梁根誠 李岳勇 李昇 黃照河

【摘要】 目的 探討龍血竭總黃酮（SDF）對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）大鼠Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)的影響及其臨床意義。

方法 將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)（sham）組、心肌缺血再灌注模型（MIRI）組、模型+Wnt/β-catenin抑制劑（IWR-1）組、模型+龍血竭總黃酮灌胃（SDF）組、模型+Wnt/β-catenin抑制劑+龍血竭總黃酮灌胃（IWR-1+SDF）組，采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法構(gòu)建MIRI大鼠模型。TTC染色評價(jià)造模情況和SDF對模型的作用效果；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Wnt2、β-catenin表達(dá)水平；ELISA法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平。

結(jié)果 TTC染色結(jié)果顯示動(dòng)物造模成功；SDF組Wnt2相對表達(dá)量為（1.74±0.18），顯著高于sham組的（1.05±0.24）和MIRI組的（0.99±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。SDF組β-catenin相對表達(dá)量為（0.65±0.08），顯著低于sham組的（1.10±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。IWR-1組、SDF組血清VEGF含量顯著高于sham組（P<0.05）。

結(jié)論 龍血竭總黃酮可以提高M(jìn)IRI大鼠Wnt2蛋白的表達(dá)水平，降低β-catenin的表達(dá)水平，對促進(jìn)血管的生成有益。

【關(guān)鍵詞】 龍血竭總黃酮；心肌缺血再灌注損傷；Wnt；β-catenin；血管生成

中圖分類號：R285.5；R542.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.002

Effect of sanguis draconis flavones on Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury and its clinical significance

LIANG Gencheng1a，2， LI Yueyong1b， LI Sheng1a，2， HUANG Zhaohe2

（1a. Department of Emergency， 1b. Department of Tumor Intervention， 1. Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Graduate School，

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of sanguis draconis flavones （SDF） in Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） and its clinical significance.

Methods 50 male SD rats were randomly divided into 5 groups including sham group， MIRI group， model + Wnt/β-catenin inhibitor （IWR-1） group， model + sanguis draconis flavones （SDF） group， and model + IWR-1 + SDF group， with 10 rats in each group. Ligation of left anterior descending artery was used to constructed MIRI models. TTC staining was used to evaluate modeling situation and the effect of SDF on the model. Western blot was used to detect the expression levels of Wnt2 and β-catenin， and ELISA was used to detect the levels of serum vascular endothelial growth factor （VEGF）.

Results TTC staining results showed that the animal models were successfully established. The relative expression of Wnt2 in the SDF group （1.74 ± 0.18） was significantly higher than those in the sham group （1.05 ± 0.24） and the model group （0.99 ± 0.12）， and difference was statistically significant （P<0.05 or 0.01）. The relative expression of β-catenin in the SDF group （0.65 ± 0.08） was significantly lower than that in the sham group （1.10 ± 0.07）， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The serum VEGF levels in the IWR-1 group and the SDF group were significantly higher than that in the sham group （P<0.05）.

配置方法：取1.22 mL DMSO溶解5 mg IWR-1粉劑，溶解濃度為4.1 mg/mL，儲(chǔ)備液分裝為0.5 mL每管，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。取0.5 mL儲(chǔ)備液溶解加4.5 mL玉米油稀釋，稀釋后濃度為0.41 mg/mL，放置于室溫備用，工作液于手術(shù)當(dāng)天配置并使用。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎之后，關(guān)閉胸腔之前在結(jié)扎部位周圍心肌注射IWR-1工作液。IWR-1組、SDF+IWR-1組動(dòng)物按照0.3 mg/kg用量計(jì)算IWR-1溶液的注射體積，其他組注射等體重體積的滅菌PBS。

1.3.3 SDF灌胃給藥

稱取SDF 1.75 g，加入PEG400∶超純水=1∶1的混合液35 mL，震蕩充分溶解，所得藥物濃度為0.05 g/mL。SDF治療組和SDF+IWR-1組的SDF給藥量為180 mg/kg，總黃酮含量按照50%計(jì)，以用量360 mg/kg計(jì)算給藥體積進(jìn)行灌胃。sham組、MIRI組和IWR-1組每只大鼠按單位體重等體積灌胃PEG400∶超純水=1∶1的混合液。每天固定時(shí)間上午10：00和下午4：00對大鼠進(jìn)行兩次灌胃，連續(xù)7天。

1.3.4 大鼠解剖采樣、MIRI模型檢測及藥效測評

各組大鼠在術(shù)后7天，麻醉后予頸脫臼處死，充分暴露大鼠的胸腔，心臟（心尖，避開病灶區(qū)進(jìn)針）采血3 mL/只，室溫靜置30 min后，5000 r/min，10 min離心，分離血清做好標(biāo)記。樣本凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.5 ELISA法檢測血管內(nèi)皮生成情況

每組5個(gè)血清樣本，按照ELISA試劑盒說明書對樣品進(jìn)行VEGF檢測，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。

1.3.6 Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白

對每組大鼠心臟樣本取心肌梗死區(qū)，sham組取對應(yīng)掛線區(qū)，加組織裂解液用組織勻漿機(jī)充分裂解，裂解的組織樣本于4 ℃，14 000 rpm離心15 min。將上清液移至干凈的EP管中待用，用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣本按照蛋白∶樣品緩沖液體積=3∶1的比例混勻，70 ℃加熱10 min變性。電泳槽中放入10% Bis-Tris預(yù)制膠及Running Buffer，每組上樣20 μL，于150 V恒壓電泳60 min。取出蛋白凝膠，PVDF膜使用甲醇激活，按負(fù)極、海綿、濾紙、蛋白凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿、正極組裝轉(zhuǎn)印模塊，于20 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min。取出PVDF膜，目的蛋白和內(nèi)參蛋白分開剪膜。各條帶使用封閉液在搖床孵育2 h，去除封閉液，加入相應(yīng)一抗在搖床中4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次15 min，加入酶標(biāo)二抗在搖床中室溫孵育1 h。TBST清洗3次，每次15 min，加入ECL顯影液避光孵育5 min，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)量柱狀圖作圖分析。

2 結(jié)? 果

2.1 MIRI大鼠模型構(gòu)建

TTC染色是評價(jià)缺血損傷常用的指標(biāo)，與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲臜，表示細(xì)胞的活力。通過TTC染色發(fā)現(xiàn)sham組動(dòng)物整個(gè)心臟TTC染色呈紅色，無梗死組織（圖1A）；MIRI組動(dòng)物右心室壁有部分區(qū)域染色呈白色（圖1B）；染色結(jié)果顯示MIRI組動(dòng)物符合組織梗死染色特征，表明動(dòng)物模型構(gòu)建成功。動(dòng)物造模50只，手術(shù)當(dāng)天成活43只，成活率86%。造模和灌胃7天后總體成活32只，成活率為64%。

2.2 Wnt通路蛋白Wnt2和β-catenin相對表達(dá)量

各組大鼠心肌組織Wnt2的表達(dá)量如表1和圖2所示。SDF組Wnt2相對表達(dá)量顯著高于sham組、MIRI組、IWR-1組和SDF+IWR-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。Western blot檢測各組大鼠心肌組織β-catenin的表達(dá)量如表1、圖3所示。MIRI組β-catenin相對表達(dá)量顯著低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SDF組β-catenin相對表達(dá)量顯著低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 血清VEGF含量檢測

與sham組比較，IWR-1組、SDF組、SDF+IWR-1組的血清VEGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。與MIRI組比較，IWR-1組、SDF組的血清VEGF含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討? 論

多項(xiàng)研究［11-13］證實(shí)龍血竭總黃酮具有很好的預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷的作用，然而其作用機(jī)制報(bào)道較少。

近年來的研究闡明Wnt/β-catenin蛋白在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用，可能與其促進(jìn)血管的再生、抗纖維化和抗細(xì)胞凋亡等過程有關(guān)［13］。李上海等［14］研究表明在心肌缺血再灌注損傷中β-catenin的表達(dá)下調(diào)能夠抑制MIRI的發(fā)展。

本文在成功構(gòu)建了MIRI大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過對照干預(yù)觀察大鼠模型療效作用。發(fā)現(xiàn)在MIRI組中Wnt2蛋白表達(dá)量無顯著變化，而SDF組的Wnt2表達(dá)量顯著高于sham組和MIRI組，提示SDF的作用與過表達(dá)Wnt2蛋白可能有關(guān)。Wnt2的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖［15］，參與血管生成并在干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中起重要作用［16］，SDF上調(diào)Wnt2的表達(dá)有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和心肌組織修復(fù)，這對MIRI的康復(fù)至關(guān)重要。通過檢測VEGF的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SDF組大鼠VEGF的表達(dá)量顯著升高。進(jìn)一步說明SDF可能通過上調(diào)Wnt2蛋白，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以保障心肌組織修復(fù)。

β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達(dá)，主要和細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控有關(guān)［15］。通過KEGG查找發(fā)現(xiàn)Wnt2和β-catenin呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系，Wnt2表達(dá)的上調(diào)會(huì)抑制β-catenin的表達(dá)，繼而減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明，SDF組Wnt2表達(dá)顯著上調(diào)時(shí)，該組β-catenin的表達(dá)顯著下降，血清VEGF的含量顯著升高，這說明SDF的作用機(jī)制之一可能是通過促進(jìn)Wnt2的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)血管的生成并與緩解MIRI引起的損傷有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ ?GUDNADOTTIR G S， JAMES S K， ANDERSEN K， et al. Outcomes after STEMI in old multimorbid patients with complex health needs and the effect of invasive management［J］. Am Heart J， 2019， 211：11-21.

［2］ ANSARI M， GOPALAKRISHNAN S， KURIAN G A. Streptozotocin-induced type II diabetic rat administered with nonobesogenic high-fat diet is highly susceptible to myocardial ischemia-reperfusion injury：an insight into the function of mitochondria［J］. J Cell Physiol， 2019， 234（4）：4104-4114.

［3］ ?李睿，江揚(yáng)帆，童琳，等.龍血竭總黃酮對免疫性肝纖維化大鼠肝臟中TGF-β1表達(dá)的影響［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（4）：549-553.

［4］ ?安海文，李燕林，李李，等.龍血竭膠囊對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2019，34（3）：577-582.

［5］ ?張麗，王緒平，黃孝聞，等.血竭及龍血竭化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2019，36（20）：2605-2611.

［6］ ?LIU B， WU S， MA J， et al. lncRNA GAS5 reverses EMT and tumor stem cell-mediated gemcitabine resistance and metastasis by targeting miR-221/SOCS3 in pancreatic cancer［J］. Mol Ther Nucleic Acids， 2018， 13：472-482.

［7］ ?RONG M， CHEN S Y， ZAMBRANO R， et al.? Inhibition of β-catenin signaling protects against CTGF-induced alveolar and vascular pathology in neonatal mouse lung［J］. Pediatr Res， 2016， 80（1）：136-144.

［8］ ?劉悅，任建軍，劉雅，等.七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠心肌缺血再灌注時(shí)血栓素A2和前列腺素I2的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2011，31（2）：240-244.

［9］ ?賀建東，韓沖芳，董玥穎，等.七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠心肌缺血再灌注時(shí)HO-1表達(dá)的影響［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19（8）：1-3.

［10］ ?梁麗梅，馮湘玲，劉燕，等.龍血竭總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用研究［J］.中國臨床新醫(yī)學(xué)，2017，10（9）：857-860.

［11］ ?方偉蓉，李運(yùn)曼，鄧嘉元.龍血竭總黃酮對動(dòng)物心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（9）：1020-1024.

［12］ ?鄧嘉元，李運(yùn)曼，方偉蓉.龍血竭總黃酮對乳鼠損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國天然藥物，2006，4（5）：373-376.

［13］ ?綦鈺瑩，齊雯麗，鄭衛(wèi)紅.心肌缺血-再灌注損傷的促損傷性與保護(hù)性信號通路研究進(jìn)展［J］.生命的化學(xué)，2020，40（6）：911-918.

［14］ ?李上海，梁偉鈞，張亞娟，等.β結(jié)合素與大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制［J］.心腦血管病防治，2014，14（3）：192-194，197.

［15］ ?肖啟程，嚴(yán)光文，田一男，等.Wnt信號配體種類及其在骨代謝中的作用［J］.中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2018，11（6）：613-619.

［16］ ?夏曦.Id1通過上調(diào)Wnt2表達(dá)調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞周期的研究［D］.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2016.

（收稿日期：2022-12-22 修回日期：2023-03-01）

（編輯：潘明志）