江玥曈，高蔥蔥，張玉佳，歐煬育，周婷婷 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物分析學(xué)教研室, 上海, 200433；2.上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200433；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué), 安徽 合肥, 23002）

黑豆是由豆科植物大豆［Glycine max (Linn.)Merr.］的成熟種子，淡豆豉是由黑豆經(jīng)發(fā)酵后加工而成[1]。淡豆豉性味苦且辛涼，具有解表、除煩和清解郁熱的功效，可用于治療頭痛感冒、胸悶煩躁、失眠等癥狀。淡豆豉中含有異黃酮、多糖、氨基酸、蛋白、皂苷、纖溶酶等成分，其中異黃酮類被廣泛認(rèn)為是主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉還具有抗細(xì)菌、降低血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群及抗癌等藥理活性[2-6]。

本課題組按照前期優(yōu)化的發(fā)酵工藝自制淡豆豉，并建立通過(guò)高效液相色譜對(duì)淡豆豉中6 種異黃酮進(jìn)行含量測(cè)定的方法[7-8]。依據(jù)建立的分析方法對(duì)發(fā)酵前的黑豆、發(fā)酵后的半成品和成品淡豆豉中6 種異黃酮的含量進(jìn)行檢測(cè)，比較黑豆發(fā)酵前后和不同程度發(fā)酵條件下淡豆豉中6 種異黃酮的含量變化，為進(jìn)一步完善淡豆豉的發(fā)酵工藝和深入研究淡豆豉中異黃酮類化合物的藥理活性奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SHIMAZULC-20ADXR 高效液相色譜儀（日本島津制作所）；KQ-800DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius SQP 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；YF103-200G高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；DHG9420 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AnkeTDL-2B 臺(tái)式低速離心機(jī)（濟(jì)南存昌生物技術(shù)有限公司）；Hitech Smart-S15 純水儀（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試劑

大豆苷對(duì)照品（批號(hào)AZ21091701）、黃豆黃苷對(duì)照品（批號(hào)AZ22052701）、染料木苷對(duì)照品（批號(hào)AZ21090901）、大豆苷元對(duì)照品（批號(hào)AZ21102201）、黃豆黃素對(duì)照品（批號(hào)AZ22061011）、染料木素對(duì)照（批號(hào)AZ21101501），均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；甲醇和冰醋酸為色譜純（默克股份兩合公司，德國(guó)）；黑豆購(gòu)買于安徽亳州神農(nóng)谷藥材商品交易中心，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系辛海量教授鑒定為豆科植物大豆的成熟種子；淡豆豉為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵而成。

2 方法

2.1 淡豆豉的制備

根據(jù)《中國(guó)藥典》中淡豆豉的制作標(biāo)準(zhǔn)[1]，按質(zhì)量比1∶1∶10 稱量青蒿、桑葉和黑豆，用量筒量取青蒿桑葉總質(zhì)量的8 倍水，將青蒿、桑葉倒入圓底燒瓶中，加入量好的水，冷凝回流煎煮1 h，將煎煮好的中藥用尼龍紗布過(guò)濾，藥渣放入托盤中，濾液倒入燒杯中。將處理后的黑豆放入濾液中，浸泡16 h。取出黑豆，放入蒸煮鍋蒸煮1 h。晾約1 h 至黑豆表面基本干燥，之后放入燒杯中，將一定量的半干半濕的青蒿桑葉置于黑豆上層，覆蓋1.5 cm，置于35 ℃、濕度50%的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，6 天后取出一半，做為半成品淡豆豉樣品。剩余一半清洗稍晾后繼續(xù)放入燒杯中，上層覆蓋干燥的混勻后的青蒿、桑葉，置于35 ℃、濕度50%的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)發(fā)酵15 天，即為成品淡豆豉樣品。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品大豆苷10.93 mg、黃豆黃苷10.18 mg、染料木苷10.84 mg、大豆苷元5.09 mg、黃豆黃素5.19 mg 和染料木素8.95 mg，分別加入甲醇超聲溶解，于10 ml 容量瓶?jī)?nèi)定容，制成濃度 分 別 為1 093 μg/ml、1 018 μg/ml、1 084 μg/ml、509 μg/ml、519 μg/ml 和895 μg/ml 的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，再分別精密量取6 種異黃酮對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋，配制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液[9-10]。

2.2.2 供試品溶液制備

將黑豆及自制淡豆豉樣品60 ℃干燥，粉碎，過(guò)四號(hào)篩。取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10 ml 色譜甲醇，混勻，超聲處理2 h，放冷，再次稱重，甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，進(jìn)樣前用 0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：DiamonsilC18(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.2%醋酸水(A)－甲醇(B)，梯度洗脫(0～6 min，20%B；6～7 min，20%～40%B；7～12 min，40%B；12～22 min，40%～60%B；22～27 min，60%B；27～35 min，60%～90%B；35～40 min，90%B；40～41 min，90%～20%B；41～45 min，20%B)，流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μl?？瞻兹軇?、對(duì)照品、黑豆和淡豆豉樣品色譜峰如圖1 所示。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的保留時(shí)間依次為16.72 min、17.56 min、20.63 min、27.40 min、28.03 min 和30.95 min。

圖1 6 種異黃酮HPLC 色譜圖 (260nm 檢測(cè)波長(zhǎng))

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液適量，置同一10ml 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得大豆苷54.65 μg/ml、黃豆黃苷50.90 μg/ml、染料木苷54.20 μg/ml、大豆苷元50.90 μg/ml、黃豆黃素51.90 μg/ml 和染料木素44.75 μg/ml 混合對(duì)照品溶液。取混合對(duì)照品溶液加50%甲醇進(jìn)行逐級(jí)稀釋，制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。將信噪比大于且接近于10 的對(duì)照品溶液濃度作為定量限（LOQ），對(duì)于高于定量限的系列濃度的混合對(duì)照品溶液，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示 6 種化學(xué)成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

表1 6 種異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度分別為低、中、高的對(duì)照品溶液，在同一天內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣3 次，以峰面積計(jì)算3 次結(jié)果的RSD 值。低濃度對(duì)照品中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積結(jié)果的RSD 值分別為1.83%、0.39%、1.56%、1.45%、2.89%和0.59%；中濃度對(duì)照品中6 種異黃酮成分峰面積結(jié)果的RSD 值分別為0.08%、0.05%、0.05%、0.01%、0.41%和0.07%；高濃度對(duì)照品中6 種異黃酮成分面積結(jié)果的RSD 值分別為0.48%、0.42%、0.38%、0.44%、1.10%和0.59%。結(jié)果表明，此方法的日內(nèi)精密度良好。

取濃度分別為低、中、高的對(duì)照品溶液，連續(xù)3 天進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積計(jì)算3 次結(jié)果的RSD 值。低濃度對(duì)照品中6 種異黃酮成分峰面積結(jié)果的RSD值分別為0.13%、3.72%、3.52%、2.33%、2.15%和1.18%；中濃度對(duì)照品中6 種異黃酮成分峰面積結(jié)果的RSD 值分別為2.46%、2.61%、2.58%、2.28%、1.06%和1.81%；高濃度對(duì)照品中6 種異黃酮成分面積結(jié)果的RSD 值分別為3.44%、3.62%、3.70%、3.37%、3.08%和2.98%。結(jié)果表明，此方法的日間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批自制淡豆豉按上述條件制備 6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，6 種異黃酮大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為124.2 μg/g、37.11 μg/g、252.5 μg/g、273.4 μg/g、58.65 μg/g、283.3 μg/g，并計(jì)算含量的RSD 值分別為1.89%、1.79%、2.50%、2.04%、2.51%、2.67%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批自制淡豆豉的供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，在制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定6 種異黃酮的峰面積，計(jì)算6 種異黃酮峰面積的RSD 值，結(jié)果分別為1.93%、2.43%、0.94%、0.88%、1.01%和0.89%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置8h 的穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)同批次淡豆豉粉末約0.5 g，精密稱定，平行6 份，分別置于具塞錐形瓶中，每份分別精密加入近似等量的 6 種對(duì)照品溶液，精密加入色譜甲醇至10 ml，混勻，超聲處理2h，放冷，再次稱重，甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，進(jìn)樣前用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得加樣回收供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算各個(gè)化合物的回收率和回收率的RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果

用上述建立的方法對(duì)發(fā)酵前的黑豆、發(fā)酵中的半成品淡豆豉和發(fā)酵后的成品淡豆豉中6 種異黃酮的含量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，計(jì)算3 次檢測(cè)結(jié)果的平均值，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果比較。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黑豆、發(fā)酵中和發(fā)酵后的淡豆豉中 6 種異黃酮類成分含量比較

將上述結(jié)果用柱形圖表示，如圖2。

圖2 黑豆、淡豆豉半成品和淡豆豉成品中 6 種異黃酮類成分含量比較

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種通過(guò)高效液相色譜法對(duì)黑豆及發(fā)酵淡豆豉中的6 種異黃酮成分進(jìn)行含量檢測(cè)的分析方法，并對(duì)建立的分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)性的方法學(xué)驗(yàn)證。從圖1 中可以看出，該方法能夠檢測(cè)出黑豆及淡豆豉中的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素這6 種異黃酮成分，且空白溶劑對(duì)檢測(cè)無(wú)影響。說(shuō)明該高效液相色譜分析方法專屬性良好，適用于本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工藝下的淡豆豉中異黃酮的含量測(cè)定。經(jīng)線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)考查，該分析方法檢測(cè)6 種異黃酮的含量線性關(guān)系良好，較為精密和穩(wěn)定，回收率符合《中國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。其中，大豆苷、染料木苷和黃豆黃素的回收率偏低，可能是由于這3 種化合物的穩(wěn)定性較差，易分解或轉(zhuǎn)化，也可能是在濃縮等預(yù)處理過(guò)程中由于溶解度偏低的原因?qū)е禄衔镆欢ǔ潭壬系膿p失。

通過(guò)上述分析方法對(duì)發(fā)酵前的黑豆和課題組自制的半成品淡豆豉及成品淡豆豉進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)檢測(cè)出的含量進(jìn)行比較。根據(jù)圖2 所示，6 種異黃酮在發(fā)酵后淡豆豉中的含量相較于在未發(fā)酵的黑豆中，均有顯著性提升。其中，相較于大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷等結(jié)合型糖苷，大豆苷元、黃豆黃素和染料木素等游離型苷元的提升更加明顯。此外，與半成品淡豆豉相比較，成品淡豆豉中的6 種異黃酮的含量均較高，其中大豆苷、黃豆黃苷、大豆苷元這3 種異黃酮的含量增多較為明顯。從整體趨勢(shì)來(lái)看，在黑豆發(fā)酵成半成品淡豆豉再至成品淡豆豉的過(guò)程中，這6 種異黃酮的含量逐漸增多，在黑豆發(fā)酵為淡豆豉后，其中的異黃酮含量顯著升高，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，淡豆豉中異黃酮含量的增速變緩。

大豆異黃酮多以結(jié)合型糖苷的形式存在，一般認(rèn)為結(jié)合型的糖苷是無(wú)活性的，大量研究表明，異黃酮苷元具有較強(qiáng)的生物活性[13]。所以，上述結(jié)果可以表明，黑豆經(jīng)過(guò)發(fā)酵成淡豆豉后，其生物活性有明顯提升。另外，在黑豆發(fā)酵過(guò)程中，6 種異黃酮的含量持續(xù)提升，但隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，異黃酮含量提升趨勢(shì)變緩。這種趨勢(shì)的原因可能是，在黑豆發(fā)酵過(guò)程中，隨著呼吸作用的增強(qiáng)，異黃酮的生物合成的關(guān)鍵酶——苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）含量也隨之提高，使得發(fā)酵后的淡豆豉中的異黃酮的含量隨之提高，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呼吸作用的增強(qiáng)變緩[14]。