李志成，田淑芬，王榮，王超霞，李洋，穆丁郁

（天津農(nóng)學院/天津市葡萄遺傳與育種重點實驗室，天津 300384）

‘陽光玫瑰’葡萄具有甜度高、香味濃、抗病性強等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為最受歡迎的葡萄品種之一。在我國多地均有種植[1-3]，目前已成為鮮食葡萄的主栽品種[4]。部分產(chǎn)區(qū)由于栽培措施不當，導致品質(zhì)下降和嚴重減產(chǎn)減收[5-6]，因此提升‘陽光玫瑰’葡萄花芽分化質(zhì)量成為亟待解決的問題。

植物的花芽分化通常受植物內(nèi)部因子和外界環(huán)境因素共同調(diào)控。激素作為活性信號分子，在植物的整個發(fā)育過程中都起著非常重要的作用。吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、細胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）作為4種重要的植物內(nèi)源激素，在葡萄成花的生理活動中呈動態(tài)變化，不同激素響應(yīng)外界信號刺激，單獨或協(xié)同作用于植物的特定部位，通過不同的信號通路控制開花基因（SOC1、LFY、FLC等）的表達，從而起到調(diào)節(jié)植物成花的作用[7]。Luckwill在1970年提出激素平衡假說[8]，CTK促進成花，GA抑制成花，CTK/GAS的比值與成花能力呈正相關(guān)，即該值高時促進形成大量花芽。也有學者從ABA/GA、(IAA+GA3+CTK)/ABA等激素比值反映植物成花趨勢[9-11]。由于營養(yǎng)水平、激素供應(yīng)或外界環(huán)境因子等的差異，植株不同部位形成的芽體存在明顯的異質(zhì)性，同一結(jié)果母枝不同節(jié)位的冬芽發(fā)育并不完全一致[12]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，不同節(jié)位冬芽內(nèi)源激素含量差異明顯，花芽分化時間存在差異[13-15]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，雖然葡萄不同節(jié)位花芽間發(fā)育進程有差異，但最終會趨向一致[16]。

本研究從植物內(nèi)源激素層面分析天津地區(qū)‘陽光玫瑰’葡萄不同節(jié)位間花芽分化的差異，探究4種激素與葡萄花芽分化的相關(guān)性，為實際生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于天津市葡萄遺傳育種重點實驗室進行。供試材料為日光溫室栽培的9年生‘陽光玫瑰’葡萄，株距1.5 m，棚架栽培。試驗園位于39°27′N，117°07′E，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年均氣溫12.1 ℃，日照時數(shù)2730 h，降水584.9 mm，年均無霜期216 d。

1.2 試驗設(shè)計及樣品處理

試驗于2022年6月6日至10月5日進行。選擇樹勢良好的‘陽光玫瑰’葡萄植株，對保留7個以上冬芽節(jié)位的枝條，每15 d左右取樣一次，每次采集20組枝條，共采集9次。帶回實驗室，用刀片切下完整的冬芽，10組樣品用于徒手切片，10組樣品用于激素測定。用于激素測定的冬芽樣品在處理后快速放入液氮中保存。

1.3 冬芽切片觀察

對各時期不同節(jié)位冬芽進行縱切，置于體式解剖鏡下觀察，并拍照。

1.4 花芽率的測定

在切片中，將芽體飽滿、鱗片狀托葉頂部較為圓潤、或能直接觀察出花序原基結(jié)構(gòu)的記為花芽；芽體不飽滿、芽內(nèi)鱗片狀托葉頂部較尖、無明顯花序結(jié)構(gòu)記為葉芽。統(tǒng)計不同時期內(nèi)花芽葉芽的數(shù)量，使用公式計算。

花芽率（%）=(花芽數(shù)量/總芽數(shù))×100

1.5 激素含量的測定

本試驗采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測定植物內(nèi)源激素IAA、ABA、CTK、GA3含量。

將葡萄冬芽從液氮中取出，放入預冷的研缽中快速研磨，稱取0.05 g粉末至預冷的離心管中，加入0.45 mL PBS緩沖液（pH 7.4），渦旋30 s，保證樣品充分混勻。以3000 r·min-1離心30 min，仔細收集上清液，分裝，進行不同激素含量的測定。試驗方法參照試劑盒說明書進行。每個樣品3次重復。

酶聯(lián)免疫試劑盒由武漢純度生物公司提供，使用Spectra Max M5酶標儀在波長450 nm下測定標準樣品及待測樣品吸光度值，制作標準曲線，計算待測樣品激素含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26軟件進行方差分析（P＜0.05），Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬芽形態(tài)觀察

通過對冬芽的切片觀察發(fā)現(xiàn)，葡萄冬芽隨著物候期的變化不斷成熟。圖1可知，在6月6—21日，冬芽整體呈現(xiàn)嫩綠色，芽體內(nèi)各部分分化程度較淺；在7月4日，著生在鱗片狀托葉上呈絨毛狀的毛被較為明顯，芽體內(nèi)呈現(xiàn)紅褐色；隨著冬芽生長發(fā)育，毛被逐漸增多，在生長后期，葡萄冬芽內(nèi)花序原基逐漸發(fā)育變大。在10月5日時期，冬芽逐漸進入休眠。

圖1 不同時期葡萄冬芽的形態(tài)Figure 1 Morphology of winter buds of grapevine at different times

同一時期，不同節(jié)位間芽存在明顯的異質(zhì)性。由圖1可以看出，第2～6節(jié)位冬芽發(fā)育程度高，芽體飽滿，且發(fā)育較快；第1節(jié)位發(fā)育程度低，且發(fā)育慢；第7節(jié)位冬芽發(fā)育程度較好，但是在發(fā)育后期，出現(xiàn)主芽壞死的情況。

2.2 花芽率調(diào)查

葡萄冬芽花芽率整體隨著生長發(fā)育逐漸升高，多數(shù)節(jié)位在6月21日—7月19日花芽率大幅升高（圖2）。在7月19日，第3節(jié)位花芽率最先達到100%，第2節(jié)位在8月18日達到100%，但第1節(jié)位在9月2日花芽率穩(wěn)定在80%，第7節(jié)位花芽率在10月5日降低。

圖2 不同節(jié)位各時期花芽率Figure 2 Flower bud rate at different nodes and stages

2.3 不同節(jié)位冬芽中IAA含量的動態(tài)變化

如圖3所示，從6月6日—10月5日，‘陽光玫瑰’葡萄冬芽中IAA含量在63.85～137.119 mmol·g-1范圍內(nèi)變化。不同時期，第1～7節(jié)位冬芽中IAA含量呈下降-升高-下降-升高-下降的變化趨勢。在6月6—21日，IAA含量下降，結(jié)合花芽分化情況，此時的第1、4、5、6節(jié)位冬芽花芽分化不活躍，花芽率增長緩慢。在7月4日，IAA含量出現(xiàn)一個峰值，在6月21日至7月19日期間，第2、3、4、5、7節(jié)位冬芽分化迅速，花芽率迅速提高；在7月19日至9月2日，各節(jié)位冬芽IAA含量逐漸升高，第1、2、6、7節(jié)位冬芽花芽率也隨之升高。

圖3 不同節(jié)位各時期IAA含量Figure 3 IAA content at different nodes and periods

在6月21日，第2節(jié)位冬芽中IAA含量最低，顯著低于其他6個節(jié)位。7月4日，第2節(jié)位和第3節(jié)位冬芽中IAA含量較高；8月3日，第1節(jié)位冬芽IAA含量顯著高于其他節(jié)位。

2.4 不同節(jié)位冬芽中ABA含量的動態(tài)變化

如圖4所示，從6月6日至10月5日，‘陽光玫瑰’葡萄冬芽中ABA含量在325.87～593.01 ng·g-1范圍內(nèi)變化。不同時期，第1～7節(jié)位冬芽中ABA含量呈升高-下降-升高-下降的變化趨勢。整個時期中，葡萄冬芽在6月6日ABA含量最低；在6月6日—7月19日，ABA含量升高，此時期第2、3、4、5、7節(jié)位冬芽花芽率升高；各節(jié)位冬芽在9月2日時ABA含量達到最大值，在525.44～593.01 ng·g-1，第2、4節(jié)位在此時期花芽率也達到100%。隨著果實的進一步成熟，各節(jié)位ABA含量逐步降低。

圖4 不同節(jié)位各時期ABA含量Figure 4 ABA content at different nodes and periods

整個生理分化時期中，在6月6日，各節(jié)位冬芽間ABA含量差異不顯著；在9月2日，第6節(jié)位ABA含量最高，第5節(jié)位最低。隨著果實進一步成熟，到9月21日第1節(jié)位冬芽ABA含量最高，為466.22 ng·g-1，顯著高于第4～7節(jié)位冬芽。

2.5 不同節(jié)位冬芽中CTK含量的時期變化

如圖5所示，從6月6日至10月5日，‘陽光玫瑰’枝條冬芽中CTK的含量在162.33～280.86 ng·g-1范圍內(nèi)變化。不同時期，第1～7節(jié)位冬芽中CTK含量呈下降-升高-下降的變化趨勢。6月6日—7月19日葡萄冬芽中CTK含量低于8月3日—10月5日。在8月3日，第1～7節(jié)位冬芽CTK含量迅速升高，在9月2日達到最大值。

圖5 不同節(jié)位各時期CTK含量Figure 5 CTK content at different nodes and periods

在整個生理分化時期中，6月21日—7月19日，第1～7節(jié)位冬芽CTK含量降低，不同節(jié)位間差異不顯著。在9月2日，第1～7節(jié)位冬芽CTK含量最高，其中，第1、2節(jié)位含量較高，分別為280.86、278.33 ng·g-1，顯著高于其他5個節(jié)位。在9月21日，第1節(jié)位冬芽CTK含量最高，為270.32 ng·g-1，顯著高于其他節(jié)位。

2.6 不同節(jié)位冬芽中GA3含量的動態(tài)變化

如圖6所示，從6月6日至10月5日，‘陽光玫瑰’葡萄冬芽中GA3含量在529.43～838.71 pmol·g-1范圍內(nèi)變化。不同時期，第1～7節(jié)位冬芽中GA3含量呈升高-下降-升高-下降的變化趨勢。在6月6日，第1～7節(jié)位冬芽GA3含量最低。在6月21日，不同節(jié)位冬芽GA3含量升高，且較高節(jié)位達到最高。在7月4—19日，第1～7節(jié)位冬芽GA3含量整體呈現(xiàn)下降趨勢。在9月2日，較低節(jié)位冬芽GA3含量最高。

在整個生理分化時期，GA3含量在6月6日最低，其中第4節(jié)位GA3含量最低，第2～7節(jié)位GA3含量顯著低于第1節(jié)位。在6月21日，第3、4節(jié)位冬芽GA3含量顯著低于第5、7節(jié)位。7月19日之后，第1～7節(jié)位冬芽GA3含量迅速升高；在9月2日，第1、2節(jié)位冬芽GA3含量在整個時期達到最高值，顯著高于其它5個節(jié)位。在9月21日，第4節(jié)位冬芽GA3含量顯著低于其他節(jié)位。

2.7 不同節(jié)位冬芽發(fā)育中ABA/GA3比值變化

如圖7所示，第1～7節(jié)位冬芽ABA/GA3比值整體較為穩(wěn)定，在0.51～0.92范圍內(nèi)變化。在6月21日，第3、4節(jié)位ABA/GA3比值首先升高，顯著高于其他節(jié)位。而同時期第6、7節(jié)位比值低，其中第6節(jié)位最低。冬芽發(fā)育至7月19日，第3、4、5節(jié)位ABA/GA3的比例升高，其中第3節(jié)位比值最大。在8月18日至9月2日，ABA/GA3比值整體隨節(jié)位升高而增加。

圖7 不同節(jié)位各時期ABA/GA3Figure 7 ABA/GA3 at different nodes in different periods

2.8 不同節(jié)位冬芽發(fā)育中CTK/GA3比值變化

如圖8所示，第1～7節(jié)位冬芽CTK/GA3比值呈現(xiàn)降低-升高的趨勢，在0.24～0.41范圍內(nèi)變化。6月21日至7月19日，第1～7節(jié)位冬芽CTK/GA3比值較其他時期低；在6月21日，第2、3節(jié)位比值最高；在7月4日，第2節(jié)位最高；7月19日至8月3日，各節(jié)位CTK/GA3比值逐漸升高；在8月3日，低節(jié)位冬芽的CTK/GA3比值較高。

圖8 不同節(jié)位各時期CTK/GA3Figure 8 CTK/GA3 at different nodes in different periods

2.9 不同節(jié)位冬芽發(fā)育中(IAA+GA3+CTK)/ABA比值變化

如圖9所示，第1～7節(jié)位冬芽(IAA+GA3+CTK)/ABA比值呈現(xiàn)下降-上升-下降趨勢，在1.59～2.74范圍內(nèi)變化。第3、5節(jié)位在7月19日降至最低值，其中第5節(jié)位(IAA+GA3+CTK)/ABA比值最低，第6、7節(jié)位在8月18日—9月2日降至最低。

圖9 不同節(jié)位各時期(IAA+GA3+CTK)/ABAFigure 9 (IAA+GA3+CTK)/ABA at different nodes in different periods

3 討論

植物的成花是多種激素在一定的比例下對植物進行的調(diào)控[17]。在不同物種間，相同的激素對花芽分化的調(diào)控作用并不一致。

目前，IAA與花芽分化間的關(guān)系存在爭議，高水平的IAA能夠促進側(cè)柏成花[18]；而在枇杷中，低水平的IAA促進成花[19]。李秉真等[20]在對蘋果梨研究中發(fā)現(xiàn)，短枝生長停止后，較低的IAA含量有利于芽體進入生理分化，而較高的IAA含量有利于進入形態(tài)分化期；在形態(tài)分化期，較低的IAA含量有助于形態(tài)分化各時期的完成。Zhang等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，IAA信號參與花柄和花冠伸長且均有略微延遲開花的作用；魯榮海[22]在對葡萄二次開花結(jié)果的研究中發(fā)現(xiàn)，高含量的IAA促進葡萄花芽分化。本研究中，在生理分化時期，中部節(jié)位IAA含量較高，說明IAA促進葡萄的花芽分化，這與王海波等[23]的研究一致。

吳志祥等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)：GA3促進了營養(yǎng)枝的伸長從而影響荔枝的花芽分化，低水平的GA3有利于荔枝的花芽分化。譚巍[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，GA可以提高蝴蝶蘭的抽薹率，促進早花。通常，GA對于非誘導條件下的開花、需低溫抽薹的開花及日中性不需低溫的園藝植物起促進開花的作用，對于多年生果樹、林木的成花起抑制作用。在本研究中，分化初期冬芽內(nèi)GA3含量較低，并且中部節(jié)位GA3含量較低，驗證了GA3對于葡萄花芽分化的抑制作用。

目前，ABA對花芽分化的研究還不完善。吳志祥等[24]對荔枝的研究中發(fā)現(xiàn)，ABA能夠促進果樹的成花，且上部枝條的花芽分化程度也好于下部枝條。但在魯榮海[22]的研究中，低含量的ABA促進‘夏黑’葡萄花芽分化，說明ABA抑制成花。本研究中，在分化前期，中部節(jié)位ABA含量高，說明ABA對葡萄花芽起促進作用。有研究證明，在生理分化期，高水平的CTK促進植物花芽分化[26]，這與本研究結(jié)果一致。

果樹的花芽分化是由多種激素共同調(diào)控。張瑞等[27]在對紫斑牡丹研究中發(fā)現(xiàn)，較高ZR/IAA、ZR/GA3、ABA/GA3、ZR/IAA比值有利于花芽分化，(GA3+IAA+ZR)/ABA與(IAA+ZR)/GA3比值減小分別促進重瓣花朵花瓣原基和雄蕊原基的形成。李志娟等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低水平的ABA/GA3值均有利于萱草從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長，較高水平的ZR/GA3、(GA3+IAA+ZR)/ABA值有利于萱草花器官原基的形態(tài)建成。在本研究中，(GA3+IAA+CTK)/ABA比值小有利于葡萄成花。CTK/GA3、ABA/GA3比值越大，越有利于成花。

4 結(jié)論

在生理分化后期，第1節(jié)位冬芽花芽率為80%，第2～6節(jié)位冬芽花芽率均能達到100%；在整個生理分化時期，第1～3節(jié)位葡萄冬芽IAA、ABA、CTK含量整體較高，且第2、3節(jié)位GA3含量較低；在花芽分化前期，第2、3節(jié)位冬芽的CTK/GA3、ABA/GA3比值整體較高，且第1～3節(jié)位(IAA+GA3+CTK)/ABA比值較低，說明第2、3節(jié)位冬芽的分化質(zhì)量好且花芽率高。綜上，在天津雙街地區(qū)‘陽光玫瑰’葡萄冬剪建議保留3個冬芽。