尚廣彬，陳中，張鐘康，盧震，路千里，嚴小軍，盧曉南（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展中心，江西 南昌 000；2.江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點實驗室，江西 南昌 000；.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 000；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 000）

免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia，ITP）屬于自身免疫性疾病，以外周血小板計數(shù)減少為主要特征，其主要的發(fā)病機制是由于人體自身免疫耐受機制被打破，體液免疫和細胞免疫紊亂，產(chǎn)生抗自身血小板抗體，引發(fā)血小板破壞增多、巨核細胞分化成熟障礙及生成血小板減少[1-2]。其中巨核細胞分化成熟障礙越來越受到關(guān)注[3-5]，它是指骨髓中巨核細胞數(shù)目正?；蛟龆?，但分化不足，成熟受阻，產(chǎn)板不良，導(dǎo)致血小板減少，是ITP的特征性改變，也是其發(fā)病和治療的關(guān)鍵。

ITP 屬于中醫(yī)“血癥”范疇，以隨著外周血小板數(shù)量減少，或伴皮膚黏膜出血、紫癜及瘀斑等為特點，中醫(yī)診治專家共識建議對各證型ITP 適時、適度使用活血化瘀藥物進行干預(yù)治療[6]。腫節(jié)風(fēng)［Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai］是金粟蘭科草珊瑚屬植物，具有活血化瘀、涼血止血的功效，以及抗免疫性血小板減少性紫癜的藥理作用[7-8]。本課題組前期研究[9-11]表明，腫節(jié)風(fēng)總黃酮提取物能明顯提高成熟巨核細胞的數(shù)量和促進巨核系祖細胞集落的形成，并可以通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，改善骨髓巨核細胞分化成熟障礙狀態(tài)，促進其分化成熟并生成血小板，但具體作用機制尚不清楚。故本研究擬利用體外巨核細胞分化成熟障礙模型，探索腫節(jié)風(fēng)總黃酮通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/c-Jun N-末端激酶（JNK）信號通路促進巨核細胞分化成熟的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株人類巨核細胞白血病Dami 細胞株，購于中國科學(xué)院細胞資源中心。

1.2 藥物及試劑腫節(jié)風(fēng)總黃酮提取物，由本實驗室前期制備[7]：將腫節(jié)風(fēng)浸膏利用HDP-400 大孔樹脂吸附，70%乙醇洗脫，冷凍干燥得到的固形物即為總黃酮，以蘆丁作對照檢測總黃酮含量為78.53%。兔抗大鼠血小板血清（APS，貨號：201108），參考盧曉南等[10]方法由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司定制；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA，貨號：P1585），美國Sigma-Aldrich 公司；RPMI Medlium 1640 培養(yǎng)基（貨號：C11875500BT），美國Hyclone 公司；胎牛血清（貨號：11011-8611），浙江天杭生物科技股份有限公司；青鏈霉素混合液（貨號：P1400），北京索萊寶科技有限公司；化學(xué)發(fā)光細胞活力檢測試劑盒（貨號：G9241），美國Promega 公司；Anti-Human CD41a PE（貨號：12-0419-42）、Anti-Human CD42b FITC（貨號：11-0429-42）、Anti-Human CD61 FITC（貨號：11-0619-42），均購自美國 eBioscience 公司；Phospho- SAPK/JNK（Thr183/Tyr185，81E11）Rabbit mAb（貨號：4668）、SAPK/JNK Antibody（貨號：9252）、Phospho-c-Jun（Ser73，D47G9）XP?Rabbit mAb（貨號：3270）、c-Jun（60A8）Rabbit mAb（貨號：9165）、β-Tubulin（D2N5G） Rabbit mAb（貨號： 15115）、GAPDH（D16H11）XP?Rabbit mAb（貨號：5174），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體（貨號：SA00001-0），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光液（貨號：CW0049S），江蘇康維世紀有限公司。

1.3 主要儀器Forma 3111 型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司；Spark 10M 型多功能酶標儀，瑞士Tecan 公司；Moflo XDP 流式細胞儀，美國BeckmanCoulter 公司；Mini-PROTEAN 蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Chemi Doc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.4 體外巨核細胞分化成熟模型的建立、分組及藥物干預(yù)取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期Dami 細胞進行實驗，利用終濃度為5 ng·mL-1的PMA 和體積分數(shù)為1%的APS 聯(lián)合作用于Dami 細胞，構(gòu)建體外巨核細胞分化成熟障礙模型。實驗分為空白對照組（Control組）、PMA 誘導(dǎo)組（5 ng·mL-1）、APS 模型組（5 ng·mL-1PMA+1% APS，Model 組）以及腫節(jié)風(fēng)總黃酮高、中、低劑量組（15.6、7.8、3.9 μg·mL-1腫節(jié)風(fēng)總黃酮+5 ng·mL-1PMA+1% APS），細胞接種后將培養(yǎng)板移入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.5 化學(xué)發(fā)光法檢測細胞增殖活力收集對數(shù)生長期細胞，以每孔5 000 個細胞（體積100 μL）接種于96 孔板中，分組同“1.4”項下，增加調(diào)零組，每組4 個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48、72、96 h 后，以每孔100 μL 滴加化學(xué)發(fā)光試劑，搖床振蕩反應(yīng)10 min 后，置于多功能酶標儀中檢測500 ms 的Luminesence 讀數(shù)（L 讀數(shù)）。計算：細胞相對增殖活力（%）=［（實驗孔L 讀數(shù)-調(diào)零孔L 讀數(shù)）/（對照孔L 讀數(shù)-調(diào)零孔L 讀數(shù)）］×100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測巨核細胞分化情況取對數(shù)生長期細胞，以每孔6 ×104個細胞（體積1 mL）接種于12 孔板，分組同“1.4”項下，每組4 個復(fù)孔。藥物干預(yù)96 h 后，收集各組細胞至2 mL 離心管，用磷酸緩沖液（PBS）離心清洗2 次，用500 μL PBS 重懸細胞；再加入5 μL Anti-Human CD41a PE、Anti-Human CD42b FITC、Anti-Human CD61 FITC 染液，混勻后在室溫下避光染色30 min。用細胞篩網(wǎng)進行過濾后，采用流式細胞儀檢測巨核細胞分化成熟的表面標記分子CD41a、CD42b 及CD61 表達情況，結(jié)果用FolwJo 7.0 軟件進行分析。

1.7 Western Blot 法檢測細胞MAPK/JNK 信號通路相關(guān)蛋白的表達情況取對數(shù)生長期細胞，以每孔1×105個細胞（體積2 mL）接種于6 孔板，分組同“1.4”項下，每組3 個復(fù)孔。藥物干預(yù)96 h 后收集各組細胞，離心清洗后加入200 μL RIPA 裂解液（使用之前加入蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min；以13 500×g離心15 min，取上清蛋白液，采用BCA 酶標法測定蛋白濃度。以每孔20 μg 蛋白標準配制，加入6×Loading Buffer，混勻，100 ℃加熱10 min。上樣進行SDS-PAGE 電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用5% BSA 室溫下封閉1 h 后，分別加入Phospho-SAPK/JNK（1∶1 000）、SAPK/JNK（1∶2 000）、Phospho-c-Jun（1∶1 000）、c-Jun（1∶2 000）、β-Tubulin（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗，4 ℃下孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（1∶4 000），室溫下孵育1.5 h；TBST 洗膜3 次，每次10 min，采用ECL 發(fā)光液于凝膠成像儀顯影，掃描；以β-Tubulin/GAPDH 為內(nèi)參，使用ImageJ 1.53 軟件對目的蛋白進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞增殖活力的影響結(jié)果見表1。與空白對照組相比，PMA 誘導(dǎo)組不同時間點的細胞活力均顯著降低（P＜0.01），與PMA 誘導(dǎo)巨核細胞分化成熟增殖受抑制有關(guān)。與PMA 誘導(dǎo)組相比，APS 模型組48 h 的細胞活力明顯下降（P＜0.05），但隨時間延長抑制作用減弱，72、96 h 的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與APS 模型組比較，腫節(jié)風(fēng)總黃酮中、高劑量組48、72 h 的細胞活力均受到明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01），腫節(jié)風(fēng)總黃酮高劑量組96 h 的細胞活力受到顯著抑制（P＜0.01）。結(jié)果表明，腫節(jié)風(fēng)總黃酮對體外巨核細胞分化成熟模型Dami 細胞的增殖活性有明顯的抑制效應(yīng)，可能與其促進巨核細胞分化成熟有關(guān)。

表1 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞增殖活力的影響（±s，n=4）Table 1 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on Dami cell viability（±s，n=4）

表1 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞增殖活力的影響（±s，n=4）Table 1 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on Dami cell viability（±s，n=4）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與PMA 誘導(dǎo)組比較，ΔP＜0.05；與APS 模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白對照組PMA 誘導(dǎo)組APS 模型組腫節(jié)風(fēng)總黃酮低劑量組腫節(jié)風(fēng)總黃酮中劑量組腫節(jié)風(fēng)總黃酮高劑量組劑量/（μg·mL-1）細胞相對增殖活力/%96 h 100.00±0.00 91.26±3.31##90.37±2.72 88.68±3.41 85.08±3.11 80.23±3.20**---3.9 7.8 15.6 48 h 100.00±0.00 94.54±1.75##90.31±0.57Δ 89.79±2.44 81.25±2.37**77.74±2.38**72 h 100.00±0.00 93.35±3.08##91.74±2.45 88.69±4.36 82.92±2.71*79.46±3.24**

2.2 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對巨核細胞分化成熟標志物表達的影響結(jié)果見圖1、圖2、圖3。與空白對照組比較，PMA 誘導(dǎo)組Dami 細胞表面的CD41a、CD42b 和CD61 表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與PMA 誘導(dǎo)組比較，APS 模型組Dami 細胞表面的CD41a、CD42b 和CD61 表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與APS 模型組比較，腫節(jié)風(fēng)總黃酮高、中劑量組Dami細胞表面的CD41a、CD42b 和CD61 表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，利用PMA 及APS 誘導(dǎo)Dami 細胞成功建立體外巨核細胞分化成熟障礙模型，而腫節(jié)風(fēng)總黃酮能夠改善巨核細胞的分化成熟障礙狀態(tài)，促進細胞表面CD41a、CD42b 和CD61表達。

圖1 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞表面CD41a 表達的影響（±s，n=4）Figure 1 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on the expression of CD41a on the surface of Dami cell（±s，n=4）

圖2 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞表面CD42b 表達的影響（±s，n=4）Figure 2 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on the expression of CD42b on the surface of Dami cell（±s，n=4）

圖3 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞表面CD61 表達的影響（±s，n=4）Figure 3 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on the expression of CD61 on the surface of Dami cell（±s，n=4）

2.3 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞MAPK/JNK 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響結(jié)果見圖4。與PMA 誘導(dǎo)組比較，APS 模型組Dami 細胞的p-JNK/JNK 及p-c-Jun/c-Jun 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）。與APS模型組比較，腫節(jié)風(fēng)總黃酮中、高劑量組Dami 細胞的p-JNK/JNK 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；腫節(jié)風(fēng)總黃酮低、中、高劑量組Dami 細胞的p-c-Jun/c-Jun 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，腫節(jié)風(fēng)總黃酮可能通過抑制MAPK/JNK 信號通路的激活，改善體外巨核細胞分化成熟障礙模型的分化受阻狀態(tài)。

圖4 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對Dami 細胞p-JNK、JNK、c-Jun 及p-c-Jun 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 4 Effect of flavonoids from Sarcandrae glabra on the protein expressions of p-JNK，JNK，p-c-Jun and c-Jun of Dami cell（±s，n=3）

3 討論

免疫性血小板減少癥（ITP）屬于機體免疫失衡造成的血液性疾病，主要發(fā)病機制是由于各種原因引發(fā)體液及細胞免疫異常活化，產(chǎn)生抗自身血小板抗體，導(dǎo)致體內(nèi)血小板破壞增多或/和巨核細胞分化成熟障礙[1]。有研究[3]認為，抗自身血小板抗體與巨核細胞結(jié)合，使之分化成熟受阻，無法生成血小板才是血小板減少的主要原因。因此，利用含抗血小板抗體的血清（APS）作為一種成熟的ITP 動物模型誘導(dǎo)劑，能抑制骨髓內(nèi)巨核細胞分化成熟，有效減少模型動物的血小板，可以較好地模擬ITP 發(fā)病時的狀態(tài)[12-14]。目前對體外巨核細胞分化成熟障礙模型的研究相對不足，因此本研究利用巨核細胞分化經(jīng)典誘導(dǎo)劑佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）作用于體外Dami 巨核細胞，誘導(dǎo)其快速分化成熟，同時結(jié)合APS 阻逆巨核細胞分化成熟。結(jié)果顯示，模型組Dami 細胞表面的巨核細胞分化標志分子CD41a、CD42b 和CD61 表達量顯著降低，表明成功構(gòu)建了體外巨核細胞分化成熟障礙模型；而腫節(jié)風(fēng)總黃酮干預(yù)后，可顯著上調(diào)模型組Dami 細胞表面CD41a、CD42b 和CD61 表達，促進巨核細胞的分化成熟。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、細胞凋亡以及病理條件下的應(yīng)激反應(yīng)，可分為4 個亞族：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）。研究表明，MAPK 信號通路直接或間接參與巨核細胞的增殖、分化和成熟過程[15-17]；ITP 診治指南推薦的二線治療藥物艾曲波帕可以通過MAPK信號通路中ERK1/2 信號分子的活化促進巨核細胞分化成熟，加速生成血小板[18-19]。本研究結(jié)果顯示，空白對照組及PMA 誘導(dǎo)組Dami 細胞的p-JNK、p-c-Jun 蛋白基本不表達，而APS 誘導(dǎo)后模型組Dami 細胞JNK、c-Jun 蛋白磷酸化水平顯著升高。表明APS能夠促進巨核細胞中JNK 及c-Jun 蛋白磷酸化，激活MAPK 信號通路，抑制巨核細胞分化成熟。而腫節(jié)風(fēng)總黃酮干預(yù)后，APS 模型組細胞的p-JNK、pc-Jun 蛋白表達明顯下調(diào)，提示腫節(jié)風(fēng)總黃酮可能通過調(diào)節(jié)MAPK/JNK 信號通路來改善巨核細胞分化成熟障礙狀況。

骨髓內(nèi)巨核細胞分化成熟形成血小板是一個復(fù)雜的動態(tài)過程[20]，MAPKs 在該過程中的調(diào)節(jié)作用亦復(fù)雜，且取決于多個因素，因為巨核細胞分化成熟過程本身涉及不同的連續(xù)步驟[21]。因此，本課題組后續(xù)將利用MAPK/JNK 信號通路激動劑、拮抗劑等進行對照實驗，以更深入探討腫節(jié)風(fēng)總黃酮促巨核細胞分化成熟的機制。另外，MAPK 信號通路調(diào)控巨核細胞分化成熟的關(guān)鍵靶點也需要進一步驗證，其上下游復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機制還有待更深入的研究。