李維杰　申敬　宋立勇　周新麗　王建信　劉寶林

摘要：采用海藻糖代替具有生物毒性的二甲基亞砜，利用自行搭建的超聲植冰裝置研究了超聲植冰以及不同濃度海藻糖對 L-02 肝細胞冷凍保存的影響。結果表明，添加 0.3 mol/L 海藻糖結合超聲植冰的細胞凍存組的肝細胞存活率較高 （（87.6±2.0）%），與傳統(tǒng)植冰組 （（84.3±1.0）%） 無顯著性差異，與非植冰組 （（76.9±3.1）%） 存在顯著性差異。

關鍵詞：超聲植冰；海藻糖；肝細胞；冷凍保存

中圖分類號：R 318.52??????????? 文獻標志碼：A

Cryopreserving L-02 hepatocytes with trehalose byultrasonic ice seeding

LI Weijie1， SHEN Jing1， SONG Liyong1， ZHOU Xinli1， WANG Jianxin2， LIU Baolin1，3

（1. School of Health Science and Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China;2. Origincell Technology Group， Shanghai 201203， China; 3. Co-innovation Center for Energy Therapy of Tumors，Shanghai 200093， China）

Abstract： Effects? of? ultrasonic? ice? seeding? and? different? concentrations? of? trehalose? on? thecryopreservation? of? L-02? hepatocytes? were? studied? by? replacing? bio? toxic? dimethyl? sulfoxide? withtrehalose? in? a? self-built? ultrasonic? ice? seeding? device.? The? results? show? that? the? survival? rate? ofhepatocytes （87.6±2.0）% is higher when cryopreserving L-02 hepatocytes with 0.3 mol/L trehalose byultrasonic? ice? seeding? ，? which? is? not? significantly? different? from? the? traditional? ice? seeding? group（84.3±1.0）%， and a significantly different from the non-ice seeding group （76.9±3.1）%.

Keywords： ultrasonic ice seeding; trehalose; hepatocyte; cryopreservation

隨著人工肝臟及肝細胞移植研究的開展，肝細胞保存的臨床需求不斷增加。傳統(tǒng)的肝細胞低溫保存多使用滲透性保護劑二甲基亞砜（Me2SO），通過程序降溫或者玻璃化的方法保存肝細胞。雖然 Me2SO 作為低溫保護劑可以得到較高的細胞存活率，但是，該物質(zhì)在實驗室和臨床應用中的副作用也很明顯。有報道顯示，使用 Me2SO 可能會出現(xiàn)一些副作用，如惡心、嘔吐、腹瀉、溶血、皮疹、腎衰竭、高血壓、心動過緩、肺水腫等[1-5]，以及可能會對胚胎及卵母細胞的發(fā)育造成影響[6]。因此，將冷凍保存的肝細胞用于患者體內(nèi)之前，必須清除保護劑。有臨床結果表明，沒有完全清除 Me2SO 的肝細胞植入患者體內(nèi)時會引發(fā)多種并發(fā)癥，如血管內(nèi)溶血、血清轉(zhuǎn)氨酶升高等[7]。因此，迫切需要一種降低 Me2SO 的方法來避免臨床使用凍存肝細胞時可能出現(xiàn)的并發(fā)癥。海藻糖是具有抗氧化功能和非滲透性冷凍保護功能的非還原性二糖，具有很好的生物相容性，可以降低 Me2SO 的使用。海藻糖的非熱力學平衡相變研究顯示，海藻糖能夠消除生理鹽水中共晶的形成，抑制冰晶生成[8]。2019年，有學者在紅細胞冷凍保存時加入少量的海藻糖使得細胞冷凍存活率從69%升高至90%[9]。但是，一般需經(jīng)過復雜的孵育過程將海藻糖輸送到細胞內(nèi)[10-12]，或者和其他保護劑如 Me2SO、甘油[13]等復配以提高細胞存活率。

植冰法是一種有效提升細胞冷凍存活率的方法，這是由于在實際降溫過程中，細胞溶液中會出現(xiàn)過冷現(xiàn)象，較大的過冷度會使細胞溶液因釋放潛熱而溫度上升，潛熱釋放完全后，可能會出現(xiàn)很高的降溫速率，引起細胞不可控的結晶，造成細胞大量死亡[14]。過冷度越小，低溫保存過程中產(chǎn)生的晶核數(shù)量越少，冰晶的生長速率越慢，形成的冰晶棱角較小，對細胞產(chǎn)生的傷害越小[15]。通過植冰的方法，人為地加入冰核，可以降低過冷度，避免胞內(nèi)冰的損傷，且在細胞復溫的過程中可以避免細胞重結晶，提高細胞存活率。目前主要有6種[16]植冰技術誘導成核，能夠誘導溶液在較高的零下溫度下成核，降低溶液的過冷度，改變冰晶的形態(tài)，避免胞內(nèi)冰的損傷。一般使用冰成核誘導劑[17-18]或者預冷的鑷子探針等進行人工置核，由于接觸式置核可能會對細胞造成污染，非接觸式置核在逐漸興起，如超聲波誘導冰晶成核。王葳等[19]發(fā)現(xiàn)超聲波能夠?qū)λ倪^冷結冰過程產(chǎn)生影響，在800 kHz 的超聲波下超聲波能夠大幅降低水的過冷度。李維杰等[20]用自行組裝的超聲植冰裝置研究了不同的超聲強度、不同的預凍溫度及不同濃度的 Me2SO 對肝細胞存活率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，超聲波植冰能夠顯著提高肝細胞的存活率（高達97%左右），與新鮮組無顯著性差異。目前利用超聲波誘導冰晶形成的研究尚不完善，主要用于食品、藥品、疫苗的冷凍濃縮和冷凍干燥等[21-23]，用于細胞凍存的研究相對較少。2005年， Chow 等[24]較早提出在超聲波存在時，即使蔗糖溶液的濃度不同，都始終在較高的溫度下成核，認為冰成核與超聲波的功率與空化氣泡有關。超聲誘導晶體的形成可以分為2個過程：當溶液初始無晶體存在時，超聲誘導溶液發(fā)生一次成核，在沒有固體表面和雜質(zhì)的情況下，發(fā)生均相成核[25]；有晶體存在引起的成核為二次成核，無論是初始存在的還是一次成核形成的晶體，在晶體固體界面的成核都稱為非均相成核。

本實驗以 L-02肝細胞為研究對象，使用非滲透性的海藻糖作為冷凍保護劑，結合自行研發(fā)的超聲波植冰裝置研究去除滲透性保護劑 Me2SO 的低溫保存方案。

1材料和方法

1.1材料和試劑

實驗所用的主要材料和試劑： L-02正常人類肝細胞系（中科院上海細胞生物研究所），98%胎牛血清（型號900108，GEMINI 公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（型號11875093， GIBCO 公司），0.25%胰蛋白酶（型號 TE2004Y，天津灝洋公司），無水海藻糖（型號 D110019，阿拉丁公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS 緩沖液）（型號 PB2004Y ，天津灝洋公司），乙二醇（型號 E103319，麥克林公司），AO/PI 雙染試劑盒（型號 BB20071，BestBio公司）， TC 處理的 T-25細胞培養(yǎng)瓶（型號707003，NEST 耐思公司），50 mL 離心管，15 mL 離心管，2 mL 凍存管（NEST 耐思公司）。

1.2儀器和設備

作者自行搭建的超聲波植冰裝置如圖1所示。超聲波植冰裝置主要由可放置多個凍存管的超聲容器、帶有2個熱電偶電極及數(shù)據(jù)采集模塊的溫度采集系統(tǒng)、帶有超聲波振子和超聲波發(fā)生器的超聲波誘導成核系統(tǒng)、加載有體積分數(shù)為38.5%的乙二醇作為控溫相變液的冷卻循環(huán)系統(tǒng)這4個部分組成。超聲波顯微系統(tǒng)主要由帶有超聲波振子和超聲波發(fā)生器的超聲波系統(tǒng)、帶有生物顯微鏡和高速攝像的光學記錄系統(tǒng)[26-27]、由燒杯和特制載玻片組成的特制載物臺、溫度檢測系統(tǒng)、冷卻循環(huán)系統(tǒng)所組成。

其余所使用的儀器和設備為：普通光學顯微鏡（型號 YS100，日本尼康公司），熒光顯微鏡（型號 TS100，日本尼康公司），低速臺式離心機（型號 TDL-80-2B，上海安亭公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（型號 BC-J80S ），超低溫冰箱（型號 DW-86L828，青島海爾特種電器有限公司），程序降溫盒（型號5100?0001，賽默飛世爾生物化學制品有限公司），低溫恒溫槽（型號 DC-0506，寧波天恒公司），智能多路溫度測試儀（型號 BB20071，常州安柏精密儀器有限公司）。

1.3超聲植冰裝置參數(shù)測定

為了確定超聲植冰實驗時實際消散在細胞溶液中的超聲波功率 Ps ，用量熱法進行測定，選取功率為30，60，75，90，105，120，135，150 W 的超聲波測定實際消散在不同濃度 Me2SO 細胞溶液的超聲波功率 Ps。量熱法是假設釋放出的超聲波能量均能被液態(tài)傳聲媒介吸收轉(zhuǎn)化成熱能。實驗發(fā)現(xiàn)不同體積分數(shù)（0%，3%，5%，10%）的 Me2SO 的比熱容無顯著性差異，為了便于計算，本實驗選取4種濃度 Me2SO 的比熱容的平均值作為細胞溶液的比熱容。細胞溶液比熱容為3.997 J/（g·℃）。

1.4肝細胞培養(yǎng)

在補充有體積分數(shù)為10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng) L-02肝細胞，添加體積分數(shù)為1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），將它們放在37℃、體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。實驗過程中觀察培養(yǎng)瓶中細胞的生長情況，當細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁約80%～90%時，輕輕吸取去除培養(yǎng)瓶中的上清液，用 PBS 緩沖液洗滌長滿肝細胞的培養(yǎng)瓶，然后用胰蛋白酶消化，將細胞從培養(yǎng)瓶中洗出，用移液槍對培養(yǎng)瓶底部反復吹打，確保全部細胞脫離底壁進入溶液中。將細胞從培養(yǎng)瓶中取出，在轉(zhuǎn)速為1000r/min 的離心機中離心4 min，然后重懸于 PBS 溶液中備用。

1.5肝細胞的冷凍保存

首先用 PBS 重懸細胞配制成細胞懸浮液備用。肝細胞的凍存采用自制的超聲植冰裝置及程序降溫盒。使用體積分數(shù)為38.5%的乙二醇作為裝置載冷劑，將不同質(zhì)量的無水海藻糖加入重懸備用的細胞懸浮液中，配制成濃度為0.1，0.3，0.5，0.7 mol/L 的海藻糖細胞溶液。將細胞懸浮液預脫水，4種不同濃度的海藻糖細胞溶液均設置3個平行重復實驗。另取凍存管添加等量不含肝細胞的保護劑溶液作為對照，將對照凍存管和4個細胞凍存管同時放置在超聲植冰細胞凍存裝置的樣本槽中。另設置新鮮組、添加體積分數(shù)為10%的 Me2SO 的慢速冷凍組[28]形成對照。選擇保存效果好的海藻糖組進一步研究植冰對肝細胞凍存的影響，同濃度海藻糖慢速冷凍作為對照組。實驗設計如表1所示，其中，*表示對照組，Δ表示實驗組。

超聲植冰裝置凍存細胞：植冰時將搭載好的超聲容器與低溫恒溫槽連接，將載冷劑注入超聲內(nèi)盒體和低溫恒溫槽中，開啟制冷循環(huán)系統(tǒng)，待第二熱電偶檢測到超聲容器內(nèi)控溫相變液溫度達到指定需要的溫度并保持恒溫狀態(tài)，通過第一熱電偶實時監(jiān)測凍存管的溫度，當檢測到溫度達到植冰溫度時，啟動超聲波。植冰結束后關閉超聲波，細胞凍存管在控溫相變液中平衡5～10 min 使冰晶生長完全。平衡結束后將凍存管放入程序降溫盒轉(zhuǎn)移至?80℃冰箱進行低溫保存過夜，第二天再將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存24～48h。

程序降溫盒慢速凍存細胞：將凍存管直接裝入程序降溫盒置于?80℃的冰箱中進行低溫保存過夜，降溫速率約為?1℃/min，第二天再將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存24～48h。

1.6肝細胞存活率檢測

實驗采取 AOPI 熒光染色法檢測細胞的存活率。為評估冷凍保存后細胞的存活率，將離心后的細胞用培養(yǎng)基稀釋成細胞懸液，用15μL 移液槍吸取15μL 細胞懸液到1.5 mL 離心管中，避光加入15μL AOPI 染液，輕輕混勻，4℃避光孵育10～20min，孵育完成后吸取15μL 的細胞染色液在載玻片的中央，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察，進行細胞計數(shù)，計數(shù)結果代入公式β=104，計算細胞的分子濃度β，個/mL ，a 為4個大方格總數(shù)， b 為稀釋倍數(shù)。計數(shù)規(guī)則按照計上不計下、計左不計右。熒光顯微鏡激發(fā)光源波長為488 nm，接受光波長為520 nm。正常的細胞被染成綠色或者黃綠色，死細胞被染成紅色。

1.7統(tǒng)計分析

獲得的熒光圖片采用 Image Pro Plus 6.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 22.0軟件處理。每個樣本重復3次，所有數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標準差（ SD ）的形式體現(xiàn)，以假設概率 p<0.05作為差異顯著評判標準，具有統(tǒng)計學意義。

2結果與討論

2.1超聲波植冰裝置參數(shù)的測定

使用自行組裝的超聲植冰裝置測定不同功率的超聲時，凍存管內(nèi)實驗樣品的溫度隨超聲時間的變化關系如圖 2 所示。在不同電功率下，凍存管內(nèi)純水的溫度隨著超聲時間的增加而增加，具有非常明顯的線性關系。采用 origin?8.0 軟件擬合線性方程，如表 2 所示，對應各電功率下擬合的溫度隨時間變化的線性方程，該線性方程可以近似地用來表示超聲植冰裝置內(nèi)純水溫度隨時間變化的關系曲線。根據(jù)公式 Ps= MCP 可分別求得不同超聲波電功率下實際消散在樣品中的功率 Ps。其中，M 為不同聲波電功率下保護液的質(zhì)量，Cp 為純水的比熱容，為擬合方程中超聲時間為 0?s 時，凍存管保護液溫度曲線的切線斜率。采用超聲波強度 Is 更好地表示超聲植冰裝置的參數(shù)對樣品的影響，超聲波強度 Is 可以用實際消散在單位面積上的超聲波功率表示。所得到的不同超聲波電功率下超聲作用時實際消散在凍存管中的功率 Ps 及超聲強度 Is 如表 3 所示。

2.2 不同濃度海藻糖對肝細胞存活率的影響

在保證植冰成功的前提下，預冷溫度應盡可能高。依據(jù)前期實驗可知，超聲波強度為0.1041 W/cm2 時效果最好[20]，即功率 60?W、預冷溫度為?4?℃ 對肝細胞進行冷凍保存。選用海藻糖作為冷凍保護劑，分別對濃度為 0.1，0.3，0.5，0.7?mol/L 海藻糖肝細胞懸液進行超聲植冰，陰性對照組是新鮮組，陽性對照組是添加體積分數(shù)為 10% 的 Me2SO 組。復蘇后肝細胞存活率及細胞熒光染色圖片如圖 3 和圖 4 所示。

2.3超聲植冰與傳統(tǒng)植冰對肝細胞凍存的影響

對前面得出的肝細胞凍存后復蘇存活率較高的 0.3?mol/L 海藻糖+超聲植冰組進一步實驗，對比第?1?期李維杰，等：超聲植冰協(xié)同海藻糖冷凍保存 L-02 肝細胞研究 53 超聲植冰和傳統(tǒng)植冰凍存肝細胞的差異。圖 4 為超聲植冰與傳統(tǒng)植冰對肝細胞存活率的影響，慢速冷凍作為對照組。圖 4 為 0.3?mol/L 海藻糖+慢速冷凍組，0.3?mol/L 海藻糖+超聲植冰組和 0.3?mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組的肝細胞熒光圖像。植冰預冷溫度為?4?℃，超聲波強度為 0.1041 W/cm2。如圖 4所示，0.3 mol/L 海藻糖+慢速冷凍組（圖4（a1））存在大量死細胞，0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（圖4（c1））存在較多的死細胞，而添加0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組（圖4（b1））存在較少的死細胞。結合圖5發(fā)現(xiàn)，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組與0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組細胞存活率無顯著性差異；傳統(tǒng)慢速冷凍方案，0.3 mol/L 海藻糖+慢速冷凍組細胞存活率為（76.9±3.1）%，與超聲植冰組和傳統(tǒng)植冰組存在顯著性差異；如圖6所示，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組細胞存活率為（87.6±2.0）%，略高于0.3mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（84.3±1.0）%。利用一定濃度的海藻糖作為保護劑結合超聲植冰，可以有效地保存肝細胞，其保存效果同使用10% Me2SO 效果類似，該結果與 Huang 等[29]的結果一致。由此可見，利用超聲波進行植冰配合非滲透性保護劑海藻糖代替?zhèn)鹘y(tǒng)滲透性保護劑Me2SO 是一種可行的方案。如果不使用超聲波，單純使用海藻糖并不能獲得較好的保存效果，側(cè)面印證了超聲波植冰作為一種新型的保存手段，在提高肝細胞保存效果時具有重要作用。

3結論

超聲波作用于過冷的溶液會誘導成核，本文結合自行組裝的超聲植冰裝置使用非滲透性保護劑海藻糖保存肝細胞。其中，超聲波頻率為40 kHz，超聲波強度為0.1041 W/cm2，預冷溫度為?4℃，研究了不同海藻糖濃度對肝細胞存活率的影響，結論如下：

a.非滲透性保護劑海藻糖的濃度對肝細胞的保存有較大的影響，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組肝細胞復蘇存活率為（87.6±2.0）%，與0.1 mol/L 海藻糖+超聲植冰組、0.5 mol/L 海藻糖+超聲植冰組和0.7mol/L 海藻糖+超聲植冰組存在顯著性差異，與傳統(tǒng)的10%Me2SO 保存肝細胞的方法無顯著性差異；

b.超聲植冰法可作為肝細胞保存的有效手段，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組與0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（（84.3±1.0）%）細胞存活率無顯著差異，添加0.3mol/L 海藻糖+慢速冷凍組細胞存活率僅為（76.9±3.1）%，添加0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰能提高肝細胞存活率；

c.超聲植冰與傳統(tǒng)植冰的冷凍效果一致，但操作更為簡單，且配合非滲透性海藻糖避免了臨床上的副作用及凍存后保護劑的洗脫，該冷凍方案有望推廣到其他細胞的冷凍中，為樣本庫的建設提供技術支持。

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（編輯：石瑛）