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有phoU基因，phoU是一種金屬結(jié)合蛋白，是在磷充足時進(jìn)行phoB的去磷酸化所必需的，以避免不受控制的磷酸鹽攝?。?5］。

3討論

本研究以臍橙根際土壤為材料分離解磷菌，這是因為與非根際土壤相比，根際土壤中的PSB種群數(shù)量要高得多［36］。本研究分離出了12株菌落周圍能產(chǎn)生透明圈的菌株。根據(jù)溶磷指數(shù)（SI＞1.5）和解磷能力（7d溶磷量＞250mg/L）指標(biāo)，篩選出了3株最佳菌株（QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04），其中菌株QCGJ-B01的溶磷指數(shù)最大（SI=2.500）且解磷量最高（317.48mg/L）。進(jìn)一步對3株菌株在7d中的動態(tài)解磷量和pH值變化進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01、QCGJ-B02的pH值分別在48、96h降到最小值，解磷量達(dá)到最大值，隨后在一個范圍內(nèi)波動，總體呈下降的趨勢。這是由于菌株在適宜的pH值范圍內(nèi)才會展現(xiàn)出最佳的解磷活性，而偏酸性的環(huán)境不適合菌株的生長，所以當(dāng)pH值下降到一定程度時，解磷過程將會受到限制，這與Qian等的試驗結(jié)果［37］一致。QCGJ-B04與QCGJ-B01、QCGJ-B02的表現(xiàn)不同，在24h達(dá)到最大解磷量和最小pH值后，解磷量急劇下降，pH值急劇上升，隨后一直處于低溶磷量、高pH值的狀態(tài)。Pérez等也發(fā)現(xiàn)了類似的情況，這是因為菌株生長迅速，在培養(yǎng)基中達(dá)到了高細(xì)胞密度，因此需要消耗大量磷來維持菌株的生長［38］。而且QCGJ-B04在IP瓊脂培養(yǎng)基上表現(xiàn)出了比其他菌株更大的菌落。上述結(jié)果都證明QCGJ-B04生長迅速，消耗了大量有效磷。菌株在細(xì)菌生長過程中，pH值的下降伴隨著培養(yǎng)基中可溶性磷含量的上升，pH值的（4.08）最低值與最高的溶磷量（317.48mg/L）同時出現(xiàn)?？扇苄粤缀颗cpH值呈負(fù)相關(guān)（r2=0.9433）。這與Chen等的研究結(jié)果［39-40］一致。pH值的下降可能是由于有機(jī)酸的產(chǎn)生，表明酸化是該菌株溶解難溶性磷酸鹽的主要策略［41-42］。

有研究發(fā)現(xiàn)，土壤中的PSB數(shù)量十分可觀，無論是好氧菌株還是厭氧菌株均有被發(fā)現(xiàn)，如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬、無色桿菌屬、農(nóng)桿菌屬、微球菌屬等，并且新的PSB菌株也在不斷涌現(xiàn)。本研究對解磷能力最強(qiáng)的菌株QCGJ-B01進(jìn)行了全基因組測序，通過菌種鑒定，確定QCGJ-B01為新洋蔥伯克霍爾德菌株（B.cenocepacia）。B.cenocepacia是一種高GC含量的革蘭氏陰性菌，因其具有多條染色體、基因組島和大量插入序列，使其基因組具有高可塑性［43-44］。伯克霍爾德氏菌屬在許多研究中被發(fā)現(xiàn)具有溶解難溶性磷酸鹽的能力，但良好的磷酸鹽溶解能力不是新洋蔥伯克霍爾德菌的普遍性狀［45-50］。葡萄糖酸是革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)最多的關(guān)于溶解難溶性磷酸鹽的基因，研究發(fā)現(xiàn)B.cenocepaciaQCGJ-B01具有編碼gdh的基因，并攜帶氧化還原輔因子pqq基因［51-52］。You等分離出的B.cenocepaciaCR318中的醌蛋白葡萄糖脫氫酶編碼基因缺失并表現(xiàn)出更低的溶磷指數(shù)（SI=2.00）［50］，表明負(fù)責(zé)葡萄糖酸合成的基因可能是提升新洋蔥伯克霍爾德菌解磷能力的關(guān)鍵因素之一。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有檸檬酸合成酶基因（gltA），增強(qiáng)了菌株分泌有機(jī)酸的能力，從而增加了難溶性磷酸鹽的可用性。QCGJ-B01還攜帶pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU基因，QCGJ-B01通過基因組pstS、pstC、pstA、pstB負(fù)責(zé)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)部分吸收無機(jī)磷酸鹽。B.cenocepaciaQCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因（phnE～phnO）和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運蛋白的基因（phnE、phnD、phnC），可能使其無法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。目前，關(guān)于具有溶解磷酸鹽能力的新洋蔥伯克霍爾德菌的全基因組測序鮮有報道，本研究數(shù)據(jù)可能有助于更好地理解這一性狀的遺傳基礎(chǔ)。

4結(jié)論

經(jīng)過篩選分離，本研究得到3株解磷能力尤其突出的菌株QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04，它們在釋放大量有效磷的同時也降低了溶液pH值，初步確定酸化是其主要溶磷機(jī)制。此外，本研究得到了QCGJ-B01全基因組序列，其基因組大小為8127322bp，G+C含量為67.58%，預(yù)測到7425個基因，包括66個tRNA和4個rRNA編碼基因?；诠芗一蜩b定QCGJ-B01為新洋蔥伯克霍爾德菌。并且在全基因組水平揭示了B.cenocepaciaQCGJ-B01具有無機(jī)磷增溶基因（gdh、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gltA）和磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因（pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU）。此外，發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運蛋白的基因，可能使其無法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。研究呈現(xiàn)了QCGJ-B01全基因組數(shù)據(jù)，特別是關(guān)于菌株的解磷基因，這將有助于進(jìn)一步了解QCGJ-B01和其他類似生物關(guān)于解磷與磷代謝的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制，并可能進(jìn)一步深入了解該菌株作為生物肥料在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的實際應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

［1］AzzizG，BajsaN，HaghjouT，etal.Abundance，diversityandprospectingofculturablephosphatesolubilizingbacteriaonsoilsundercrop-pasturerotationsinano-tillageregimeinUruguay［J］.AppliedSoilEcology，2012，61：320-326.

［2］CozzolinoV，MeoVD，PiccoloA.Impactofarbuscularmycorrhizalfungiapplicationsonmaizeproductionandsoilphosphorusavailability［J］.JournalofGeochemicalExploration，2013，129：40-44.

［3］池景良，郝敏，王志學(xué)，等.解磷微生物研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2021，41（1）：1-7.

［4］KhanMS，ZaidiA，AhemadM，etal.Plantgrowthpromotionbyphosphatesolubilizingfungi-currentperspective［J］.ArchivesofAgronomyandSoilScience，2010，56（1）：73-98.

［5］ZouXM，BinkleyD，DoxtaderKG.Anewmethodforestimatinggrossphosphorusmineralizationandimmobilizationratesinsoils［J］.Plant&Soil，1992，147（2）：243-250.

［6］張藝燦，劉鳳之，王海波.根際溶磷微生物促生機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國土壤與肥料，2020（2）：1-9.

［7］TakahashiS，AnwarMR.Wheatgrainyield，phosphorusuptakeandsoilphosphorusfractionafter23yearsofannualfertilizerapplicationtoanAndosol［J］.FieldCropsResearch，2007，101（2）：160-171.

［8］daCostaEM，deLimaW，Oliveira-LongattiSM，etal.Phosphate-solubilisingbacteriaenhanceOryzasativagrowthandnutrientaccumulationinanoxisolfertilizedwithrockphosphate［J］.EcologicalEngineering，2015，83：380-385.

［9］RobertsTL，JohnstonAE.Phosphorususeefficiencyandmanagementinagriculture［J］.ResourcesConservationandRecycling，2015，105（B）：275-281.

［10］ChangCH，YangSS.Thermo-tolerantphosphate-solubilizingmicrobesformulti-functionalbiofertilizerpreparation［J］.BioresourceTechnology，2009，100（4）：1648-1658.

［11］蘇奇倩，徐其靜，丁豪杰，等.微生物解磷特性及其鉛污染土壤修復(fù)應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2020，43（12）：177-184.

［12］MeenaVS，MeenaSK，VermaJP，etal.Plantbeneficialrhizosphericmicroorganism（PBRM）strategiestoimprovenutrientsuseefficiency：areview［J］.EcologicalEngineering，2017，107：8-32.

［13］AloriET，GlickBR，BabalolaOO.Microbialphosphorussolubilizationanditspotentialforuseinsustainableagriculture［J］.FrontiersinMicrobiology，2017，8：971.

［14］秦利均，楊永柱，楊星勇.土壤溶磷微生物溶磷、解磷機(jī)制研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)研究，2019，23（1）：59-64，86.

［15］HenryH，NaujokasMF，AttanayakeC，etal.Bioavailability-basedinsituremediationtomeetfuturelead（Pb）standardsinurbansoilsandgardens［J］.EnvironmentalScienceandTechnology，2015，49（15）：8948-8958.

［16］范丙全，劉巧玲.保護(hù)性耕作與秸稈還田對土壤微生物及其溶磷特性的影響［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)報，2005，13（3）：130-132.

［17］RichardsonAE，BareaJM，McNeillAM，etal.Acquisitionofphosphorusandnitrogenintherhizosphereandplantgrowthpromotionbymicroorganisms［J］.Plant&Soil，2009，321（1/2）：305-339.

［18］RichardsonAE，SimpsonRJ.Soilmicroorganismsmediatingphosphorusavailabilityupdateonmicrobialphosphorus［J］.PlantPhysiology，2011，156（3）：989-996.

［19］DixitS，KuttanKKA，ShrivastavaR.IsolationandcharacterizationofphosphorussolubilizingbacteriafrommanganeseminingareaofBalaghatandChhindwara［J］.CurrentScience，2017，113（3）：500-504.

［20］KaurG，ReddyMS.Effectsofphosphate-solubilizingbacteria，rockphosphateandchemicalfertilizersonmaize-wheatcroppingcycleandeconomics［J］.Pedosphere，2015，25（3）：428-437.

［21］PaulD，SinhaSN.Bacteriashowingphosphatesolubilizingefficiencyinriversediment［J］.ElectronicJournalofBiosciences，2013，1（1）：1-5.

［22］PereiraSIA，CastroPML.Phosphate-solubilizingrhizobacteriaenhanceZeamaysgrowthinagriculturalP-deficientsoils［J］.EcologicalEngineering，2014，73：526-535.

［23］周亮亮.柑橘潰瘍病生防菌BacillusvelezensisQC-J全基因組測序及比較基因組學(xué)分析［D］.贛州：江西理工大學(xué)，2021：7-10.

［24］馬錦錦.枸杞根際促生細(xì)菌篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化及基因組測序［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：17-23.

［25］LiuFP.LiuHQ，ZhouHL，etal.Isolationandcharacterizationofphosphate-solubilizingbacteriafrombetelnut（Arecacatechu）andtheireffectsonplantgrowthandphosphorusmobilizationintropicalsoils［J］.Biology&FertilityofSoils，2014，50（6）：927-937.

［26］喬策策，王甜甜，王若斐，等.高效溶磷菌的篩選及其促生效應(yīng)研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，40（4）：664-670.

［27］ZaidiA，KhanMS，AhemadM，etal.Plantgrowthpromotionbyphosphatesolubilizingbacteria［J］.ActaMicrobiologicaetImmunologicaHungarica，2009，56（3）：263-284.

［28］LiuZ，LiYC，ZhangS，etal.Characterizationofphosphate-solubilizingbacteriaisolatedfromcalcareoussoils［J］.AppliedSoilEcology，2015，96：217-224.

［29］黃靜，盛下放，何琳燕.具溶磷能力的植物內(nèi)生促生細(xì)菌的分離篩選及其生物多樣性［J］.微生物學(xué)報，2010，50（6）：710-716.

［30］IyerB，RajkumarS.GenomesequenceandcomparativegenomicsofRhizobiumsp.Td3，anovelplantgrowthpromotingphosphatesolubilizingCajanuscajansymbiont［J］.MicrobiologicalResearch，2018，218：32-40.

［31］LiuWX，WangQL，HouJY，etal.Wholegenomeanalysisofhalotolerantandalkalotolerantplantgrowth-promotingrhizobacteriumKlebsiellasp.D5A［J］.ScientificReports，2016，6：26710.

［32］MisraHS，RajpurohitYS，KhairnarNP.Pyrroloquinoline-quinoneanditsversatilerolesinbiologicalprocesses［J］.JournalofBiosciences，2012，37（2）：313-325.

［33］ToyamaH，LidstromME.pqqAisnotrequiredforbiosynthesisofpyrroloquinolinequinoneinMethylobacteriumextorquensAM1［J］.Microbiology，1998，144（1），183-191.

［34］ShariatiJV，MalboobiMA，TabriziZ，etal.Comprehensivegenomicanalysisofaplantgrowth-promotingrhizobacteriumPantoeaagglomeransstrainP5［J］.ScientificReports，2017，7（1）：1-12.

［35］Santos-BeneitF.ThePhoregulon：ahugeregulatorynetworkinbacteria［J］.FrontiersinMicrobiology，2015，6：402.

［36］PanhwarQA，OthmanR，AbdulRZ，etal.Isolationandcharacterizationofphosphatesolubilizingbacteriafromaerobicrice［J］.AfrJBiotechnol，2012，11（11）：2711-2719.

［37］QianYC，ShiJY，ChenYX，etal.Characterizationofphosphatesolubilizingbacteriainsedimentsfromashalloweutrophiclakeandawetland：isolation，molecularidentificationandphosphorusreleaseabilitydetermination［J］.Molecules，2010，15（11）：8518-8533.

［38］PérezE，SulbaránM，BallMM，etal.Isolationandcharacterizationofmineralphosphate-solubilizingbacterianaturallycolonizingalimoniticcrustinthesouth-easternVenezuelanregion［J］.SoilBiology&Biochemistry，2007，39（11）：2905-2914.

［39］ChenYP，RekhaPD，ArunAB，etal.Phosphatesolubilizingbacteriafromsubtropicalsoilandtheirtricalciumphosphatesolubilizingabilities［J］.AppliedSoilEcology，2006，34（1）：33-41.

［40］XiangWL，LiangHZ，LiuS，etal.IsolationandperformanceevaluationofhalotolerantphosphatesolubilizingbacteriafromtherhizosphericsoilsofhistoricDagongBrineWellinChina［J］.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology，2011，27（11）：2629-2637.

［41］SharmaSB，SayyedRZ，TrivediMH，etal.Phosphatesolubilizingmicrobes：sustainableapproachformanagingphosphorusdeficiencyinagriculturalsoils［J］.SpringerPlus，2013，2（1）：587.

［42］管冠，郭等等，李倩磊，等.生草栽培對紐荷爾臍橙根系生長土壤微生物群落的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（17）：220-225.

［43］ZekicF，WeselowskiB，YuanZC.CompletegenomesequenceofBurkholderiacenocepaciaCR318，aphosphate-solubilizingbacteriumisolatedfromcornroot［J］.GenomeAnnouncements，2017，5（23）：e00490-17.

［44］MannaaM，ParkI，SeoYS.Genomicfeaturesandinsightsintothetaxonomy，virulence，andbenevolenceofplant-associatedBurkholderiaspecies［J］.InternationalJournalofMolecularSciences，2018，20（1）：121.

［45］PeixA，MateosPF，Rodriguez-BarruecoC，etal.Growthpromotionofcommonbean（PhaseolusvulgarisL.）byastrainofBurkholderiacepaciaundergrowthchamberconditions［J］.SoilBiology&Biochemistry，2001，33（14）：1927-1935.

［46］CollavinoMM，SansberroPA，MroginskiLA，etal.Comparisonofinvitrosolubilizationactivityofdiversephosphate-solubilizingbacterianativetoacidsoilandtheirabilitytopromotePhaseolusvulgarisgrowth［J］.BiologyandFertilityofSoils，2010，46（7）：727-738.

［47］KothamasiD，KothamasiS，BhattacharyyaA，etal.ArbuscularmycorrhizaeandphosphatesolubilizingbacteriaoftherhizosphereofthemangroveecosystemofGreatNicobarisland，India［J］.BiologyandFertilityofSoils，2006，42（4）：358-361.

［48］KumarV，BehlRK，NarulaN.Establishmentofphosphate-solubilizingstrainsofAzotobacterchroococcumintherhizosphereandtheireffectonwheatcultivarsundergreenhouseconditions［J］.MicrobiologicalResearch，2001，156（1）：87-93.

［49］LinTF，HuangHI，ShenFT，etal.TheprotonsofgluconicacidarethemajorfactorresponsibleforthedissolutionoftricalciumphosphatebyBurkholderiacepaciaCC-Al74［J］.BioresourceTechnology，2006，97（7）：957-960.

［50］YouM，F(xiàn)angSM，MacDonaldJ，etal.IsolationandcharacterizationofBurkholderiacenocepaciaCR318，aphosphatesolubilizingbacteriumpromotingcorngrowth［J］.MicrobiologicalResearch，2019，233：126395.

［51］BeheraBC，SingdevsachanSK，MishraRR，etal.Diversity，mechanismandbiotechnologyofphosphatesolubilisingmicroorganisminmangrove：areview［J］.Biocatalysis&AgriculturalBiotechnology，2014，3（2）：97-100.

［52］GoldsteinAH.Involvementofthequinoproteinglucosedehydrogenaseinthesolubilizationofexogenousphosphatesbygram-negativebacteria［M］//Torriani-GoriniA，YagilE，SilverS.Phosphateinmicroorganisms：cellularandmolecularbiology.WashingtonDC：ASMPress，1994：197-203.