夏雄飛,張凱強(qiáng),任文來,韓長(zhǎng)志,3

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,昆明 650224;2.文安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北 文安 065800;3.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)

【研究意義】近年來,小麥病害的發(fā)生給中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重制約著中國(guó)小麥產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展,威脅著國(guó)家糧食安全[1]。其中,白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)、葉斑病菌(Parastagonosporanodorum)分別是引起小麥白粉病、葉枯病、葉斑病的病原真菌,其營(yíng)養(yǎng)型分別為活體[2]、半活體[3]及死體營(yíng)養(yǎng)型[4]。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCR)蛋白廣泛存在于植物病原真菌中,在感知和傳遞外界信號(hào)方面發(fā)揮著重要功能。不同營(yíng)養(yǎng)型病原真菌GPCR蛋白的數(shù)量及理化性質(zhì)、遺傳關(guān)系等方面是否存在著同質(zhì)性或差異性,對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)不同作用靶標(biāo)的新型農(nóng)藥具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】GPCR蛋白廣泛存在于真核生物中,其主要功能在于接收信號(hào)源物質(zhì),并將信號(hào)源物質(zhì)在受體中進(jìn)一步“翻譯”后傳遞至下游信號(hào)鏈[5],具有典型的7重跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域[6],在植物病原真菌等生物的細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理生化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7],進(jìn)而影響真菌的生長(zhǎng)、分生孢子形成以及對(duì)植物的免疫應(yīng)答等。前人多以單個(gè)小麥病原菌為對(duì)象開展次生代謝產(chǎn)物、效應(yīng)子、分泌蛋白等致病因子以及遺傳關(guān)系的研究,如小麥葉斑病菌產(chǎn)生的聚酮化合物、非核糖體肽等次級(jí)代謝產(chǎn)物以及效應(yīng)子在發(fā)病過程中的作用分析[8-9],小麥白粉病菌候選互作蛋白篩選[10]、遺傳多樣性分析[11],以及小麥葉枯病菌與小麥互作過程中的分泌蛋白情況分析[12]等。喻紅利等[13]前期通過TOPCONS、TMHMM、Philius等方法對(duì)禾谷炭疽菌的候選GPCR蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),明確該菌220個(gè)候選GPCR蛋白的理化性質(zhì)及遺傳關(guān)系[14],該研究方法與前人利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進(jìn)行異源GPCR蛋白檢測(cè)分析相比[15],較好地實(shí)現(xiàn)了全部候選GPCR蛋白的高效預(yù)測(cè)。此外,祝友朋等[13]還對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)型植物病原真菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行了差異性研究。然而,關(guān)于小麥不同營(yíng)養(yǎng)型病原真菌候選GPCR蛋白的生物信息比對(duì)分析尚未見報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】以小麥不同營(yíng)養(yǎng)型病原真菌的蛋白序列為研究對(duì)象,利用3種不同的蛋白跨膜預(yù)測(cè)方法(TOPCONS、TMHMM、Philius)分析其含有的跨膜情況,通過篩選具有7重跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白,并結(jié)合SMART保守結(jié)構(gòu)域分析其結(jié)構(gòu)特征。同時(shí),對(duì)所獲得的候選GPCR蛋白開展氨基酸序列長(zhǎng)度、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸殘基情況、遺傳關(guān)系等分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于生物信息分析的方法,明確小麥不同營(yíng)養(yǎng)型病原真菌的候選GPCR蛋白理化性質(zhì)差異性以及遺傳關(guān)系同質(zhì)性特征,對(duì)于不同營(yíng)養(yǎng)型病原真菌的候選GPCR蛋白受體-配體相互作用解析以及開發(fā)不同作用靶標(biāo)的新型農(nóng)藥具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

小麥白粉病菌(登錄號(hào):GCA_900519115.1)、葉枯病菌(登錄號(hào):GCF_000219625.1)、葉斑病菌(登錄號(hào):GCF_000146915.1)的蛋白序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 找尋候選GPCR蛋白 基于多種在線預(yù)測(cè)軟件,首先,通過 TOPCONS (http://topcons.cbr.su.se/pred/)、TMHMM 2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.s/TMHMM-2.0/)以及Philius (http://www.yeastrc.org/philius/pages/philius/runPhilius.jsp)[13]分析小麥病原真菌全部蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)的情況;其次,通過 SignalP 5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)[17]分析信號(hào)肽;再次,通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)[18]預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域,剔除包含已證實(shí)功能的保守結(jié)構(gòu)蛋白,保留不含任何已證實(shí)功能的蛋白(圖1),最終獲取3種病原真菌的候選GPCR蛋白。

A:典型候選GPCR蛋白;B:其他蛋白。

1.2.2 氨基酸理化性質(zhì)情況分析 基于2種在線預(yù)測(cè)軟件,首先通過 Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)分析;其后,通過 Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸情況[14]。

1.2.3 候選GPCR的遺傳關(guān)系分析 通過軟件MEGA 11.0進(jìn)行多重比對(duì)分析并建立遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用軟件Microsoft office 2019,圖表制作采用軟件Origin 2018、Adobe Photoshop 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選GPCR蛋白預(yù)測(cè)

基于TOPCONS、TMHMM、Philius 3種程序預(yù)測(cè)不同小麥病原真菌全部蛋白的跨膜情況,從表1可知,符合7重跨膜結(jié)構(gòu)特性且不包含信號(hào)肽的蛋白數(shù)量的小麥白粉病菌為40～54個(gè),平均為46個(gè),占比為0.49%～0.65%;小麥葉枯病菌為82～97個(gè),平均為90個(gè),占比為0.75%～0.89%;小麥葉斑病菌為107～146個(gè),平均為124個(gè),占比為0.67%～0.91%。進(jìn)一步通過SignalP 5.0對(duì)信號(hào)肽情況進(jìn)行分析,明確小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌具有8重跨膜結(jié)構(gòu)且包含信號(hào)肽的蛋白數(shù)量分別為2、3、10個(gè)。同時(shí),利用SMART預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域,明確小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌具有候選GPCR蛋白數(shù)量分別為11、32、69個(gè)。小麥葉斑病菌的候選GPCR蛋白數(shù)量明顯高于其余2種病菌。

表1 3種小麥病原真菌的候選GPCR蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 氨基酸序列長(zhǎng)度分析

通過對(duì)小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白氨基酸長(zhǎng)度進(jìn)行分析(圖2)。候選GPCR蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度分別為215～652、244～1028、236～563 aa,平均序列長(zhǎng)度分別為407、399、383 aa。因此,小麥3種病原菌候選GPCR蛋白的氨基酸序列平均長(zhǎng)度相近。

圖2 3種小麥病原真菌候選GPCR的序列長(zhǎng)度比對(duì)

2.3 理論等電點(diǎn)與不穩(wěn)定系數(shù)分析

基于Protparam在線分析候選GPCR蛋白理論等電點(diǎn)與不穩(wěn)定系數(shù)。從圖3可見,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的理論等電點(diǎn)分別為5.43～9.84、5.75～10.24、5.67～10.42,平均值分別為8.77、8.79、8.79。3種病菌各含有酸性蛋白質(zhì)(理論等電點(diǎn)小于6.01)1、1、2個(gè),占比分別為9.09%、3.13%、2.90%;堿性蛋白質(zhì)(理論等電點(diǎn)大于8.00)9、27、57個(gè),占比分別為81.89%、84.38%、82.61%。

圖3 3種小麥病原真菌候選GPCR氨基酸殘基的理論等電點(diǎn)與不穩(wěn)定系數(shù)的關(guān)系

同時(shí),小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)分別為18.68～56.69、21.71～68.43、25.47～56.80,平均值分別為41.07、40.05、39.59。3種病菌各含有不穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)高于40.01)7、13、31個(gè),占比分別為36.36%、59.38%、55.07%,穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)低于40.01)4、19、38個(gè),占比分別為63.64%、40.62%、44.93%。結(jié)果表明,小麥白粉病菌具有較多的酸性且穩(wěn)定蛋白,葉枯病菌具有較多的堿性且不穩(wěn)定蛋白。

2.4 最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸殘基分布

基于Protscale在線分析候選GPCR蛋白最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸殘基。從圖4可見,候選GPCR蛋白的最強(qiáng)親水性(親水性值小于0)氨基酸殘基小麥白粉病菌有9種,含量最高的為天冬氨酸和精氨酸,占比18.18%,其中異亮氨酸為其獨(dú)有;小麥葉枯病菌有12種,含量最高的為谷氨酸,占比21.62%;小麥葉斑病菌有16種,含量最高的為精氨酸,占比22.67%,且獨(dú)有纈氨酸、色氨酸、絡(luò)氨酸、苯丙氨酸。

A、B、C分別表示小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的氨基酸親水性殘基;a、b、c分別表示小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的氨基酸疏水性殘基。

同時(shí),候選GPCR蛋白的最強(qiáng)疏水性(親水性值大于0)氨基酸殘基小麥白粉病菌有5種,含量最高的為纈氨酸,占比38.46%;小麥葉枯病菌有10種,含量最高的為亮氨酸,占比28.57%;小麥葉斑病菌有12種,含量最高的為纈氨酸,占比24.66%,且獨(dú)有甲硫氨酸和甘氨酸。

2.5 親(疏)水性最值分析

基于Protscale在線分析候選GPCR蛋白的氨基酸親(疏)水性最值。從圖5可知,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白氨基酸殘基親水性最值(小于0)分別為-0.722～-3.778、-1.478～-3.756、-1.544～-3.633,平均值分別為-2.680、-2.750、-2.730。

同時(shí),小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白氨基酸殘基疏水性最值(大于0)分別為2.889～4.500、2.456～3.722、2.144～3.978,平均值分別為3.330、3.090、3.200。

2.6 遺傳關(guān)系分析

通過對(duì)小麥3種營(yíng)養(yǎng)型病原真菌的112個(gè)候選GPCR蛋白序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析。從圖6可知,3種病原真菌的候選GPCR蛋白明顯分為三大類,分別采用A、B、C進(jìn)行區(qū)分。其中,在A類中共涉及71個(gè)候選GPCR蛋白,為最大的一類,包含小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白數(shù)量分別為6、19、46個(gè);B類中則有36個(gè)候選GPCR蛋白,包含小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白數(shù)量分別為3、12、21個(gè);C類中則僅有數(shù)量較少的候選GPCR蛋白。就其功能而言,僅發(fā)現(xiàn)5個(gè)候選GPCR為假定蛋白(Hypothetical protein)。

A、B、C分別表示3個(gè)遺傳分支。

3 討 論

GPCR蛋白作為生物細(xì)胞中重要的信號(hào)傳遞受體,對(duì)維持生命的正常運(yùn)轉(zhuǎn)發(fā)揮著重要作用,當(dāng)前在醫(yī)療健康方面所應(yīng)用的藥劑中有超過50%以該蛋白為作用靶標(biāo)[20],未來以植物病原真菌的GPCR蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行化學(xué)防控具有可行性。前人研究發(fā)現(xiàn),致病疫霉(Phytophthorainfestans)的GPCR蛋白相關(guān)亞基Gγ參與孢子囊的發(fā)育和游動(dòng),其氨基酸序列與非卵菌Gγ亞基的整體相似性較低[21],說明不同物種編碼GPCR蛋白的氨基酸序列存在差異性,該發(fā)現(xiàn)與本研究中3種小麥病原真菌的候選GPCR蛋白及其理化性質(zhì)存在一定差異性的分析結(jié)果相似。

此外,玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)作為活體營(yíng)養(yǎng)型真菌,在堿性環(huán)境條件下侵染宿主時(shí),其GPCR蛋白相關(guān)代謝途徑表達(dá)更加突出[22],而本研究中的小麥白粉病菌候選GPCR堿性蛋白占比較低,是否與pH適應(yīng)過程有關(guān),有待于今后進(jìn)一步研究。稻瘟菌(Magnaportheoryzae)作為半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌,其GPCR相關(guān)蛋白PLG1可以促使病菌在疏水表面侵染宿主相比親水表面產(chǎn)生更多附著物[23],同樣,小麥葉枯病菌、白粉病菌、葉斑病菌的GPCR蛋白殘基親(疏)水性與病菌侵染識(shí)別之間是否存在關(guān)聯(lián)性,有待于進(jìn)一步明確?；移咸焰?Botrytiscinerea)作為死體型真菌,其GPCR相關(guān)蛋白bmp1與上述稻瘟菌對(duì)于在親(疏)水表面的侵染表現(xiàn)相反[24],推測(cè)其GPCR蛋白氨基酸殘基種類的多樣性可能與其侵染識(shí)別相關(guān)。

4 結(jié) 論

小麥葉斑病菌的候選GPCR蛋白數(shù)量明顯高于其余2種病菌,白粉病菌則具有較多的酸性且穩(wěn)定蛋白,葉枯病菌具有較多的堿性且不穩(wěn)定蛋白。3種病菌的最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸殘基的數(shù)量與種類均有較大差異。上述蛋白之間的親緣關(guān)系較近。本研究對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)型候選GPCR蛋白受體-配體相互作用解析以及開發(fā)不同作用靶標(biāo)的新型農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。