川芎對(duì)衰老大鼠腦保護(hù)作用及對(duì)PI3K/AKT/HIF-1α通路的影響

劉堯　張建軍　李振皓　朱映黎　張?！纺取￡悘￡悂單摹√杖弧⊥醮尽±蠲黛汀⊥趿衷?/p>

摘要 目的：通過(guò)構(gòu)建衰老合并血瘀大鼠模型，探討川芎小劑量久服對(duì)于延緩衰老腦保護(hù)的藥效及作用機(jī)制，為川芎的臨床用藥提供依據(jù)。方法：將66只SD大鼠分為空白組、模型組、維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組，每組11只。除空白組外各組腹腔注射D-半乳糖（300 mg/kg）連續(xù)42 d，同時(shí)繼續(xù)造模并給藥14 d，第15天冰水浴20 min，連續(xù)14 d，最后1 d注射0.1%腎上腺素0.8 mg/kg。WST-1法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（SOD）、比色法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性、總抗氧化能力（T-AOC），TBA法檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基（PC）含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)腦組織一氧化氮（NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血栓素B2（TXB2）、內(nèi)皮素（ET）-1含量。蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）測(cè)定檢測(cè)腦組織磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白、蛋白激酶B（AKT）蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)量。結(jié)果：與空白組比較，模型組體質(zhì)量下降（P<0.001），血清SOD、GSH-PX、T-AOC含量降低（P<0.001，P<0.01，P<0.01），MDA、PC含量升高（P<0.001），腦組織NO、TXB2、ET-1含量升高（P<0.001，P<0.05，P<0.001），eNOS含量降低（P<0.01），HIF-1α表達(dá)量降低（P<0.05）；與模型組比較，川芎2 g及4 g能升高血清GSH-Px含量，增加T-AOC，降低腦組織NO、TXB2、ET-1含量，升高eNOS（P<0.01），川芎4 g可以增加HIF-1α蛋白表達(dá)量（P<0.01）。川芎1 g與人參1 g配伍后進(jìn)一步升高血清SOD、GSH-Px含量，降低血清MDA、PC含量，降低腦組織NO、TXB2、ET-1含量（P<0.001，P<0.05，P<0.001），升高eNOS（P<0.001），增加HIF-1α蛋白表達(dá)量（P<0.01）。結(jié)論：對(duì)衰老合并血瘀大鼠模型，川芎小劑量久服即可改善內(nèi)皮功能，抑制氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化作用；川芎劑量減少并與人參配伍后可以起到協(xié)同增效作用，可能通過(guò)HIF-1α通路對(duì)腦起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 川芎；久服；劑量；衰老；活血化瘀；抗氧化

Protective Effect of Ligusticum chuanxiong on Brain of Aging Rats and Its Impact on PI3K/AKT/HIF-1α Pathway

LIU Yao1，ZHANG Jianjun1，LI Zhenhao2，ZHU Yingli1，ZHANG Rui1，YUE Na1，CHEN Yan1，CHEN Yawen1，TAO Ran1，WANG Chun1，LI Mingyan2，WANG Linyuan1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Zhejiang Engineering Research Center of Rare Medicinal Plants，Wuyi 321200，China）

Abstract Objective：To observe the protective effect and mechanism of low-dose Ligusticum chuanxiong for long-term administration on delaying aging brain by constructing an aging rat model with blood stasis，to provide a basis for clinical medication of L.chuanxiong.Methods：A total of 66 SD rats were divided into blank group，model group，vitamin E group，2 g L.chuanxiong group，4 g L.chuanxiong group and 2 g L.chuanxiong+Panax ginseng group，with 11 in each group.All groups，except the blank group，were given D-galactose（300 mg/kg，ip） for 42 consecutive days，during which drugs were administered for 14 days.On the 15th day，the rats were given ice water bath for 20 minutes for 14 consecutive days，and 0.1% of 0.8 mg/kg adrenaline was injected on the last day.Serum superoxide dismutase（SOD） was detected by WST-1 assay，and the glutathione peroxidase（GSH-Px） activity and total antioxidant capacity（T-AOC） was detected by colorimetry.Malondialdehyde（MDA），a product of lipid peroxidation，was detected by thiobarbituric acid（TBA） method.Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the content of protein carbonyl compounds（PC） and the contents of nitric oxide（NO），endothelial nitric oxide synthase（eNOS），thromboxane B2（TXB2） and endothelin-1（ET-1） in brain tissue.Western blot was used to detect the expressions of phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K），protein kinase B（AKT） and hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α） in brain tissue.Results：Compared with the blank group，the model group had decreased body weight（P<0.001），lowered SOD，GSH-Px and T-AOC（P<0.001，P<0.01，P<0.01），eNOS（P<0.01） and HIF-1α（P<0.05） and increased MDA and PC（P<0.001） and NO，TXB2 and ET-1（P<0.001，P<0.05，P<0.001）.Compared with the model group，2 g and 4 g L.chuanxiong up-regulated GSH-Px，enhanced T-AOC，reduced NO，TXB2 and ET-1，and elevated eNOS（P<0.01）.In addition，4 g L.chuanxiong increased HIF-1α（P<0.01）.After combination of 1 g L.chuanxiong and 1 g P.ginseng，SOD and GSH-Px were elevated，while MDA and PC were lowered; there was a decrease in NO，TXB2 and ET-1（P<0.001，P<0.05，P<0.001） while an increase in eNOS（P<0.001）; HIF-1α was increased（P<0.01）.Conclusion：For the aging rat model with blood stasis，low-dose L.chuanxiong can improve endothelial function and inhibit oxidative stress，exerting an antioxidant effect.L.chuanxiong at a reduced dose plays a synergistic role with P.ginseng，which may protect the brain through HIF-1α pathway.

Keywords Ligusticum chuanxiong Hort; Long-term administration; Dose; Aging; Activating blood and resolving stasis; Antioxidation

中圖分類號(hào)：R282文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.008

川芎味辛，溫。主治中風(fēng)入腦、頭痛、寒痹、筋攣緩急。能上行頭目，下行血海。通肝經(jīng)，為血中之氣藥也［1］?，F(xiàn)代研究表明川芎對(duì)腦血管系統(tǒng)具有抗衰老［2］、擴(kuò)張血管［3］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［4］、增強(qiáng)腦內(nèi)血流量、改善微循環(huán)［5］等作用。隨著人口老齡化的到來(lái)，腦部疾病等與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重影響老年患者的生活，如缺血性腦卒中、阿爾茨海默病、血管性癡呆等［6］?，F(xiàn)代研究表明其與氧化應(yīng)激有關(guān)，同時(shí)伴隨著明顯的血管衰老表現(xiàn)［7］。中醫(yī)“因瘀致衰”理論認(rèn)為老年多氣虛，易造成瘀血，瘀血內(nèi)阻致臟腑功能失調(diào)，血瘀加重疾病的發(fā)生發(fā)展［8］。中藥久服對(duì)于老年患者心腦血管慢性疾病，如慢性腦缺血，以及腦梗死后遺癥，比較西藥對(duì)癥治療，能起到一定的改善癥狀、緩解病情、延緩病情、提高預(yù)后的作用。與久服相伴的是對(duì)藥物劑量、服用時(shí)間、藥效及藥物安全性的探討［9］。

川芎作為活血化瘀類藥物單味即可改善腦部血液循環(huán)，減輕腦缺血損傷，對(duì)缺血再灌注損傷腦組織有保護(hù)作用，以其為核心的補(bǔ)陽(yáng)還五湯、芎湯等臨床常用來(lái)治療腦血管疾?。?0］。但川芎辛溫升散，久服易散真氣，能否通過(guò)降低劑量或者合理配伍改善內(nèi)皮功能，抑制氧化應(yīng)激延緩腦衰老，發(fā)揮對(duì)腦的保護(hù)作用有待研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建衰老合并血瘀大鼠模型首次研究川芎不同劑量及配伍應(yīng)用條件下“久服”對(duì)延緩腦組織衰老的作用，探討川芎對(duì)衰老合并血瘀大鼠腦保護(hù)作用及機(jī)制，為其臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)8周齡雄性SD大鼠66只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，大鼠自由飲水、攝食，12/12 h日燈光模擬白天黑夜，以標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂食。本研究通過(guò)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：BUCM-4-2021032401-1052）。

1.1.2 藥物 D-半乳糖（上海源葉生物有限公司，批號(hào)：R24O11H128688）；腎上腺素注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2107262）；維生素E軟膠囊（天津市中央藥業(yè)有限公司，批號(hào)：210211）；川芎配方顆粒（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：21010061）；人參配方顆粒（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：21006942）。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)：20220303）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：20211123）、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）試劑盒（批號(hào)：20211123）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)：20220304）、總蛋白定量測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20211223）、ATP酶測(cè)試盒（批號(hào)：20220506），以上試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蛋白質(zhì)羰基（Protein Carbonyl，PC）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：202203），購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；一氧化氮（Nitric Oxide，NO）（批號(hào)：20220705）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；內(nèi)皮素-1（Endothelin 1，ET-1）試劑盒（批號(hào)：20220629）、血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）試劑盒（批號(hào)：20220629）由北京康佳宏原生物科技有限公司提供。磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：4257）、蛋白激酶B（Protein Kinase，AKT）抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：9272）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-Inducible Factor 1α，HIF-1α）抗體（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：AB179483），β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：4967），酶標(biāo)分析儀（賽默飛世爾科技，美國(guó)，型號(hào)：Multiskan MK3）、凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：620013-9Q）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組（n=11）和造模大鼠（n=55）。造模大鼠從造模第1天起按每10 g體質(zhì)量腹腔注射0.1 mL D-半乳糖（300 mg/kg），連續(xù)42 d，于第43天眼眶取血，檢測(cè)大鼠血清MDA含量。后隨機(jī)分為模型組、維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組，每組11只。同時(shí)繼續(xù)造模并給藥14 d，第15天開始冰水浴20 min，連續(xù)14 d，最后1 d注射0.1%腎上腺素0.8 mg/kg?？瞻捉M每日給予普通飼料喂食，腹腔注射等劑量生理鹽水，共70 d。

1.2.2 給藥方法 各給藥大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，維生素E組（0.02 g/kg，相當(dāng)于人日用量0.2 g/d）、川芎2 g組（0.20 g/kg，相當(dāng)于人日用量2 g/d），川芎4 g組（0.40 g/kg，相當(dāng)于人日用量4 g/d），川芎配伍人參2 g組（0.20 g/kg，相當(dāng)于人日用量2 g/d），空白組、模型組每天灌胃雙蒸水，連續(xù)28 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 觀察大鼠體質(zhì)量 給藥后每2周記錄體質(zhì)量變化。

1.2.3.2 大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、PC含量檢測(cè) 最后1次給藥后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置4 h，4 ℃，3 500 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，分離血清，按試劑盒檢測(cè)血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、PC含量。

1.2.3.3 大鼠腦組織NO、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）、TXB2、ET-1含量檢測(cè) 取大鼠腦組織，按組織重量體積比1∶9加入預(yù)冷0.9%生理鹽水，并勻漿，分別制備成10%的組織勻漿，4 000 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，取上清液。利用總蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）測(cè)定蛋白濃度后，按試劑盒檢測(cè)腦組織中NO、eNOS、TXB2、ET-1含量。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blotting）法檢測(cè)PI3K、AKT、HIF-1α蛋白表達(dá) 取大鼠腦部分，按組織重量體積比1∶9，在冰上加入含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法裂解液裂解，機(jī)械研磨勻漿后12 000 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照1∶4加入5×Loading Buffer，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，分別加入PI3K（1∶1 000稀釋）、AKT（1∶1 000稀釋）、HIF-1α（1∶1 000稀釋）、β-actin（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗3次，10 min/次。加入二抗（1∶10 000稀釋）室溫溫育1 h，TBST洗3次，10 min/次，電化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像儀曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 給藥4周后，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著下降（P<0.001）；與模型組比較，維生素E組能顯著提高大鼠體質(zhì)量（P<0.001），川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能提高大鼠體質(zhì)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01、P<0.05、P<0.05）。見表1。

2.2 對(duì)大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清SOD含量降低（P<0.001）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組與川芎配伍人參2 g組均能顯著升高SOD含量（P<0.01、P<0.05、P<0.001）；與川芎4 g組比較，川芎配伍人參2 g組顯著升高SOD含量（P<0.001）。與空白組比較，模型組大鼠血清GSH-Px含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能夠升高GSH-Px含量（P<0.01、P<0.001、P<0.01、P<0.001）；與川芎4 g組比較，川芎配伍人參2 g組顯著升高GSH-Px含量（P<0.01）。與空白組比較，模型組大鼠血清T-AOC含量降低（P<0.05）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組均能夠升高T-AOC含量（P<0.001、P<0.001、P<0.001）。見表2。

2.3 對(duì)大鼠血清MDA和PC的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清MDA含量明顯升高（P<0.001）；與模型組比較，川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能夠降低MDA含量（P<0.01、P<0.01）。與空白組比較，模型組大鼠血清PC含量明顯升高（P<0.001）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組及川芎配伍人參2 g組均能顯著降低PC含量（P<0.001、P<0.05、P<0.05）。見表3。

2.4 對(duì)大鼠腦組織NO、eNOS的影響 與空白組比較，模型組大鼠腦組織NO含量顯著降低（P<0.001）；與模型組比較，各組均能組顯著降低NO含量（P<0.05，P<0.001）。與空白組比較，模型組大鼠腦組織中eNOS含量明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能夠升高eNOS含量（P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.001）。見表4。

2.5 對(duì)大鼠腦組織TXB2、ET-1的影響 與空白組比較，模型組大鼠腦組織內(nèi)TXB2含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能降低TXB2含量（P<0.05、P<0.05、P<0.05、P<0.01）。與空白組比較，模型組大鼠腦組織ET-1含量升高（P<0.001）；與模型組比較，維生素E組、川芎2 g組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g組均能顯著降低其含量（P<0.01、P<0.01、P<0.001、P<0.001）。見表5。

2.6 對(duì)大鼠腦組織PI3K、AKT、HIF-1α蛋白表達(dá)量的影響 與空白組比較，模型組大鼠心臟組織中PI3K、AKT表達(dá)有降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HIF-1α表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，維生素E組、川芎4 g、川芎配伍人參2 g中HIF-1α表達(dá)顯著增加（P<0.01），PI3K、AKT表達(dá)有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表6，圖1。

3 討論

腦卒中、阿爾茨海默病、血管性癡呆、帕金森病等腦部疾病在老年人群中呈高發(fā)病率的趨勢(shì)，影響老年健康及生活?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腦部退行性疾病與衰老密不可分［11］，機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)自由基失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是造成衰老的重要因素，從而使神經(jīng)元內(nèi)積累聚集性蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物［12］。此外衰老致內(nèi)皮功能紊亂、血管生成受損，微循環(huán)產(chǎn)生障礙［13］。中醫(yī)認(rèn)為衰老多由氣血失調(diào)引起，氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行致瘀血形成。《血證論》中有：“血在上，則濁蔽而不明矣?！薄夺t(yī)林改錯(cuò)》中亦云：“凡有瘀血也令人善忘?！笨梢婐鲅芍隆按舨　薄敖⊥保?4］。研究表明，在高血壓及其并發(fā)癥、阿爾茨海默病等發(fā)病過(guò)程中伴有明顯的血瘀，血瘀又加重疾病進(jìn)程［15-16］。中醫(yī)久服多用于慢性病調(diào)理，能在一定程度上延緩病情，通過(guò)延長(zhǎng)給藥時(shí)間達(dá)到療效。具體給藥時(shí)間以臨床起效為主。

川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。川芎中主要活性成分川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）、阿魏酸具有抗血小板凝集、擴(kuò)張血管、改善腦部血液循環(huán)、減輕腦缺血損傷等作用［17］。研究表明，TMP可能通過(guò)抑制炎癥和改善神經(jīng)元核蛋白表達(dá)來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞增殖，減輕腦缺血再灌注損傷［18］。此外還可通過(guò)調(diào)節(jié)血栓素A2，/前列環(huán)素（Thromboxane A2，TXA2／Prostacyclin，PGI2）失衡狀態(tài)，起到抗血栓作用。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射D-半乳糖，通過(guò)冰水浴及注射腎上腺素構(gòu)建衰老合并寒凝血瘀氧化損傷模型，給予川芎2 g、4 g劑量28 d，探討川芎在小劑量及配伍應(yīng)用下久服延緩腦衰老的作用及機(jī)制。

研究表明，當(dāng)機(jī)體處于衰老狀態(tài)時(shí)，SOD及GSH-Px活性明顯降低，MDA及PC含量升高［19］。本實(shí)驗(yàn)表明模型組血清中SOD、GSH-Px的含量降低，MDA、PC含量上升，提示大鼠處于衰老狀態(tài)。與模型組比較，川芎2 g、4 g組升高血清中SOD、GSH-Px含量及降低血清MDA、PC含量，從而減輕大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。血管內(nèi)皮功能障礙是血管衰老的早期病理改變，可引起內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cell，EC）分泌的血管調(diào)節(jié)因子水平發(fā)生改變，ET-1、NO作為血管收縮和舒張物質(zhì)，能夠維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)［20］。NO由神經(jīng)元型一氧化氮合酶（Neuronal Nitric Oxide Synthase，nNOS）、誘生型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）和eNOS3種一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）催化底物L(fēng)-精氨酸而生成。低濃度的NO具有舒張血管、抑制血小板黏附聚集，防止血栓形成等作用［21］。eNOS產(chǎn)生的NO可能通過(guò)清除活性氧而具有腦神經(jīng)保護(hù)作用［22］。然而血瘀造成腦血流量減少，氧化應(yīng)激下活化的iNOS可合成并分泌大量的NO，刺激ET-1生成，并使神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，引起神經(jīng)血管單位功能障礙，導(dǎo)致血管的收縮與舒張功能受損［23］。TXB2可促進(jìn)血小板黏附、聚集、血管收縮，促進(jìn)血栓形成。隨著腦內(nèi)血栓素的含量升高，ET濃含量增加，使缺血區(qū)血管產(chǎn)生強(qiáng)烈、持久性收縮，加重缺血和腦組織損傷［24］。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈硬化閉塞癥血瘀證、氣虛血瘀型腦梗患者中存在血管EC增殖活性降低，EC損傷，ET、NO的含量明顯增高等［25］。

本實(shí)驗(yàn)表明，模型組下調(diào)eNOS，上調(diào)NO、ET-1、TXB2含量，提示大鼠腦氧化損傷，這可能與NO可刺激EC凋亡，造成血管壁局部的血栓形成有關(guān)［26］。與模型組比較，川芎2 g、4 g組降低腦組織中NO，ET-1、TXB2含量，升高eNOS含量，從而改善內(nèi)皮功能紊亂，抑制NO含量升高引起的氧化應(yīng)激。PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及自噬，其激活是缺血后機(jī)體的保護(hù)機(jī)制之一，eNOS是該信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)［27］，細(xì)胞內(nèi)底物如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等均可通過(guò)激活受體酪氨酸激酶使PI3K磷酸化，產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（Phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3），其與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)蛋白AKT及3-磷酸肌醇依賴性激酶-1（3-phosphoinositide-dependent Kinase 1，PDK1）結(jié)合，活化后的AKT可調(diào)控eNOS、NO的生成［28］，另有研究表明其活化后激活核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear Factor E2-related Factor 2，Nrf2）蛋白表達(dá)［29］。HIF-1由α、β亞單位組成，HIF-1α在低氧中穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)缺血壞死后新生血管的形成起關(guān)鍵調(diào)控作用［30］。另有研究證實(shí)NO參與調(diào)控HIF-1α的活化表達(dá)，作用機(jī)制可能是阻斷Fe2+綁定脯氨酰羥化酶，從而阻斷α亞基的降解［31］。本實(shí)驗(yàn)表明模型組HIF-1α蛋白表達(dá)顯著上升，PI3K/AKT蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與模型組比較，川芎2 g、4 g組激活HIF-1α蛋白表達(dá)。研究進(jìn)一步說(shuō)明活血化瘀藥川芎可能是在一定程度上改善內(nèi)皮功能紊亂，改善腦血管微循環(huán)，推動(dòng)氣血運(yùn)行，減輕血瘀狀態(tài)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而延緩衰老，保護(hù)腦功能。

川芎辛溫升散，通過(guò)中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)建立處方數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘得出臨床用于治療頭痛等腦部疾病時(shí)湯劑中川芎平均用量為11.68 g［32］。更有研究表明單藥川芎給予7.5 g時(shí)，可以升高D-半乳糖衰老模型腦組織中SOD、GSH-Px含量，降低MDA、MAO含量，具有良好的延緩衰老的作用［33］。川芎?jiǎn)斡媚茱@著降低腦缺血-再灌注大鼠皮層TNF-α含量［34］。《景岳全書》記載川芎多服久服，令人走散真氣，能致暴亡?！熬梅彼幬镄杈邆浜芨叩陌踩?，需要緩緩以小劑量藥物扶持，產(chǎn)生較為溫和的干預(yù)作用，由量變到質(zhì)變從而維護(hù)健康［9］。老年氣虛，素體虛弱，用藥不宜多量，本實(shí)驗(yàn)表明，川芎2 g，4 g小劑量下對(duì)血清抗氧化指標(biāo)可產(chǎn)生一定作用，并能改善腦內(nèi)皮功能。通過(guò)進(jìn)一步降低劑量至1 g并與補(bǔ)氣藥人參1 g配伍益氣活血，其效果優(yōu)于單味川芎2 g及4 g?！侗静輦湟氛J(rèn)為川芎?jiǎn)畏t臟有偏勝，久服則過(guò)劑生邪，故有此失。若有配合節(jié)制，則不至此矣［35］。因此川芎臨床應(yīng)用中，多以藥對(duì)或方劑形式應(yīng)用。配伍是中藥發(fā)揮藥效的有效形式。川芎多與補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥、清熱藥等相配伍。如黃芪、當(dāng)歸、丹參、赤芍等。川芎-赤芍既能活血化瘀，又可借氣增加行血之力，使行血破滯的功效倍增［36］；川芎、當(dāng)歸可以滋養(yǎng)血脈、活血行氣，使清陽(yáng)之氣上行，為血不配氣頭痛之專用方［37］。臨床以此類方為基礎(chǔ)辨證治療慢性腦缺血。川芎龍蛭湯以川芎地龍為主，能降低TNF-α、降鈣素原水平，進(jìn)而改善腦梗死氣虛血瘀證微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能重建［38］。文獻(xiàn)研究表明川芎治療腦部疾病等配伍補(bǔ)虛藥頻率最高［32］。本實(shí)驗(yàn)以人參為例，人參扶正固本，大補(bǔ)元?dú)?，制約川芎“久服散真氣”?！澳X為髓之海，真氣之所聚”，大腦神經(jīng)之思維等屬于真氣的功能表現(xiàn)［39］。本實(shí)驗(yàn)表明川芎配伍人參2 g組對(duì)抗氧化指標(biāo)及腦組織血管內(nèi)皮功能起到改善作用，川芎劑量由2 g減少為1 g并與1 g人參合用后可以改善內(nèi)皮功能，減輕氧化應(yīng)激從而使抗氧化作用增強(qiáng)，優(yōu)于將單味川芎劑量增加到4 g，且益氣活血對(duì)于氧化損傷改善明顯。研究表明，人參-三七-川芎提取物可以延緩血管ECs的衰老，其機(jī)制可能與激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1自噬通路，提升自噬水平有關(guān)［40］。因此推測(cè)其發(fā)揮作用可能與人參補(bǔ)氣推動(dòng)血液運(yùn)行，減輕血瘀帶來(lái)的氧化應(yīng)激，延緩內(nèi)皮衰老起到協(xié)同增效的作用。

人口老齡化日益嚴(yán)重，老年人作為特殊人群，中藥臨床安全應(yīng)用尤為重要，如何發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)防治老年病，顯得十分必要［41］。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建衰老合并血瘀氧化損傷模型，針對(duì)老年血瘀狀態(tài)下，探討川芎小劑量下久服對(duì)于延緩腦衰老的藥效及作用機(jī)制，比較單味藥不同劑量下及配伍后其藥效，從而闡明川芎的用藥配伍規(guī)律，為臨床用藥的安全性、有效性、合理性提供依據(jù)。

利益沖突聲明：無(wú)。

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（2022-11-15收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706800）作者簡(jiǎn)介：劉堯（1996.09—），女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥基本理論與物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：lyao611@163.com通信作者：王林元（1961.10—），男，碩士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥基本理論與中藥新技術(shù)，E-mail：wangly@bucm.edu.cn；李振皓（1987.07—），男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理藥效研究，E-mail：zhenhao6@126.com