蔣 嵐, 孫晨晨, 胡榮榮, 宋明姝, 劉鵬琰,卞 軍, 丁 寧*,, 張存政*,,,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，南京 210014；3.安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；4.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，南昌 214122；5.宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 宿遷 223801)

氰烯菌酯 (phenamacril) 是1998 年由江蘇省農(nóng)藥研究所自主研發(fā)的2-氰基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1，其可抑制禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum菌絲生長(zhǎng)[1-3]，對(duì)由鐮刀菌引起的小麥赤霉病、水稻惡苗病等具有良好的保護(hù)和治療作用[4-6]，對(duì)于抗多菌靈的耐藥菌株也有良好的防治效果，可作為替代藥劑使用[7]，同時(shí)對(duì)小麥、水稻等作物生長(zhǎng)安全[8]。毒理學(xué)試驗(yàn)表明，氰烯菌酯對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核、小鼠睪丸細(xì)胞染色體等未有致突變作用，但對(duì)魚(yú)、蜜蜂、鳥(niǎo)、家蠶等生物具有毒害作用[9]。我國(guó)規(guī)定其在谷物中的最大殘留限量 (MRL) 為0.05 mg/kg[10]。

圖式1 氰烯菌酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Chemical structure of phenamacril

目前，氰烯菌酯的殘留檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法和氣相色譜法等。王金菊等采用反相高效液相色譜法對(duì)氰烯菌酯進(jìn)行含量分析，平均回收率為99.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.501，變異系數(shù)為0.505%[11]。結(jié)合QuEChERS前處理方法，分別建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜方法，測(cè)定糧谷中氰烯菌酯殘留量，平均回收率在82%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～10%，定量限分別為0.5 和5 ng/g[12-13]。然而，基于儀器的檢測(cè)方法雖檢測(cè)限較低，但需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室操作人員、復(fù)雜的前處理和精密的實(shí)驗(yàn)室儀器，從而限制了它們?cè)诂F(xiàn)場(chǎng)快速篩查中的應(yīng)用。因此，建立一種快速、通用性強(qiáng)、靈敏度高的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法將助力于保障食品安全。

免疫分析技術(shù)作為儀器方法的補(bǔ)充，具有高效、快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)定性分析[14]，例如酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析 (CLIA)、膠體金免疫分析 (GICA) 等，其中酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)及膠體金免疫技術(shù)等在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用較廣[15]。許俊麗等[16]建立了膠體金免疫層析試紙條法檢測(cè)農(nóng)作物中戊唑醇?xì)埩?，檢出限為6.25 ng/mL；Guo 等[17]建立的膠體金免疫分析方法，對(duì)于雞胸肉中的卡巴多克斯裸眼檢出限可達(dá)8 ng/g。目前對(duì)氰烯菌酯的免疫分析技術(shù)研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，本研究根據(jù)氰烯菌酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成了半抗原，制備了對(duì)氰烯菌酯具有特異性的單克隆抗體，進(jìn)一步建立了膠體金免疫層析試紙條分析方法。氰烯菌酯半抗原的合成路線(xiàn)見(jiàn)圖式2。選取結(jié)構(gòu)類(lèi)似物殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯、氟醚菌酰胺和啶氧菌酯，用于交叉反應(yīng)試驗(yàn)，以驗(yàn)證其特異性。各化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式3。

圖式2 氰烯菌酯半抗原合成路線(xiàn)圖Scheme 2 Synthetic route of phenamacril hapten

圖式3 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、氟醚菌酰胺和啶氧菌酯的結(jié)構(gòu)式Scheme 3 Structural formula of azoxystrobin, pyraclostrobin, fluopimomide and picoxystrobin

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XYZ3050TM 膠體金噴膜機(jī) (Bio-Dot 公司)；ZQ2000 微電腦自動(dòng)斬切機(jī) (上海金標(biāo)生物科技有限公司)；Lambda25UV/VIS spectrometer 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (PerkinElmer 公司)；Multiscan ascent 酶標(biāo)儀 (Thermo 公司)；硝酸纖維素膜(NC 膜)、金標(biāo)結(jié)合墊和吸水墊 (Millipore 公司)；聚氯乙烯 (PVC) 底板和樣品墊 (上海金標(biāo)科技生物有限公司)；DNP-9082 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏儀器設(shè)備有限公司)；Water ProPS 超純水凈化儀 (美國(guó)LabConco 公司)；LC-MS/MS-8030 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Shimadzu Corporation,Japan)。

1000 μg/mL 氰烯菌酯 (phenamacril) 標(biāo)準(zhǔn)品母液 (江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司)；100 μg/mL嘧菌酯、100 μg/mL 吡唑醚菌酯、100 μg/mL 氟醚菌酰胺和100 μg/mL 啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品母液 (Dr.Ehrenstorfer)；抗原及單克隆抗體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所實(shí)驗(yàn)室制備；兔抗鼠IgG (伊佰新生物技術(shù)有限公司)；牛血清蛋白 (BSA)、卵清蛋白 (OVA)、氯金酸 (HAuCl4? 3H2O)和二水合檸檬酸三鈉 (C6H5Na3O7? 2H2O) (Sigma公司)；其他試劑均為分析純 (西隴化工股份有限公司)。Balb/c 小白鼠 (揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心)。供試9 個(gè)面粉樣品分別購(gòu)于盒馬超市、蘇果超市和當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)均未含氰烯菌酯。

1.2 抗原的制備

1.2.1 半抗原的合成

1.2.1.1 苯甲亞胺酸乙酯鹽酸鹽 (1) 以及中間體(2) 的合成 將苯甲腈 (30 g，0.3 mol)、無(wú)水乙醇(17.0 g，0.36 mol) 和60 g 二氯乙烷加入反應(yīng)瓶中，攪拌冷卻。將160 g 濃鹽酸緩慢滴入200 g 濃硫酸中，產(chǎn)生的氯化氫氣體經(jīng)干燥后通入反應(yīng)瓶中，持續(xù)通氣8 h 后攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢后轉(zhuǎn)移至冰水浴中攪拌8 h，有固體析出，過(guò)濾烘干，得苯甲亞胺酸乙酯鹽酸鹽 (1)。取化合物1 (15.02 g，81.1 mmol) 溶于100 mL 水中，加入碳酸氫鈉(6.812 g，81.1 mmol) 使pH 值為8.0，依次用200、100、50 mL 乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜后過(guò)濾，濃縮得中間體2。

1.2.1.2 4-羥基丁酸叔丁酯 (3) 的合成 向20 mL四氫呋喃 (THF) 中加入丁二酸單叔丁酯 (2.12 g，12.2 mmol)，冷卻至0°C，緩慢滴入2 mol/L 溶于THF 的硼烷二甲硫醚 (BH3? Me2S) 共6.6 mL。加入100 mL 乙酸乙酯和70 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的碳酸鈉，靜置。水層用50 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并有機(jī)相，用氯化鈉飽和溶液洗滌2 次，加入無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜。過(guò)濾，濃縮，得 1.17 g 化合物3。

1.2.1.3 4- (2-氰基乙酰氧基) 丁酸叔丁酯 (4) 合成

將氰乙酸 (1.48 g，17.4 mmol)、化合物3 (1.856 g，11.6 mmol) 和二甲氨基吡啶 (DMAP) (0.71 g，5.8 mmol) 溶于30 mL 二氯甲烷中，降溫至0 °C，加入二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC) (6.13 g，23.2 mmol)，攪拌過(guò)夜。過(guò)濾，將濾液蒸干，加入100 mL 乙酸乙酯，有固體析出，過(guò)濾。再分別用50 mL 和30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的碳酸氫鈉以及50 mL 和30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的硫酸氫鈉洗滌，然后用氯化鈉飽和溶液洗滌2 次，有機(jī)相中加入無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜。過(guò)濾，濃縮，得2.90 g 化合物4。

1.2.1.4 (E)-4-((3-氨基-2-氰基-3-苯基丙烯?；? 氧基) 丁酸叔丁酯 (5) 合成 將中間產(chǎn)物2 (2.7 g，18.12 mmol)、化合物4 (2.63 g，11.6 mmol) 和咪唑 (IMI) (0.394 g，5.8 mmol) 溶于60 mL 甲苯中，轉(zhuǎn)入100 ℃油浴，反應(yīng)24 h，加入50 mL 水和50 mL乙酸乙酯，用50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的硫酸氫鈉洗滌2 次，再用50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的碳酸氫鈉洗滌，加入無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜。過(guò)濾，濃縮。用乙酸乙酯和正己烷重結(jié)晶，得1.03 g 化合物5 。

1.2.1.5 氰烯菊酯半抗原 (6) 合成 參考文獻(xiàn)方法[18]將化合物5 (0.68 g，2.06 mmol) 溶于6 mL 二氯甲烷中，加入4 mL 三氟乙酸 (TFA)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。加入8 mL甲苯，減壓濃縮后干燥，得黃色黏稠物。用乙酸乙酯和正己烷重結(jié)晶。過(guò)濾得固體即為氰烯菊酯半抗原 (hapten，6)。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖式2。

1.2.2 抗原制備 采用碳二亞胺法[19]并稍作修改。將氰烯菌酯半抗原分別與BSA、OVA 偶聯(lián)制備免疫原及包被原。取2.2 mg 半抗原、2.3 mgN-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺 (EDC)、1 mgN-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 溶解于0.5 mLN,N二甲基甲酰胺 (DMF) 中，室溫下攪拌過(guò)夜。稱(chēng)取載體蛋白BSA 13.3 mg 和OVA 9.1 mg，分別溶解于1 mL 0.05 mol/L pH=9.6 的碳酸鹽緩沖液 (CBS)中，然后各自緩慢加入過(guò)夜的反應(yīng)溶液中，攪拌反應(yīng)9 h。反應(yīng)結(jié)束后，將所得溶液用0.1 mol/L pH = 7.4 的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 透析3 d，即得到所需完全抗原，于 -20℃保存，備用。

1.3 單克隆抗體的制備

1.3.1 動(dòng)物免疫 選取6～8 周齡的Balb/c 小白鼠10 只，飼養(yǎng)7 d 使其適應(yīng)環(huán)境，同時(shí)進(jìn)行尾部采血獲得陰性血清。首次免疫時(shí)取1 mg/mL 的免疫原50 μL 與氟氏完全佐劑等體積混合進(jìn)行乳化，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。間隔21 d 后進(jìn)行3 次加強(qiáng)免疫，每次免疫間隔14 d，加強(qiáng)免疫時(shí)采用氟氏不完全佐劑代替氟氏完全佐劑，對(duì)每只小鼠腹腔注射含有50 μg 抗原的混合液100 μL。每次加強(qiáng)免疫7 d 后對(duì)小鼠進(jìn)行尾部采血，于4 ℃下靜置過(guò)夜，次日于4 ℃、10 000 r/min 下離心8 min，取上清液，即為所需多抗血清，以此進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)。于3 次加強(qiáng)免疫后的第15 天進(jìn)行末次沖擊免疫。

1.3.2 細(xì)胞融合及單克隆抗體制備 選擇免疫應(yīng)答效果最好且血清效價(jià)較高的小鼠，摘取脾臟，按SP2/0 : 脾細(xì)胞數(shù)量比值為1 : 5 的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。雜交瘤細(xì)胞制備方法參照吳建祥等[20]的方法。細(xì)胞融合后，定期用ELISA 法檢測(cè)融合后細(xì)胞上清的抗體效價(jià)及對(duì)氰烯菌酯識(shí)別情況。經(jīng)若干次亞克隆后，獲得由單個(gè)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)形成的雜交瘤細(xì)胞株。

對(duì)篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，注入石蠟脫敏的Balb/c 小鼠體內(nèi)制備腹水。獲得的腹水經(jīng)Protein G 柱純化后，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，鑒定抗體純化效果。

1.4 膠體金納米材料的制備與鑒定

采用檸檬酸三鈉法制備膠體金[21]并稍作修改。向250 mL 錐形瓶中依次加入200 mL 蒸餾水、1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4溶液，輕輕晃動(dòng)至混合均勻后置于微波爐中加熱5 min 至沸騰。取出錐形瓶，迅速順時(shí)針晃動(dòng)，并快速加入4.8 mL 經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)沿順時(shí)針?lè)较蜉p輕晃動(dòng)錐形瓶，混合均勻后再次置于微波爐中加熱5 min，得酒紅色液體即為膠體金溶液。室溫下避光冷卻后，加入去離子水定容至200 mL，混勻后于4 ℃避光保存。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得膠體金的最大吸收峰，透射電鏡鑒定膠體金顆粒的粒徑大小。

1.5 膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)探針的制備

1.5.1 標(biāo)記反應(yīng)最佳pH 值以及抗體用量?jī)?yōu)化取10 個(gè)2 mL 離心管，分別加入1 mL 膠體金溶液后依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8 和9 μL 0.1 mol/L 的K2CO3調(diào)節(jié)pH 值，混勻后，向各離心管中加入20 μL 氰烯菌酯單克隆抗體 (0.97 mg/mL)，輕輕晃動(dòng)至混合均勻，室溫下靜置反應(yīng)2 h。選取未出現(xiàn)沉淀的溶液，測(cè)定其在400～600 nm 處的紫外吸收光譜，吸光值最大的膠體金溶液所對(duì)應(yīng)的pH 值即為最佳pH 標(biāo)記值。

取8 個(gè)2 mL 離心管，分別加入1 mL 膠體金溶液，再加入適量的0.1 mol/L 的K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH 值至上述篩選出的最佳pH 值，然后依次加入0、10、15、20、25、30、35 和40 μL 氰烯菌酯單克隆抗體 (0.97 mg/mL)，混勻后室溫下靜置5 min，向各離心管中分別加入100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl 溶液，靜置5 min 后觀察各管溶液的顏色變化。當(dāng)溶液顏色隨抗體用量的增加未出現(xiàn)明顯變化時(shí)，將氰烯菌酯單克隆抗體的最小用量判斷為最佳抗體標(biāo)記量。

1.5.2 膠體金標(biāo)記抗體探針的制備 取5 mL 膠體金溶液，加入適量的0.1 mol/L 的K2CO3調(diào)節(jié)至上述篩選出的最佳pH 值，邊攪拌邊緩慢加入適量的氰烯菌酯單克隆抗體 (即1.5.1 節(jié)中篩選出的抗體濃度)，室溫下攪拌30 min。加入10% BSA溶液至BSA 的質(zhì)量濃度為10 mg/mL，繼續(xù)攪拌30 min。反應(yīng)結(jié)束后于1500 r/min 下離心30 min。棄上清液，加入0.5 mL 洗滌保存液 (0.01% 硼酸，0.2% PEG 20000 和0.02% NaN3) 重懸沉淀，得膠體金標(biāo)記氰烯菌酯單克隆抗體探針溶液，于4℃避光保存。

1.6 膠體金免疫層析試紙條的制備

1.6.1 試紙條的組裝 膠體金免疫層析試紙條主要由PVC 底板、吸水墊、NC 膜、質(zhì)控線(xiàn) (C 線(xiàn))、檢測(cè)線(xiàn) (T 線(xiàn))、金標(biāo)結(jié)合墊和樣品墊7 個(gè)部分構(gòu)成(圖1)。組裝步驟：用噴膜儀在NC 膜上噴涂兔抗鼠抗體作為C 線(xiàn)、氰烯菌酯包被原作為T(mén) 線(xiàn)，兩者間隔4 mm，將NC 膜貼在PVC 底板的中間位置，將金標(biāo)氰烯菌酯單抗噴涂在金標(biāo)結(jié)合墊上。于37 ℃干燥6 h 后，將吸水墊、金標(biāo)結(jié)合墊和樣品墊依次貼在PVC 底板上，其中吸水墊、金標(biāo)結(jié)合墊與NC 膜重合1 mm，樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊重合1 mm。組裝完成后，用自動(dòng)切割儀切割為3.5 mm × 60.0 mm 的試紙條，于干燥條件下保存，備用。

圖1 膠體金免疫層析試紙條構(gòu)成截面圖Fig.1 Cross-section illustration of colloidal gold immunochromatographic strip

1.6.2 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果的判定將100 μL 待測(cè)樣品或體積分?jǐn)?shù)為10% 的甲醇-PBS 稀釋的氰烯菌酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加在樣品墊上，15 min 后觀察檢測(cè)結(jié)果。1) 當(dāng)樣品液中不含氰烯菌酯或含量極少時(shí)，部分金標(biāo)抗體與固定在T 線(xiàn)上的包被原結(jié)合，過(guò)量的金標(biāo)抗體與固定在C 線(xiàn)上的兔抗鼠抗體結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的紅色條帶。此時(shí)C 線(xiàn)和T 線(xiàn)均為紅色條帶，結(jié)果判定為陰性。2) 當(dāng)樣品液中含有氰烯菌酯的質(zhì)量濃度高于50 ng/mL時(shí)，部分金標(biāo)抗體與樣品液中的氰烯菌酯結(jié)合，T 線(xiàn)較C 線(xiàn)顏色明顯變淺或不顯色，C 線(xiàn)仍為紅色，結(jié)果判定為陽(yáng)性。3) 當(dāng)C 線(xiàn)未顯現(xiàn)紅色條帶時(shí)，無(wú)論T 線(xiàn)是否顯色，均視為無(wú)效結(jié)果[22]。

1.7 膠體金免疫層析試紙條的交叉反應(yīng)

選取結(jié)構(gòu)類(lèi)似物殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯、氟醚菌酰胺和啶氧菌酯，用于交叉反應(yīng)試驗(yàn)。用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇-PBS 溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，分別用于試紙條檢測(cè)，觀察結(jié)果并判斷交叉反應(yīng)情況。

1.8 樣品處理及提取溶劑的選擇

稱(chēng)取5 g 面粉至50 mL 離心管中，加入氰烯菌酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成31.25、50、62.5、125和250 ng/mg 的系列添加樣品。加入10 mL 超純水，渦旋1 min 后，分別以25 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇-PBS、乙腈、甲醇和丙酮作為溶劑，振蕩提取15 min。隨后除10%甲醇-PBS 的樣品外，其他樣品中分別加入3 g NaCl，振蕩30 min 后于4000 r/min 下離心5 min，靜置。吸取上層有機(jī)相，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 方法[23]測(cè)定各溶劑的提取效果。同時(shí)，分別吸取1 mL 上層有機(jī)相溶液，氮?dú)獯蹈珊螅?0%的甲醇-PBS 復(fù)溶，并依據(jù)基質(zhì)干擾情況進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)糜谠嚰垪l檢測(cè)。

1.9 方法驗(yàn)證及實(shí)際樣品測(cè)定

利用構(gòu)建的試紙條方法和儀器LC-MS/MS 參比方法，測(cè)定供試9 個(gè)面粉樣品中氰烯菌酯含量。

采用人工添加氰烯菌酯，對(duì)上述購(gòu)買(mǎi)陰性面粉樣品 (如樣品1) 進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，添加水平分別為15.63、31.25、50 和62.5 ng/mg，對(duì)應(yīng)的編號(hào)為1-1、1-2、1-3 和1-4。分別采用膠體金免疫層析試紙條與LC-MS/MS 方法對(duì)上述4 個(gè)藥物添加面粉樣品進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氰烯菌酯半抗原和完全抗原的鑒定

氰烯菌酯半抗原分子式為C14H14N2O4，相對(duì)分子質(zhì)量為274，檢測(cè)結(jié)果274.2，結(jié)合核磁氫譜結(jié)果：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ12.18 (s,1H, -COOH), 9.23 (s, 1H, -NH), 8.97 (s, 1H, -NH),7.64-7.46 (m, 5H, Ar-H), 4.15 (t,J= 6.5 Hz, 2H,-OCH2-, 2.32 (t,J= 7.4 Hz, 2H, -CH2CO-), 1.85(p,J= 6.9 Hz, 2H, -CH2)，表明半抗原合成成功。

用全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)在220～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行氰烯菌酯半抗原、載體蛋白、偶聯(lián)物的最大吸收峰掃描，由紫外吸收光譜 (圖2) 可知，偶聯(lián)抗原出現(xiàn)了明顯的吸收峰偏移，由此判斷偶聯(lián)成功。經(jīng)質(zhì)譜鑒定 (MALDI-TOF)，半抗原與BSA和OVA 載體蛋白的偶聯(lián)比分別為33 : 1 和26 : 1。

圖2 (A) 氰烯菌酯半抗原、BSA 和免疫原紫外光譜圖；(B) 氰烯菌酯半抗原、OVA 和包被原紫外光譜圖Fig.2 UV-vis spectra of (A) phenamacril hapten, BSA,phenamacril-BSA; (B) phenamacril hapten, OVA,phenamacril-OVA

2.2 抗體純化與性能鑒定

將獲得的腹水單克隆抗體進(jìn)行G 蛋白柱純化后，經(jīng)由SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3 所示，有明顯的輕鏈 (25 kD)、重鏈 (50 kD)條帶，且無(wú)其他雜帶，由此判斷抗體純化效果良好。純化所獲得抗體經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其質(zhì)量濃度為0.98 mg/mL。

圖3 SDS-PAGE 鑒定單克隆抗體的純化效果Fig.3 Identification of purified monoclonal antibody by SDS-PAGE

ELISA 方法鑒定單克隆抗體對(duì)氰烯菌酯的抑制關(guān)系曲線(xiàn)如圖4 所示，線(xiàn)性范圍為質(zhì)量濃度38.72～438.01 ng/mL，線(xiàn)性方程為y= -0.168 ln(x) +1.2954，IC50= 108.42 ng/mL。

圖4 氰烯菌酯單克隆抗體對(duì)氰烯菌酯標(biāo)準(zhǔn)品的抑制曲線(xiàn)Fig.4 Inhibitory curve of mAb against phenamacril

通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法測(cè)定氰烯菌酯單克隆抗體對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物殺菌劑的識(shí)別效果。檢測(cè)結(jié)果表明，嘧菌酯、吡唑醚菌酯、氟醚菌酰胺和啶氧菌酯的IC50均大于5000 ng/mL，交叉反應(yīng)率小于0.01%，幾乎未見(jiàn)交叉反應(yīng)，說(shuō)明本研究所制備的氰烯菌酯單克隆抗體對(duì)氰烯菌酯的特異性較高。

2.3 膠體金納米顆粒的鑒定

用紫外分光光度計(jì)在400～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定膠體金溶液的吸收光譜，如圖5A 所示：所制備的膠體金溶液的最大吸收波長(zhǎng)在517 nm 處，最大吸光值為0.7296。透射電鏡結(jié)果 (圖5B) 顯示，制備的膠體金納米顆粒分散均勻、無(wú)聚集現(xiàn)象，粒徑約為15 nm。

圖5 膠體金溶液吸收光譜(A)和透射電鏡圖(B)Fig.5 Absorption spectrum (A) and TEM image (B) of colloidal gold solution

2.4 膠體金標(biāo)記抗體探針最佳pH 值以及抗體用量?jī)?yōu)化

將氰烯菌酯單克隆抗體加入到含有不同體積0.1 mol/L K2CO3的膠體金溶液中，靜置2 h 后觀察。如圖6 所示，除加入7 μL 0.1 mol/L K2CO3的膠體金溶液外，其余均出現(xiàn)了不同程度的聚沉，由此選擇加入7 μL 0.1 mol/L K2CO3，即pH =6.48 為最佳標(biāo)記pH 值。

圖6 膠體金標(biāo)記氰烯菌酯單克隆抗體的最佳 pH 值Fig.6 The optimal pH value for preparation of colloidal gold-labeled mAb

加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl 后，游離的膠體金顆粒由于鹽離子作用發(fā)生聚沉，使得膠體金溶液由酒紅色變?yōu)榛宜{(lán)色，而與抗體結(jié)合的膠體金顆粒仍能保持較好的分散性，膠體金溶液仍保持酒紅色。通過(guò)觀察溶液顏色可知 (圖7)，當(dāng)加入抗體量為0～15 μL，即質(zhì)量濃度為0～14.7 μg/mL時(shí)，溶液呈現(xiàn)灰藍(lán)色；當(dāng)加入抗體量15～25 μL，即質(zhì)量濃度為14.7～24.5 μg/mL 時(shí)，溶液呈現(xiàn)紫紅色；當(dāng)加入抗體量30 μL 即質(zhì)量濃度為29.4 μg/mL時(shí)，溶液呈現(xiàn)酒紅色，此后增加抗體含量至35 μL和40 μL，溶液顏色依然為酒紅色，未出現(xiàn)明顯變化。由此確定，氰烯菌酯單克隆抗體的最小標(biāo)記質(zhì)量濃度為為29.4 μg/mL。

圖7 膠體金標(biāo)記氰烯菌酯單克隆抗體的最小濃度Fig.7 The minimum mAb concentration labeled with colloidal gold

2.5 試紙條質(zhì)控線(xiàn)與檢測(cè)線(xiàn)的設(shè)置與優(yōu)化

優(yōu)化NC 膜上質(zhì)控線(xiàn) (C) 和檢測(cè)線(xiàn) (T) 的噴涂濃度。固定C 線(xiàn)噴涂兔抗鼠IgG 濃度為1 mg/mL，改變T 線(xiàn)包被原噴涂質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 mg/mL。如圖8 所示，當(dāng)T 線(xiàn)噴涂包被原的濃度為0.3 mg/mL 時(shí)，C 線(xiàn)與T 線(xiàn)均能顯現(xiàn)清晰的紅色條帶，且顏色最為相近。由此選擇最優(yōu)C 線(xiàn)兔抗鼠IgG 的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，T 線(xiàn)包被原的質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。

圖8 試紙條質(zhì)控線(xiàn)與檢測(cè)線(xiàn)的優(yōu)化Fig.8 Optimization of quality control line and detection line of the test strip

2.6 試紙條檢測(cè)靈敏度與特異性驗(yàn)證

以裸眼觀察試紙條T 線(xiàn)紅色條帶明顯減弱時(shí)的最低氰烯菌酯的質(zhì)量濃度作為試紙條裸眼觀察檢出限 (LOD)。用體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醇-PBS 溶液配制31.25～125 ng/mL 系列梯度的氰烯菌酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)。如圖9 所示，隨著氰烯菌酯質(zhì)量濃度的升高，T 線(xiàn)的紅色條帶逐漸變淡，當(dāng)氰烯菌酯質(zhì)量濃度達(dá)到50 ng/mL 時(shí)，T 線(xiàn)明顯變?nèi)?，而C 線(xiàn)的紅色條帶無(wú)明顯變化。因此本次研制的膠體金試紙條的檢出限為50 ng/mL。

圖9 試紙條測(cè)定氰烯菌酯的檢出限Fig.9 The limit of detection (LOD) of phenamacril measured by the test strip

與嘧菌酯、啶氧菌酯、氟醚菌酯和吡唑醚菌酯的交叉反應(yīng)結(jié)果如圖10 所示，除氰烯菌酯外，檢測(cè)其他藥劑的試紙條T 線(xiàn)均未有變化，保持紅色條帶，表明此膠體金試紙條對(duì)氰烯菌酯具有良好的特異性。

圖10 試紙條與嘧菌酯、啶氧菌酯、氟醚菌酰胺、吡唑醚菌酯的交叉反應(yīng) (1 μg/mL)Fig.10 Cross reactivity of lateral flow test strip for the detection of azoxystrobin, picoxystrobin, fluopimomide,and pyaclostrobin(1 μg/mL)

2.7 不同提取溶劑對(duì)氰烯菌酯提取效果的比較

向面粉樣品中分別添加15.63、31.25、50 和62.5 ng/mg 的氰烯菌酯，分別經(jīng)10% 的甲醇-PBS、乙腈、甲醇和丙酮對(duì)氰烯菌酯進(jìn)行提取后，采用LC-MS/MS 方法測(cè)定各溶劑的提取效果。如表1所示，提取效果為乙腈 > 丙酮 > 甲醇 > 10%甲醇-PBS，由此，選取乙腈作為提取溶劑。

表1 采用LC-MS/MS 方法測(cè)定不同溶劑對(duì)氰烯菌酯的提取效果Table 1 Extraction efficiency of different solvents determined by LC-MS/MS

2.8 基質(zhì)干擾

面粉樣品經(jīng)乙腈提取，將提取液用10%甲醇-PBS 稀釋10 倍后直接用于試紙條檢測(cè)，未出現(xiàn)基質(zhì)干擾。結(jié)果如圖11 所示，在稀釋10 倍后，樣品基質(zhì)對(duì)試紙條基本無(wú)影響，裸眼觀測(cè)靈敏度為50 ng/mg。

圖11 添加樣品中氰烯菌酯的試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.11 Results of test strip for phenamacril in spiked samples

2.9 方法驗(yàn)證及其應(yīng)用

如表2 所示，盒馬超市購(gòu)買(mǎi)的氰烯菌酯陰性面粉樣品中，當(dāng)氰烯菌酯添加水平≥50 ng/mg時(shí)，膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性；當(dāng)添加水平為15.63～50 ng/mg 時(shí)，結(jié)果呈弱陽(yáng)性；當(dāng)添加水平 ＜ 15.63 ng/mg 時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。所有檢測(cè)結(jié)果均一致，試驗(yàn)重復(fù)性較好。將膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均一致。

表2 膠體金免疫層析試紙條法與LC-MS/MS 法檢測(cè)面粉樣品的結(jié)果比較Table 2 Comparison of the detection results of flour samples between GICA and LC-MS/MS

采用膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)盒馬超市、蘇果超市和菜市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的9 個(gè)面粉樣品中氰烯菌酯。結(jié)果 (表2) 表明：9 份樣品均為氰烯菌酯陰性，且LC-MS/MS 參比方法未檢測(cè)到氰烯菌酯殘留。上述結(jié)果表明當(dāng)前市售面粉中氰烯菌酯殘留風(fēng)險(xiǎn)較小。

3 結(jié)論

本研究制備并獲得了對(duì)氰烯菌酯具有高靈敏度及強(qiáng)特異性的單克隆抗體，并以此單克隆抗體作為核心試劑研發(fā)了膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法。所制備的試紙條對(duì)氰烯菌酯的裸眼檢出限為50 ng/mL，與嘧菌酯、啶氧菌酯、氟醚菌酰胺和吡唑醚菌酯等結(jié)構(gòu)類(lèi)似的農(nóng)藥無(wú)明顯交叉反應(yīng)。向小麥面粉基質(zhì)中添加氰烯菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，樣品經(jīng)乙腈提取后，采用本研究所建立的膠體金免疫層析試紙條法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用LC-MS/MS方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，該試紙條檢測(cè)靈敏度滿(mǎn)足國(guó)家規(guī)定的谷物小麥中的MRL 值0.05 mg/kg的檢測(cè)要求。該方法易于操作，簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確度高，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)儀器法操作繁瑣、耗時(shí)、不便攜等缺點(diǎn)，適用于面粉中氰烯菌酯的快速定性和半定量檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用潛力。可為其他糧谷類(lèi)樣品中氰烯菌酯殘留的快速檢測(cè)提供參考。