一種新的粒毛盤菌多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

何雅玲, 張?chǎng)雾? 葉 明

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

肝臟是人體的重要器官,在人體營養(yǎng)、新陳代謝、解毒和免疫中起著至關(guān)重要的作用,但很容易受到有毒物質(zhì)的傷害,包括酒精、藥物濫用、病毒感染和意外中毒等[1]。事實(shí)證明,嚴(yán)重的急性肝損傷可能會(huì)導(dǎo)致黃疸、嚴(yán)重的凝血功能障礙和其他致命的臨床問題[2]。 目前為止,仍然缺乏可靠的藥物來治愈這種傷害,可見肝病已成為影響人類健康的最常見疾病之一[3]。

順鉑(CP)是一種非特異性的細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物,雖然可以殺死腫瘤細(xì)胞,但對(duì)正常細(xì)胞也可產(chǎn)生毒性作用[4]。有研究表明,順鉑對(duì)肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和大腦具有毒性作用[5]。其中腎毒性已進(jìn)入動(dòng)物和臨床研究階段,但肝毒性尚未引起足夠重視,因此,降低順鉑引起的肝臟毒性仍是亟待解決的問題。

粒毛盤菌是一類分布廣泛的腐生性真菌,是世界菌物資源的重要組成部分[6]。近幾年對(duì)粒毛盤菌的研究發(fā)現(xiàn)該類真菌可以產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。粒毛盤菌YM156胞內(nèi)黑色素在鎘暴露小鼠中通過抗氧化和抗炎作用對(duì)肝損傷具有治療作用[7]。粒毛盤菌多酚可以作為抗凝劑,并且可以用作潛在的天然藥物預(yù)防血栓形成[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),粒毛盤菌多糖具有較好的抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]、降血糖[12]等功能,其中,粒毛盤菌YM406胞外多糖(LEP-2a)及其衍生物對(duì)CCl4所致急性肝損傷具有改善作用[6]。但是關(guān)于粒毛盤菌多糖對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用尚不清楚。

本文從粒毛盤菌YM38發(fā)酵液中提取、純化、分離出多糖LEP-1a,建立順鉑誘導(dǎo)的急性肝損傷模型,研究LEP-1a對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的肝保護(hù)作用,為LEP-1a作為一種治療順鉑引起急性肝損傷的新藥提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

粒毛盤菌YM38子實(shí)體收集于安徽黃山,并由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究中心保存;小鼠肝臟測(cè)定的普通試劑盒購于南京建城生物工程研究院;小鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定的ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;水飛薊素購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 粒毛盤菌YM38多糖LEP-1a的提取純化

根據(jù)文獻(xiàn)[11]提取方法,粒毛盤菌YM38發(fā)酵液體發(fā)酵10 d結(jié)束后,對(duì)其菌液進(jìn)行抽濾、旋蒸,用95%乙醇進(jìn)行醇沉,離心取沉淀,沉淀用蒸餾水復(fù)溶,通過Sevage法除蛋白,30% H2O2脫色,將脫色完的多糖溶液在流動(dòng)的自來水中透析48 h, 再用蒸餾水透析24 h后冷凍干燥獲得粗多糖。

粗多糖通過DEAE-cellulose 52色譜柱分別用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫,收集由0.1 mol/L NaCl洗脫的主要組分,并進(jìn)一步用雙蒸水在Sephadex G-100色譜柱中進(jìn)行洗脫,收集分級(jí)分離后的主要組分,透析、凍干后得到新的粒毛盤菌多糖LEP-1a。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

在食品安全預(yù)防工作和監(jiān)管工作中，無論是美國還是歐盟，都能通過專業(yè)機(jī)構(gòu)收集和分析一些有關(guān)的食品風(fēng)險(xiǎn)、安全信息等，也能為法律法規(guī)的實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)。為了增強(qiáng)消費(fèi)者的自身保護(hù)能力，掌握食品安全的實(shí)際信息，可以促使食品安全信息系統(tǒng)的形成，加強(qiáng)對(duì)不合格產(chǎn)品的分析，保證食品市場(chǎng)檢測(cè)信息的滲透，在科學(xué)探究的情況下，也可以更好地服務(wù)于社會(huì)。

8周齡健康的ICR雄性小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)(25～28 g,40只)(證書編號(hào):安徽醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的第一號(hào)許可證)。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下嚴(yán)格喂養(yǎng),并保持在可控制的溫度(24～26 ℃)、濕度(55±5)%和12 h的明/暗循環(huán)中,可以自由飲水和進(jìn)食。

所有小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為5組(n=6),包括正常(N)組、模型(M)組(順鉑45 mg/kg)、陽性藥(P)組(水飛薊素100 mg/kg)、LEP-1a低劑量(LL)組(100 mg/kg)、LEP-1a高劑量(LH)組(200 mg/kg)。 正常組和模型組小鼠灌胃蒸餾水0.2 mL,其余組小鼠等量灌胃給藥,連續(xù)7 d,在第7天灌胃3 h后,除正常組腹腔注射0.1 mL生理鹽水,其余組單劑量腹腔注射0.1 mL順鉑,禁食不禁水,16 h后脫頸處死小鼠,并從眼球中采血,血漿在4 ℃下以4 000 r/min的速度離心15 min產(chǎn)生血清[13]。將一部分肝組織固定在4%多聚甲醛中以進(jìn)行組織學(xué)分析,其余的肝臟組織則存放在-80 ℃的冰箱中,以進(jìn)行進(jìn)一步的生化分析。

1.3.2 體質(zhì)量和肝指數(shù)分析

小鼠體質(zhì)量每周稱量1次。在最后一次治療16 h后稱質(zhì)量,處死小鼠,解剖取出肝臟,計(jì)算肝臟指數(shù),具體計(jì)算公式如下:

1.3.3 小鼠肝臟生化指標(biāo)分析

將肝組織在生理鹽水(1∶9)中勻漿,并將勻漿液于3 500 r/min在4 ℃下離心10 min。 收集上清液,并嚴(yán)格遵守制造商(南京建城生物工程研究所)市售的試劑盒測(cè)試規(guī)則測(cè)定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)水平。

1.3.4 小鼠血清生化指標(biāo)分析

1.3.5 小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)染色

將適量肝組織置于10%福爾馬林緩沖液中固定24 h后對(duì)其進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片,并用蘇木精-伊紅(HE)染色后用顯微鏡觀察。從肝右葉收集肝組織樣品,用10%福爾馬林緩沖液固定,包埋在肝中,分成5 μm切片,并用蘇木精-伊紅(HE)染色[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,采用one-way ANOVA分析各組數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異。當(dāng)P<0.05和P<0.01時(shí),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分別被認(rèn)為差異性顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEP-1a對(duì)小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

LEP-1a對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝指數(shù)的影響見表1所列。由表1可知:各組小鼠初始體質(zhì)量無明顯差異,順鉑給藥導(dǎo)致模型組小鼠體質(zhì)量下降顯著(P<0.01),肝臟質(zhì)量和肝指數(shù)在所有組中表達(dá)最高,說明順鉑造模成功;與模型組相比,粒毛盤菌多糖高、低劑量給藥組(LL和LH) 肝指數(shù)均不同程度降低。結(jié)果表明LEP-1a能夠抑制急性肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)升高,使肝功能得到一定改善,具有一定治療效果。

表1 LEP-1a對(duì)小鼠體質(zhì)量和肝臟指標(biāo)的影響

2.2 LEP-1a對(duì)小鼠肝臟TG和TC水平的影響

LEP-1a對(duì)小鼠肝臟TG和TC水平的影響如圖1所示。

圖1 LEP-1a對(duì)小鼠體內(nèi)TG和TC水平的影響

從圖1可以看出,與正常(N)組相比,陽性治療(P)組中TG、TC濃度無顯著差異(P>0.05),模型組小鼠TG、TC濃度極顯著升高(P<0.01),說明小鼠急性肝損傷模型已建立;與模型(M)組相比,粒毛盤菌多糖預(yù)處理組(LL和LH)小鼠肝臟中TG、TC濃度均明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 LEP-1a對(duì)小鼠肝功能的影響

血清ALT、AST和AKP活性與肝損傷程度成正比[15]。LEP-1a對(duì)小鼠肝功能的影響如圖2所示。從圖2可以看出,與正常組相比,模型(M)組的血清中ALT、AST和AKP活性顯著升高(P<0.01)。

圖2 LEP-1a對(duì)小鼠肝功能的影響

陽性治療組與正常組相比幾乎無顯著差異(P>0.05),粒毛盤菌多糖預(yù)處理組(LL和LH) 以劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)了模型(M)組血清ALT、AST和AKP活性的升高(P<0.05)。這種變化與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果相似,順鉑處理組中AST和ALT活性明顯高于其他組。本研究中LEP-1a預(yù)處理可以減輕順鉑誘導(dǎo)的急性肝損傷,說明LEP-1a對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。

2.4 LEP-1a對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

在藥物或化學(xué)誘導(dǎo)的肝毒性中,氧化應(yīng)激常被認(rèn)為是肝細(xì)胞損傷的原因。脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA是氧化損傷的標(biāo)志物,同時(shí),氧化應(yīng)激也導(dǎo)致相關(guān)抗氧化酶活性降低,如SOD和CAT活性降低[17]。LEP-1a對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響見表2所列。由表2可知,與正常(N)組相比,順鉑誘導(dǎo)顯著增加了MDA的量(P<0.01)。然而,所有LEP-1a預(yù)處理組均以劑量依賴性方式降低MDA的量(P<0.01)。此外,模型(M)組的SOD和CAT活性最低,經(jīng)過LEP-1a預(yù)處理,SOD 和CAT活性顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明LEP-1a能顯著降低MDA的量,增強(qiáng)SOD和CAT活性,對(duì)順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有潛在的治療作用。

表2 LEP-1a對(duì)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激酶的影響

2.5 LEP-1a對(duì)小鼠血清炎癥因子的影響

許多細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β)在肝損傷中起著至關(guān)重要的作用[18]。為了研究LEP-1a預(yù)處理的潛在抗炎作用,測(cè)定TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。LEP-1a對(duì)小鼠血清TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度的影響如圖3所示。從圖3可以看出:與正常(N)組相比,模型(M)組的血清TNF-α和IL-1β的質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.01);相反,與模型(M)組相比,多糖組預(yù)處理組(LL和LH)的TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明,LEP-1a對(duì)炎性因子TNF-α和IL-1β均有明顯的抑制作用,能夠調(diào)控順鉑引發(fā)的炎癥反應(yīng)、減輕炎癥、抑制肝損傷,從而進(jìn)一步達(dá)到保肝活性。

圖3 LEP-1a對(duì)TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度的影響

2.6 LEP-1a對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

為了確定順鉑注射后對(duì)炎癥性肝損傷的影響,通過HE染色對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行了組織學(xué)分析。LEP-1a對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響如圖4所示。從圖4可以看出:正常(N)組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰可見,且無明顯病理現(xiàn)象;模型(M)組小鼠肝細(xì)胞增大,可見細(xì)胞破裂、壞死,存在嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,表明藥物性肝損傷造模成功;與模型(M)組小鼠相比,多糖預(yù)處理組(LL和LH),小鼠肝臟病變明顯緩解,炎性細(xì)胞浸潤減輕,細(xì)胞輪廓清晰可見,肝損傷程度減輕。結(jié)果表明LEP-1a對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的緩解作用。

圖4 LEP-1a對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)的影響

圖4中,黑色箭頭表示肝細(xì)胞體積增大,炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞核收縮。

3 討 論

本文從粒毛盤菌YM38發(fā)酵液中提取了天然多糖LEP-1a,并通過腹腔注射順鉑建立小鼠急性肝損傷模型,首次評(píng)估LEP-1a的保肝作用。眾所周知,肝臟是脂肪形成和膽固醇代謝的中心器官[19]。因此肝臟中TG和TC的水平可以用作肝損傷的生化指標(biāo)。白首烏花多糖能夠明顯降低小鼠TG和TC水平,對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質(zhì)水平具有潛在抑制作用[20]。本研究中給予小鼠順鉑后,肝臟中TG和TC水平升高,LEP-1a預(yù)處理能夠顯著降低TG 和TC水平。已知AST、ALT和ALP是肝功能的重要標(biāo)志物,而它們活性增加表明肝細(xì)胞壞死和細(xì)胞膜通透性障礙[21]。當(dāng)少量肝細(xì)胞壞死時(shí),肝細(xì)胞中的ALT、AST和AKP會(huì)釋放到血清中,導(dǎo)致血清中相關(guān)含量急劇升高[22]。文獻(xiàn)[23]研究發(fā)現(xiàn)靈芝(Ganodermaapplanatum)多糖預(yù)處理可顯著降低血清AST、ALT、ALP水平從而減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。本研究表明順鉑給予引起模型組血清ALT、AST和AKP水平升高,而LEP-1a預(yù)處理組中ALT、AST和AKP水平均降低,說明LEP-1a 能夠緩解順鉑所致的肝臟損傷。

順鉑可以在肝臟組織中大量積累,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),氧化應(yīng)激造成了抗氧化防御的不平衡,這也是造成急性肝損傷的部分原因[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物,可以將超氧化物變成過氧化物[25]。SOD經(jīng)常被用作細(xì)胞氧化狀態(tài)的標(biāo)志物,是抵抗氧化應(yīng)激的重要因素[26]。SOD和 CAT作為生物體內(nèi)最主要的酶促防御體系,能有效清除活力氧自由基[27]。研究表明,LEP-1a可通過增加SOD和CAT的活性以及降低肝臟中MDA的量來抑制炎癥細(xì)胞向肝臟的浸潤,并增強(qiáng)抗氧化活性。結(jié)果與靈芝多糖[28]、水溶性黑木耳根多糖[29]的研究結(jié)果一致,說明真菌多糖能有效預(yù)防小鼠藥物性肝臟損傷。

順鉑誘導(dǎo)可增加肝組織中炎癥介質(zhì)和TNF-α[30]。TNF-α是一種內(nèi)源性致熱原,可以導(dǎo)致發(fā)熱,引起細(xì)胞凋亡[31]。IL-1β作為重要的促炎因子,響應(yīng)組織損傷而快速表達(dá)[21]。在本研究中,與模型組相比,LEP-1a預(yù)處理組能夠顯著抑制小鼠炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá),降低體外的炎癥反應(yīng)以及肝壞死的嚴(yán)重程度,與文獻(xiàn)[32]結(jié)果一致。同時(shí),肝臟組織病理學(xué)染色表明給予LEP-1a預(yù)處理后,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少,無大量壞死肝細(xì)胞,且高劑量LEP-1a組比低劑量組治療效果明顯。因此本文研究表明,LEP-1a能夠通過提高小鼠肝臟抗氧化能力和抑制肝臟炎癥因子的產(chǎn)生抑制肝損傷,達(dá)到保護(hù)肝臟作用。