Let-7d、α-SMA在主動(dòng)脈夾層患者中的表達(dá)及其臨床意義

曹金龍，馬鴻蘭

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710077

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是一種在短期內(nèi)危及生命的血管疾病，其不僅會(huì)造成循環(huán)系統(tǒng)障礙，還會(huì)造成肝腎等重要臟器缺血從而引起嚴(yán)重并發(fā)癥。AD臨床表現(xiàn)具有多樣化，主要表現(xiàn)為突發(fā)胸痛、腹痛、高血壓，并可能表現(xiàn)為神經(jīng)缺損和暈厥等，從而導(dǎo)致AD 早期確診率較低，易于出現(xiàn)漏診或誤診現(xiàn)象[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)功能為收縮血管、維持血管完整性及血管彈性，是主動(dòng)脈膜中重要構(gòu)成成分。α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle protein，α-SMA)是VSMC 中普遍存在的一種骨架蛋白，也是VSMC 表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白。在AD 發(fā)生、發(fā)展中VSMC 轉(zhuǎn)化和凋亡的表型具有重要的作用，且該過程受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[2]。miRNA 是一種參與多種生物學(xué)過程的非編碼RNA，已證實(shí)多種miRNA在AD患者組織表達(dá)水平異常[3]。研 究 表 明，miR-124、miR-221/222 通過調(diào)控VSMC 的增殖、表型和遷移功能的改變，對(duì)主動(dòng)脈中膜的彈性變化產(chǎn)生影響，從而參與AD 的發(fā)生[4]。Let-7 是最先在線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，具有高度保守性，在心血管組織中特異性表達(dá)，從而參與心血管疾病的病理過程[5]。目前對(duì)Let-7 與α-SMA 在AD中的作用研究較少。本研究通過檢測(cè)AD 患者血清Let-7d、α-SMA 的表達(dá)水平，以探究Let-7d、α-SMA與AD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年5 月至2022 年5 月西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的108 例AD 患者(AD組)為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《2014 歐洲心臟病學(xué)會(huì)主動(dòng)脈疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)經(jīng)核磁共振或主動(dòng)脈CT 血管成像檢查，確診為AD；(3)患者及其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有先天性心血管疾?。?2)馬凡氏綜合征等遺傳性血管疾?。?3)肝、腎等功能異常；(4)患有系統(tǒng)性炎癥疾??；(5)創(chuàng)傷性或醫(yī)源性夾層。AD 組中男性67 例，女性41 例；年齡32~67歲，平均(51.75±9.63)歲；體質(zhì)量指數(shù)(23.04±1.92)kg/m2。選取同期西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院108 例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性63 例，女性45例；年齡30~66歲，平均(49.33±8.59)歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.62±2.15)kg/m2。兩組受檢者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 RNA 提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自日本TAKARA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；α-SMA酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。NanoDrop NA-2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher Scientific 公 司；ABI 7500 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR(qRT-PCR)儀購自美國ABI公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血液樣品收集與處理 采集AD 組患者及對(duì)照組空腹外周血10 mL，轉(zhuǎn)入無RNA 酶離心管中，3 000×g，4℃，離心15 min，之后將上清液置于新無RNA酶離心管中，于-80℃冰箱中保存。

1.3.2 血清Let-7d 水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法檢測(cè)血清Let-7d 水平。利用RNA 提取試劑盒，按照說明書操作標(biāo)準(zhǔn)抽提血清總RNA，利用NanoDrop NA-2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，并在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR上分析樣品，反應(yīng)體系共15 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，cDNA 樣品1μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，補(bǔ)充ddH2O至15 μL。反應(yīng)條件：95℃60 s；95℃30 s、60℃30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△CT法分析血清Let-7d的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.3 α-SMA 水平檢測(cè) 利用ELISA 法檢測(cè)血清α-SMA水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)系數(shù)法分析AD 患者血清Let-7d 與α-SMA 之間的相關(guān)性；繪制受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)價(jià)血清Let-7d、α-SMA 對(duì)AD 的診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA 水平比較 與對(duì)照組比較，AD 組患者血清Let-7d、α-SMA水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

表2 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

組別AD組對(duì)照組t值P值例數(shù)108 108 Let-7d/U6 0.64±0.17 1.03±0.21 15.001 0.001 α-SMA(ng/mL)49.83±8.77 70.61±21.44 9.323 0.001

2.2 血清Let-7d、α-SMA水平與AD患者臨床資料的關(guān)系 以AD患者血清中Let-7d表達(dá)水平平均數(shù)分為Let-7d 高表達(dá)組50 例，低表達(dá)組58 例；以AD 患者血清中α-SMA 水平平均數(shù)分為α-SMA 高表達(dá)組57 例，低表達(dá)組51 例。AD 患 者血清 中Let-7d、α-SMA 水平與性別、年齡、吸煙、高血壓、Standford 分型有關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 血清Let-7d、α-SMA水平與AD患者臨床資料的關(guān)系[例(%)]Table 3 Relationship between serum Let-7d,α-SMA levels and clinical data of AD patients[n(%)]

2.3 AD 患者血清Let-7d 與α-SMA 水平的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，AD 患者血清中的Let-7d 與α-SMA 呈正相關(guān)(r=0.663，P<0.05)，見圖1。

圖1 AD患者血清Let-7d和α-SMA水平的相關(guān)性Figure 1 Correlation between serum Let-7d and α-SMA levels in patients with AD

2.4 血清Let-7d、α-SMA對(duì)AD的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC 分析結(jié)果顯示，血清中Let-7d 水平診斷AD的曲線下面積(AUC)為0.860，敏感度為80.6%，特異性為82.4%，95%置信區(qū)間(CI)為0.807~0.912，截?cái)嘀禐?.83；血清中α-SMA 水平診斷AD 的AUC 為0.807，敏感度為83.3%，特異性為75.0%，95%CI 為0.745~0.868，截?cái)嘀禐?8.86 ng/mL，見表4和圖2。

圖2 ROC曲線分析圖Figure 2 ROC curve analysis chart

表4 血清Let-7d、α-SMA對(duì)AD的診斷價(jià)值Table 4 Analysis of the diagnostic value of serum Let-7d and α-SMA in AD

2.5 影響AD發(fā)生的相關(guān)因素 將是否發(fā)生AD作為因變量，以性別、年齡、吸煙、血清Let-7d、α-SMA水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果表明Let-7d、α-SMA 是AD發(fā)生的影響因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響AD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of AD

3 討論

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，心血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。AD是嚴(yán)重威脅人類生命健康的心血管疾病之一，研究表明AD 的發(fā)生與性別、年齡、吸煙、高血壓等因素有關(guān)[7]。王曉敏等[1]研究表明AD 患者中，男性發(fā)病人數(shù)多于女性，并且大多患者伴有高血壓病史。此外，伴有馬凡氏綜合征、埃萊爾-當(dāng)洛綜合征、主動(dòng)脈瓣二葉式畸形等遺傳病患者易患AD[8]。研究顯示，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等以及免疫因子包括白細(xì)胞介素(ILs)、骨橋蛋白、γ干擾素等免疫炎癥機(jī)制與AD 的發(fā)生有關(guān)[9]。因此，AD 的發(fā)生受到個(gè)人習(xí)慣、遺傳、免疫炎癥等多種因素的影響，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。

血管重構(gòu)被認(rèn)為是AD發(fā)生的主要因素之一。血管重構(gòu)指血管舒縮功能紊亂，細(xì)胞外機(jī)制的合成與降解失衡以及管壁細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和凋亡[10]。VSMC 位于血管中膜，在正常、成熟的VSMC中主要是以收縮型為主，病理?xiàng)l件下VSMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型[11]，血管壁彈性降低，從而可能發(fā)生AD。α-SMA 屬于肌動(dòng)蛋白亞類，是細(xì)胞骨架的主要成分，主要在分化型細(xì)胞中表達(dá)，是VSMC 早期分化的特異性標(biāo)志物。Li 等[12]研究發(fā)現(xiàn)AD 患者組織中α-SMA 表達(dá)降低，VSMC 為去分化型，表明去分化型VSMC 對(duì)AD 發(fā)病機(jī)制中有一定的影響。本研究對(duì)AD患者血清α-SMA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明α-SMA在AD 患者血清中水平降低，與以上研究一致，表明α-SMA 與AD 的病變密切相關(guān)。ROC 曲線分析結(jié)果表明α-SMA對(duì)AD具有診斷價(jià)值，敏感度與特異性均較好，提示α-SMA可以作為診斷AD的潛在標(biāo)志物。

Let-7 家族是一種高度保守性的miRNA，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能夠參與多個(gè)生物學(xué)過程。其中，Let-7 是一種腫瘤抑制基因，在腫瘤細(xì)胞增殖與分化中有重要作用[13-15]。近年來，隨著對(duì)Let-7 研究的深入，發(fā)現(xiàn)Let-7 在VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)，與心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[16]。Wong等[17]研究表明Let-7d-3p表達(dá)水平的增加對(duì)缺氧肌細(xì)胞H9C2 和原代乳鼠心室肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，在心肌缺血和心力衰竭疾病中是潛在治療靶點(diǎn)。另有學(xué)者通過對(duì)AD患者血清5種miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平均下降，并認(rèn)為血清miRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)有作為AD早期快速診斷生物標(biāo)志物的應(yīng)用潛能[18]。本研究通過對(duì)AD 患者血清Let-7d 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Let-7d 在AD 患者血清中表達(dá)水平降低，提示Let-7d 可能是檢測(cè)AD 的潛在標(biāo)志物。Sung等[19]研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Let-7表達(dá)下調(diào)，IL-6 表達(dá)上調(diào)，二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。免疫因子參與AD 的炎癥反應(yīng)，IL-6 的減少會(huì)延緩AD的發(fā)生，猜測(cè)Let-7d 可能通過調(diào)節(jié)炎癥水平變化，從而對(duì)AD 產(chǎn)生抑制作用[20]。ROC 曲線分析表明Let-7d 對(duì)AD 具有診斷價(jià)值，敏感度與特異性均較好。本研究中AD患者血清中Let-7d、α-SMA 水平與性別、年齡、吸煙、高血壓、Standford分型有關(guān)，提示血清Let-7d、α-SMA 水平與AD 患者個(gè)人生活習(xí)慣、Standford分型有關(guān)。對(duì)Let-7d與α-SMA進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Let-7d 與α-SMA 存在明顯正相關(guān)，提示Let-7d、α-SMA 可能參與AD 發(fā)病過程。本研究通過Logistic 分析表明，α-SMA、Let-7d 是AD 的影響因素，表明二者在AD 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，雖然有關(guān)α-SMA、Let-7d 與AD 病變機(jī)制尚不清楚，但通過本研究可為臨床對(duì)AD 進(jìn)行診斷、治療、新藥物研發(fā)提供思路。

綜上所述，AD患者血清Let-7d、α-SMA表達(dá)水平降低，Let-7d、α-SMA 是AD 發(fā)生的影響因素，可作為評(píng)估AD 發(fā)生的血清學(xué)指標(biāo)。本研究尚存在不足之處，如Let-7d、α-SMA 在AD 疾病中發(fā)揮作用的確切機(jī)制需待進(jìn)一步研究。