韓冰 郭亞杰 金婷婷 孫向榮

［摘要］ 目的 探討鈣離子敏感受體（CaSR）激動(dòng)劑R568對(duì)小鼠食物攝入量的影響及其機(jī)制。

方法 將雄性KM小鼠隨機(jī)分為R568組、二甲基亞砜（DMSO）組、膽囊收縮素A（CCKA）受體拮抗劑L－364，718+R568組和NPS－2143+R568組，每組8只，采用攝食分析方法，觀察灌胃R568對(duì)小鼠食物攝入量的影響。將小鼠隨機(jī)分為DMSO組和R568組（每組7只），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法觀察R568對(duì)小鼠血清、胃腸組織胃饑餓素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）、酪酪肽（PYY）、胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）及下丘腦CCK、Ghrelin含量變化的影響；采用熒光免疫組化染色方法，觀察R568對(duì)下丘腦室旁核（PVN）、外側(cè)區(qū)（LHA）、弓狀核（ARC）中c－fos表達(dá)的影響。將小鼠分為DMSO組和R568組（n=7），采用高效液相色譜（HPLC）法觀察R568對(duì)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）和5－羥色胺（5－HT）含量變化的影響。

結(jié)果 與DMSO組相比，R568灌胃后0～2 h內(nèi)小鼠攝食量顯著降低（F=5.274、5.225，P<0.01），并且這種作用能被CaSR阻斷劑NPS－2143阻斷；與DMSO組相比較，R568組胃和血清Ghrelin含量顯著降低（t=2.995、4.939，P<0.05），近端小腸和血清CCK含量顯著增高（t=3.223、4.970，P<0.05），而PYY和GLP－1無(wú)明顯變化（P>0.05）。R568灌胃后小鼠下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加（t=3.508～6.169，P<0.01）。與DMSO組相比，R568灌胃后下丘腦DA含量顯著減少（t=3.288，P<0.05），下丘腦5－HT、CCK及Ghrelin含量差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

結(jié)論 胃腸道CaSR激活后引起小鼠的攝食量減少，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)胃腸道CCK和Ghrelin分泌，調(diào)控下丘腦PVN、LHA、ARC神經(jīng)元的興奮性以及下丘腦DA的分泌有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 受體，鈣敏感；下丘腦；進(jìn)食；神經(jīng)肽類；多巴胺

［中圖分類號(hào)］ R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0163－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.067

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

鈣離子敏感受體（CaSR）是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的釋放來控制鈣穩(wěn)態(tài)。研究表明，CaSR在胃基底膜細(xì)胞、G細(xì)胞及腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)均有表達(dá)。近年來CaSR在調(diào)節(jié)胃腸功能中的作用逐漸被重視。CaSR作為營(yíng)養(yǎng)感受器，可以被Ca2+和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物L(fēng)－氨基酸激活，參與腸道液體轉(zhuǎn)運(yùn)和炎癥反應(yīng)的調(diào)控。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，CaSR激動(dòng)劑 R568已被普遍應(yīng)用于CaSR功能學(xué)的研究。胃腸道是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官，刺激胃腸道可產(chǎn)生多種肽類激素，包括膽囊收縮素（CCK）、胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）、酪酪肽（PYY）等，這些肽類激素通過腦腸軸將信號(hào)傳向中樞，使機(jī)體產(chǎn)生飽腹感，從而終止攝食?？崭箷r(shí)胃腸道可釋放胃饑餓素 （Ghrelin），促進(jìn)進(jìn)食。以往的研究結(jié)果顯示，胃腸道攝食調(diào)節(jié)激素的分泌與CaSR密切相關(guān)。此外，下丘腦為攝食調(diào)節(jié)的中心，包括弓狀核（ARC）、室旁核（PVN）、外側(cè)區(qū)（LHA）等腦區(qū)，這些腦區(qū)的神經(jīng)元對(duì)攝食功能的調(diào)控由多種神經(jīng)遞質(zhì)參與完成，包括一些肽類神經(jīng)遞質(zhì)（如CCK和Ghrelin）以及一些胺類神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺（DA）和5－羥色胺（5－HT））。有研究顯示，在下丘腦神經(jīng)元上有大量的CCK、Ghrelin、DA和5－HT受體，進(jìn)一步說明這些神經(jīng)遞質(zhì)參與下丘腦功能的調(diào)節(jié)。本文研究探討CaSR激動(dòng)劑R568對(duì)小鼠攝食的影響，并從調(diào)控胃腸激素分泌、對(duì)中樞攝食相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元興奮性的影響和相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的角度揭示其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性KM小鼠60只，體質(zhì)量25～30 g， 購(gòu)于青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)間室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～50%，光照12 h/12 h晝夜循環(huán)，室內(nèi)提供充足的食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)系動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 CaSR激動(dòng)劑R568（Tocris bioscience，英國(guó)）；CaSR拮抗劑NPS－2143（Glpbio，美國(guó)）；膽囊收縮素A（CCKA）受體拮抗劑L－364，718（Tocris bioscience，英國(guó)）；多聚甲醛（Sigma－Aldrich，美國(guó)）；鼠抗c－fos抗體（Abcam，英國(guó)）；熒光素Cy3標(biāo)記的二抗（Jackson Immunoresearch，美國(guó)）。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 外周給藥R568對(duì)小鼠攝食量的影響 將小鼠隨機(jī)分為二甲基亞砜（DMSO，1 mg/kg）對(duì)照組（A組）、R568（3.0 μg/g）給藥組（B組）、CCKA受體拮抗劑L－364，718（50 mg/kg）+R568（3.0 μg/g）組（C組）、NPS－2143（20 μg/g）+R568（3.0 μg/g）組（D組），每組8只小鼠。實(shí)驗(yàn)從18：00開始，籠子里放置預(yù)先稱質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)飼料，各組小鼠灌胃給藥0.3 mL后，分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，收集每個(gè)籠子剩余的飼料，稱量后記錄，計(jì)算出給藥后0～、1～、2～、4～24 h小鼠的攝食量。

1.2.2 攝食相關(guān)肽表達(dá)檢測(cè) 選取14只小鼠隨機(jī)分為R568組（3.0 μg/g）、 DMSO對(duì)照組（1 mg/kg）（n=7），灌胃給藥1 h后，眼球取血，室溫下放置2 h凝聚后取血清；同時(shí)脫臼處死小鼠，取出胃腸組織，剪開沖洗干凈，稱質(zhì)量，按1∶9加入相應(yīng)體積的0.01 mol/L PBS進(jìn)行研磨，之以3 000 r/min速度離心20 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法，檢測(cè)小鼠血清、胃腸道CCK、Ghrelin、PYY、GLP－1和下丘腦CCK、Ghrelin含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 免疫熒光染色法檢測(cè)下丘腦內(nèi)參與攝食的相關(guān)腦區(qū)c－fos的表達(dá) 小鼠靜脈注射戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉，斷頭取腦，在40 g/L甲醛溶液中固定6～8 h，再置于300 g/L蔗糖溶液中脫水。按照小鼠腦圖譜，找到下丘腦，冷凍切片，厚度10～15 μm，放入－40 ℃冰箱保存。按相關(guān)文獻(xiàn)方法，將組織處理之后滴加抗鼠c－fos抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；滴加Cy3標(biāo)記的二抗（羊抗鼠，1∶300），室溫孵育2 h。封片，BX53熒光顯微鏡下觀察核團(tuán)內(nèi)c－fos免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，并拍照。每張切片選擇4～6個(gè)不重疊的0.01 mm2 視野，使用CellProfiler－3.1.8軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的

含量 將14只小鼠分別灌胃給藥3.0 μg/g R568或10 g/L DMSO，1 h后經(jīng)頸椎脫臼處死，分離下丘腦，存放在－80 ℃冰箱。①神經(jīng)遞質(zhì)提?。簻?zhǔn)確稱量樣品，按1∶5的比例加入高氯酸溶液（0.6 mol/L），超聲勻漿，4 ℃離心（10 000 r/min， 20 min）。取上清與1.4倍體積的混合液體（20 mmol/L檸檬酸鉀，300 mmol/L磷酸氫二鉀，2 mmol/L EDTA二鈉鹽，雙蒸水配制），4 ℃離心（10 000 r/min， 20 min），取上清液進(jìn)行色譜分析。②色譜條件為：色譜柱為Kinetex C18 100A 2.6 μm，

50.0 mm×2.1 mm，流動(dòng)相為甲醇∶雙蒸水=90∶10，0.45 μm微孔膜過濾，超聲波脫氣，流量1.0 mL/min，注入量10 μL/min；發(fā)射波長(zhǎng)330 nm，激發(fā)波長(zhǎng)290 nm；柱溫30 ℃。③樣品含量測(cè)定：將20 μL樣品溶液注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定下丘腦肽類神經(jīng)遞質(zhì)Ghrelin、CCK和胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA和5－HT的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，

多組數(shù)據(jù)間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用LSD法；兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 R568灌胃對(duì)小鼠攝食量的影響

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，各組小鼠攝食量比較，組別差異有顯著性（F組別=165.800，P<0.01），時(shí)間差異無(wú)顯著性（F時(shí)間=1.147，P>0.05），時(shí)間與組別無(wú)交互作用（F組別×?xí)r間=1.263，P>0.05）。與DMSO組相比，R568給藥組攝食量在0～、1～時(shí)段明顯減少（F=5.274、5.225，P<0.01），而2～24 h內(nèi)小鼠攝食量差異無(wú)顯著性（P>0.05）；L－364，718+R568組和NPS－2143+R568組0～、1～時(shí)段小鼠攝食量差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。與R568組相比，0～、1～時(shí)段的NPS－2143+R568組攝食量明顯增加（P<0.05），而0～2 h內(nèi)L－364，718+R568組小鼠的攝食量也有增加的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組組內(nèi)不同時(shí)間小鼠攝食量差異均有顯著性（F=55.000～250.900，P<0.001）。見表1。

2.2 R568灌胃對(duì)小鼠血清、胃及小腸內(nèi)攝食相關(guān)肽類激素含量的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組相比，R568組血清和胃內(nèi)Ghrelin的含量顯著降低（t=2.995、4.939，P<0.05），而血清和近端小腸CCK的含量顯著增高（t=3.223、4.971，P<0.05），血清和遠(yuǎn)端小腸PYY、GLP－1的含量無(wú)明顯變化（P>0.05）。見表2、3。

2.3 R568灌胃對(duì)小鼠下丘腦攝食相關(guān)核團(tuán)c－fos免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)的影響

熒光免疫組化染色顯示，與DMSO組相比較，R568組下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量均明顯增加，差異均具有顯著性（t=3.508～6.169，P<0.05）。見圖1、表4。

2.4 R568灌胃對(duì)小鼠下丘腦肽類和胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響

HPLC結(jié)果顯示，與DMSO組相比，R568組小

鼠下丘腦Ghrelin、CCK、5－HT含量差異無(wú)顯著性（P>0.05），而DA的含量明顯減少（t=3.288，P<0.05）。見表5。

3 討論

胃腸肽類激素通過刺激機(jī)體產(chǎn)生饑餓或者飽腹信號(hào)而促進(jìn)攝食或停止進(jìn)食，從而使機(jī)體達(dá)到能量平衡，這些肽類激素包括CCK、GLP－1、PYY等具有抑制攝食功能的腦腸肽及Ghrelin等促攝食因子。WANG等研究發(fā)現(xiàn)，L－精氨酸（L－Arg）能夠通過誘導(dǎo)豬十二指腸內(nèi)CCK的分泌來減少食物的攝入，而CaSR拮抗劑NPS－2143能使CCK分泌減少。ACAR等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠十二指腸內(nèi)給予L－色氨酸（L－Phe）后，可以誘導(dǎo)GLP－1的分泌，但是并不能影響PYY的分泌，而且其分泌是通過CaSR介導(dǎo)的。本文研究表明，R568灌胃給藥0～2 h內(nèi)小鼠的攝食量明顯減少，該作用可以被NPS－2143阻斷；ELISA結(jié)果顯示，小鼠血清和胃內(nèi)Ghrelin的分泌減少，而CCK的分泌增加，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致。提示R568通過激活胃腸道的CaSR，調(diào)控分泌Ghrelin的X/A樣內(nèi)分泌細(xì)胞以及分泌CCK的I細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)Ghrelin和CCK分泌，從而起到抑制攝食的作用。本文研究結(jié)果還顯示，R568灌胃并不能影響遠(yuǎn)端小腸GLP－1的分泌，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果不一致，考慮是由于給藥劑量或者給藥方式的不同所造成的；但是R568灌胃不影響PYY的分泌，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致。

胃腸道合成和釋放的肽類激素可以通過血液或者迷走神經(jīng)途徑作用于中樞相關(guān)攝食核團(tuán)，從而影響食欲。本文免疫熒光染色觀察結(jié)果顯示，灌胃給藥R568后，下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目增加，說明外周CaSR激活后影響到下丘腦攝食相關(guān)核團(tuán)神經(jīng)元的興奮性，從而引起小鼠攝食量的改變。本研究R568灌胃給藥對(duì)小鼠攝食量的影響是否與這些核團(tuán)內(nèi)攝食肽的分泌相關(guān)？本文對(duì)其進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，R568灌胃給藥后，下丘腦Ghrelin、CCK和5－HT的含量并無(wú)明顯變化，而DA表達(dá)量明顯減少。大腦內(nèi)的DA能神經(jīng)元主要集中在腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）、下丘腦及中腦黑質(zhì)致密區(qū)，下丘腦中DA主要起促進(jìn)攝食的作用，而VTA中的DA活動(dòng)與獎(jiǎng)賞攝食相關(guān)。由此推測(cè)，R568對(duì)下丘腦神經(jīng)元興奮性的影響以及對(duì)DA合成的影響可能是由外周肽類激素合成的改變，通過神經(jīng)或內(nèi)分泌作用引起的。另一種可能的機(jī)制是，下丘腦攝食相關(guān)核團(tuán)也有CaSR的表達(dá)，而R568呈脂溶性，因此可能透過血－腦脊液屏障，直接進(jìn)入中樞激活CaSR從而引起下丘腦神經(jīng)元興奮性及中樞遞質(zhì)合成的變化。

綜上所述，R568灌胃給藥起厭食作用，該作用和其調(diào)節(jié)消化道肽類激素Ghrelin和CCK的分泌，以及抑制下丘腦DA的合成有關(guān)。而這些肽類激素和神經(jīng)遞質(zhì)的改變進(jìn)一步參與下丘腦相關(guān)攝食核團(tuán)神經(jīng)元的興奮性的調(diào)節(jié)，最終起到抑制攝食的作用。本文研究為深入了解CaSR在能量代謝調(diào)節(jié)方面的作用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為能量代謝性疾病的治療提供新的研究靶點(diǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

VAHE C， BENOMAR K， ESPIARD S， et al. Diseases asso－

ciated with calcium－sensing receptor.? Orphanet Journal of Rare Diseases， 2017，12（1）：19.

HANNAN F M， KALLAY E， CHANG W H， et al. The calcium－sensing receptor in physiology and in calcitropic and noncalcitropic diseases.? Nature Reviews Endocrinology， 2018，15（1）：33－51.

CHENG I， QURESHI I， CHATTOPADHYAY N， et al. Expression of an extracellular calcium－sensing receptor in rat stomach.? Gastroenterology，1999，116（1）：118－126.

CHENG S X. Calcium－sensing receptor inhibits secretagogue－induced electrolyte secretion by intestine via the enteric ner－

vous system.? American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology， 2012，303（1）： G60－G70.

IAMARTINO L， ELAJNAF T， KALLAY E， et al. Calcium－sensing receptor in colorectal inflammation and cancer： current insights and future perspectives.? World Journal of Gas－troenterology， 2018，24（36）：4119－4131.

TANG L Q， PENG M Z， LIU L， et al. Calcium－sensing receptor stimulates Cl（-）－ and SCFA－dependent but inhibits cAMP－dependent HCO3 （-） secretion in colon.? American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology， 2015，308（10）： G874－G883.

ZHENG J， LIU G M， WU C M， et al. Effect of calcium－sen－

sing receptor on the migration and proliferation of porcine intestinal epithelial cells.? Animal Biotechnology， 2021. doi.org/10.1080/10495398.2021.1968885.

MORAN－RAMOS S， TOVAR A R， TORRES N. Diet： friend or foe of enteroendocrine cells： how it interacts with enteroendocrine cells.? Advances in Nutrition， 2012，3（1）：8－20.

NAUCK M A， QUAST D R， WEFERS J， et al. The evolving story of incretins （GIP and GLP－1） in metabolic and cardiovascular disease： a pathophysiological update.? Diabetes， Obesity & Metabolism， 2021，23（Suppl 3）：5－29.

PRINZ P， STENGEL A. Control of food intake by gastrointestinal peptides： mechanisms of action and possible modulation in the treatment of obesity.? Journal of Neurogastroenterology and Motility， 2017，23（2）：180－196.

MIHALACHE L， GHERASIM A， NI‘?O， et al. Effects of ghrelin in energy balance and body weight homeostasis.? Hormones （Athens， Greece）， 2016，15（2）：186－196.

WANG Y， CHANDRA R， SAMSA L A， et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+－sensing receptor.? American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology， 2011，300（4）： G528－G537.

WILLIAMS G， HARROLD J A， CUTLER D J. The hypothalamus and the regulation of energy homeostasis： lifting the lid on a black box.? The Proceedings of the Nutrition Society， 2000，59（3）：385－396.

KONG J T， GAO S L， HE X M， et al. GABAergic neurons in the nucleus accumbens regulate hedonic food intake via ore－

xin－A expression in the lateral hypothalamus.? Iranian Journal of Basic Medical Sciences， 2021，24（9）：1272－1278.

VALASSI E， SCACCHI M， CAVAGNINI F. Neuroendocrine control of food intake.? Nutrition， Metabolism， and Cardiovascular Diseases： NMCD， 2008，18（2）：158－168.

ROMANOVA I V， DERKACH K V， MIKHRINA A L， et al. The leptin， dopamine and serotonin receptors in hypothalamic POMC－neurons of normal and obese rodents.? Neurochemical Research， 2018，43（4）：821－837.

MITHIEUX G. Nutrient control of hunger by extrinsic gastrointestinal neurons.? Trends in Endocrinology and Metabolism， 2013，24（8）：378－384.

WANG C， KANG C C， XIAN Y H， et al. Sensing of L－arginine by gut－expressed calcium sensing receptor stimulates gut satiety hormones cholecystokinin and glucose－dependent insulinotropic peptide secretion in pig model.? Journal of Food Science， 2018，83（9）：2394－2401.

ACAR I， CETINKAYA A， LAY I， et al. The role of calcium sensing receptors in GLP－1 and PYY secretion after acute intraduodenal administration of L－Tryptophan in rats.? Nutritional Neuroscience， 2020，23（6）：481－489.

DATE Y， KOJIMA M， HOSODA H， et al. Ghrelin， a novel growth hormone－releasing acylated peptide， is synthesized in a distinct endocrine cell type in the gastrointestinal tracts of rats and humans.? Endocrinology， 2000，141（11）：4255－4261.

馮晨晨，陳勝良. 膽囊收縮素參與腦－腸軸調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展.? 胃腸病學(xué)， 2010，15（8）：505－507.

ZANCHI D， DEPOORTER A， EGLOFF L， et al. The impact of gut hormones on the neural circuit of appetite and satiety： a systematic review.? Neuroscience and Biobehavioral Reviews， 2017，80：457－475.

VOLKOW N D， WANG G J， BALER R D. Reward， dopamine and the control of food intake： implications for obesity.? Trends in Cognitive Sciences， 2011，15（1）：37－46.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）