李平，夏小芳，于文靜，楊苗，金怡杰，賀春香，成紹武，鄧思思，宋禎彥（中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種復雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD 與衰老相關(guān)，以進行性的認知、行為、語言功能障礙等全面性的癡呆為特征[1]。AD 的病因目前尚未明確，研究[2]表明腦內(nèi)慢性炎癥是AD 的始動因素和推動疾病發(fā)展的病理基礎(chǔ)。AD 中過度的β 淀粉樣蛋白（Amyloid beta，Aβ）沉積和過度磷酸化的tau 蛋白持續(xù)刺激驅(qū)動慢性炎癥持續(xù)進行[3]，炎癥刺激激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌各種促炎細胞因子和趨化因子，進一步放大炎癥反應(yīng)最終導致神經(jīng)退行性病變和認知能力下降[4]。Toll 樣受體在免疫細胞中高度表達，腦內(nèi)主要表達于小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是單個的跨膜非催化性蛋白，可以識別外源非特異性刺激并激活機體產(chǎn)生免疫細胞應(yīng)答，TLR4 通過骨髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）對炎癥刺激做出反應(yīng)并介導炎癥信號轉(zhuǎn)導[5]。研究[6-7]表明，TLR4 和促炎細胞因子在AD 小鼠和AD 患者的表達增加，抑制TLR4 介導的神經(jīng)炎癥可以減輕AD 認知功能障礙[8]。

當歸芍藥散出自東漢末年著名醫(yī)家張仲景所著的《金匱要略》，由當歸、白芍、川芎，茯苓、白術(shù)、澤瀉組成，是疏肝健脾，化痰通絡(luò)的經(jīng)典良方。課題組前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，當歸芍藥散可以調(diào)控NLRP3/Caspase-1 信號通路抑制AD 大鼠神經(jīng)炎癥?；谇捌谘芯康幕A(chǔ)，本研究以大鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-42構(gòu)建AD 模型，從TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路探討當歸芍藥散對AD 模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 動物SD 大鼠，雄性，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量（160±30）g，24 只，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買，動物質(zhì)量合格證號：202008004116，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF 級實驗動物中心，相對溫度22～24 ℃，相對濕度50 %～60 %，12 h 明/暗循環(huán)，自由飲水和攝食。動物實驗通過湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會審批，審批號：LL-2020071501。

1.2 藥物及試劑當歸芍藥散，組方為當歸、白芍、白術(shù)、茯苓、澤瀉、川芎，中藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，由湖南中醫(yī)藥大學科創(chuàng)中心制備成凍干粉，-80 ℃保存。戊巴比妥鈉，德國Merck KGaA 公司，批號：20210522；Aβ1-42，美國Sigma-Aldrich 公司，批號：AG968；TLR4 抗體、MyD88 抗體、GFAP 抗體，北京博奧森公司，批號分別為：bs-20595R、bs-1047R、bs-0199R；NF-κB p65/RelA 抗體、phospho-NF-κB p65/RelA-s276 抗體，武漢ABclonal 公司，批號分別為：A2547、AP0123；Iba1 抗體，日本W(wǎng)AKO 和光純藥株式會社，批號：011- 27991；TRIzol、SlowFadeTMGold Antifade Mountant with DAPI、驢抗兔熒光二抗Alexa Fluor 488（綠色）、驢抗山羊熒光二抗Alexa Fluor 647（紅色），美國賽默飛世爾公司，批號分別為：15596-026、S36942、A21206、A32849；通用二步法檢測試劑盒（小鼠/兔增強聚合物法檢測系統(tǒng)），北京中杉金橋公司，批號：PV-9000；山羊抗兔二抗，美國Sigma-Aldrich 公司，批號：AP132P；β-actin、IL-1β、IL-6、TNF-α 引物根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫序列使用Primer 6.0 軟件設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光染料，日本寶生物公司，批號分別為：RR047A、RR820L；氯仿、異丙醇、無水乙醇，冰乙酸均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器Heraeus Fresco 17 型超速冷凍離心機、HM355S 型石蠟切片機，美國賽默飛世爾公司；垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、T100 型實時熒光PCR 儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；A1+型激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司；Cytation3 型多功能酶標儀，美國Bio-Tek 公司。

1.4 藥物制備按照《金匱要略》中當歸芍藥散的比例分別稱取當歸9 g、白芍48 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、澤瀉24 g、川芎24 g，采取水提法提取藥液并濃縮，使用真空干燥設(shè)備制備凍干粉并測定主要成分含量進行質(zhì)控，詳細方法參照課題組前期已報道的方案[10]。

1.5 分組及給藥方法大鼠24 只，每組6 只，隨機分為4 組：假手術(shù)組、模型組、當歸芍藥散組和陽性藥物（米諾環(huán)素）組。大鼠模型復制2 d 后進行連續(xù)灌胃給藥，按每日2 次，連續(xù)治療14 d。前期研究[11]發(fā)現(xiàn)等效于2 倍臨床劑量的當歸芍藥散干預(yù)為最佳劑量，故當歸芍藥散給藥劑量為24 g·kg-1·d-1；米諾環(huán)素根據(jù)體表面積換算給藥劑量為36 mg·kg-1·d-1；假手術(shù)組和模型組灌胃等劑量生理鹽水。

1.6 模型復制雙側(cè)側(cè)腦室腦立體定位注射Aβ1-42的實驗方法參照課題組已報道的方案[11]，采用3 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，以俯臥姿勢將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上，參考《大鼠腦立體定位圖譜》（第6 版）找到大鼠雙側(cè)側(cè)腦室定位儀坐標，顱骨鉆打孔，微量注射器在側(cè)腦室雙側(cè)各注5 μL Aβ1-42（2 μg·mL-1），假手術(shù)組注射等劑量生理鹽水。留針5 min 后出針，傷口消毒并縫合。動物蘇醒前保溫，蘇醒后觀察24 h，活動正常視為手術(shù)成功。以Morris水迷宮測試評價模型是否成功。

1.7 Morris 水迷宮各組動物給藥治療14 d 后開始Morris 水迷宮檢測。前5 d 為學習階段，訓練大鼠尋找平臺，水迷宮平均分為4 個象限，將目標平臺置于第一象限固定位置低于水面2 cm 處。測試時大鼠頭朝池壁依次從每個象限固定位置放入水面，記錄大鼠逃逸時間即60 s 內(nèi)大鼠找到平臺并停留的時間，如大鼠未能找到平臺則記為60 s，并將大鼠引導至平臺站立5 s 幫助學習。每天早晚各學習1 次。第6 天撤去平臺測試大鼠記憶能力，從各象相項固定位置池壁放置大鼠，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)即在60 s 內(nèi)穿過目標平臺的次數(shù)和記錄大鼠在目標象限停留的時間。

1.8 組織取材水迷宮觀測后采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹部做U 型切口，用50 mL 注射器從左心室插入并開放右心耳，用4 ℃生理鹽水進行心臟灌注，直至肝臟發(fā)白，斷頭取腦。冰上操作分離左右腦，左側(cè)使用4%多聚甲醛溶液固定，右側(cè)冰上剝離海馬組織，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存。

1.9 HE 染色腦組織經(jīng)脫水固定后切片，烘烤脫蠟后，使用蘇木素染色，酸水及氨水中分色數(shù)秒，流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻。乙醇-伊紅染色3 min，以70%～90%梯度乙醇各脫水10 min，100%乙醇脫水，二甲苯透明切片，滴加中性樹膠后蓋玻片封片，光學顯微鏡拍照成像。

1.10 免疫熒光固定好的背側(cè)海馬石蠟切片，脫蠟與水化，細胞通透及封閉，抗原修復，血清封閉，孵育一抗，孵育二抗。切片顯色，復染及封片，顯微鏡下觀察切片并保存圖像，記錄統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.11 蛋白免疫印跡法（Western Blot）取出凍存的海馬組織，加入裂解液及蛋白酶抑制劑提取蛋白樣品，按BCA 法測定蛋白濃度，制膠及上樣；電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗孵育4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h；ECL 發(fā)光顯色，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標條帶的分子量和凈光密度值。

1.12 實時熒光定量PCR（qPCR）取大鼠海馬組織，TRlzol 法提取總RNA，檢測RNA 純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR Green 染料法在實時（Real-time）PCR 儀上運用兩步法進行擴增，預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火+延伸58 ℃，30 s，共40 個循環(huán)。最終記錄各目的基因2-△△Ct值并進行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

1.13 免疫組織化學取大鼠腦組織石蠟切塊進行切片，取石蠟切片脫蠟與水化，細胞通透及封閉，抗原修復，血清封閉；孵育一抗，孵育二抗；切片顯色，復染及封片，顯微鏡下觀察切片并保存圖像記錄統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.14 統(tǒng)計學處理方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 25.0 軟件進行分析，統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性和方差齊性，采用Kruskal-WallH檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 當歸芍藥散對AD 大鼠學習記憶能力的影響如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組AD 大鼠學習第5 天平均逃逸時間明顯延長，第6 天撤出平臺后能找到平臺的次數(shù)明顯減少，在目標區(qū)域停留的時間也明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示模型復制成功。與模型組比較，當歸芍藥散組大鼠學習第5 天平均逃逸時間明顯減少，第6 天撤出平臺后穿過平臺次數(shù)明顯增加，且在目標區(qū)域停留時間明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。陽性藥物組大鼠同樣也表現(xiàn)出平均逃逸時間縮短、穿越平臺次數(shù)增加和在目標象限停留時間增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 當歸芍藥散對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠學習記憶能力的影響（±s，n=6）Figure 1 Effect of Danggui Shaoyao San on learning and memory ability of AD rats（±s，n=6）

2.2 當歸芍藥散對AD 大鼠神經(jīng)元病理形態(tài)的影響如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大部分神經(jīng)元組織排列紊亂，較多神經(jīng)元細胞丟失、核固縮。與模型組比較，當歸芍藥散干預(yù)組神經(jīng)元排列更整齊且清晰可見，神經(jīng)元丟失、核固縮減少；陽性藥物（米諾環(huán)素）干預(yù)組也可以觀察到相同的病理改變。

圖2 當歸芍藥散對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠神經(jīng)元海馬組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×400）Figure 2 Effect of Danggui Shaoyao San on the pathological morphology in hippocampal tissue of AD rats（HE staining，×400）

2.3 當歸芍藥散對AD 大鼠海馬組織小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化的影響如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化數(shù)量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且呈現(xiàn)聚集性，多分布在海馬組織周圍。與模型組比較，當歸芍藥散和米諾環(huán)素干預(yù)后大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 當歸芍藥散對阿爾茨海默病（AD）大鼠海馬組織小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化的影響（±s，n=6）Figure 3 Effects of Danggui Shaoyao San on microglia and astrocyte activation in hippocampus of AD rats（±s，n=6）

2.4 當歸芍藥散對AD 大鼠海馬組織炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA 表達的影響如圖4 所示，與假手術(shù)比較，模型組IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，當歸芍藥散和陽性對照組IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA 表達均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 當歸芍藥散對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠海馬組織TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達的影響（±s，n=6）Figure 4 Effect of Danggui Shaoyao San on mRNA expressions of TNF-α，IL-6 and IL-1β in hippocampus of AD rats（±s，n=6）

2.5 當歸芍藥散對AD 大鼠海馬組織TLR4、MyD88和p-NF-κB p65 蛋白表達的影響如圖5 所示，與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、MyD88 和p-NF-κB的蛋白表達量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，當歸芍藥散組和陽性藥物組TLR4、MyD88 和p-NF-κB 蛋白表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖5 當歸芍藥散對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠海馬組織TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 5 Effect of Danggui Shaoyao San on the protein expressions of TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65 in hippocampus of AD rats（±s，n=3）

2.6 當歸芍藥散對AD 大鼠模型海馬組織NF-κB p65 核轉(zhuǎn)移的影響如圖6 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元中NF-κB p65 出現(xiàn)散點狀入核的細胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，當歸芍藥散組和陽性藥物組大鼠海馬組織神經(jīng)元中NF-κB p65 出現(xiàn)散點狀入核的細胞數(shù)量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且與Western Blot 結(jié)果一致。

圖6 當歸芍藥散對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠海馬組織NF-κB p65 核轉(zhuǎn)移的影響（±s，n=3）Figure 6 Effect of Danggui Shaoyao San on nuclear translocation of NF-κB p65 in hippocampus of AD rats（±s，n=3）

3 討論

中醫(yī)認為，阿爾茨海默?。ˋD）屬于癡呆范疇，其主要病機為臟腑虧虛、痰濁瘀血蒙蔽清竅。研究[2]指出，神經(jīng)炎癥可能是導致AD 神經(jīng)退行性病變的關(guān)鍵病理過程。陳可冀院士指出：“無形之瘀病理實質(zhì)是炎癥反應(yīng)”，可見AD 神經(jīng)炎癥的基本病機為血瘀，痰阻氣滯以致血瘀，瘀血流注于腦，清竅受蒙。當歸芍藥散是《金匱要略》中記載的一個肝脾同調(diào)、痰瘀并治的名方。研究[12-14]表明，中藥復方當歸芍藥散對AD 具有積極的治療改善作用。課題組前期研究[15]發(fā)現(xiàn)，與炎癥相關(guān)的TNF 信號通路及NF-κB信號通路是當歸芍藥散治療AD 的主要作用途徑。本研究結(jié)果顯示AD 大鼠的學習記憶能力在通過當歸芍藥散干預(yù)后明顯改善，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化數(shù)量明顯減少，炎癥因子表達下降，神經(jīng)元形態(tài)和功能恢復，提示當歸芍藥散能抑制AD 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥且與抑制膠質(zhì)細胞活化有關(guān)。TLR4/NF-κB 途徑是調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)細胞活化的重要信號通路[16]。前期研究[17]提示，當歸芍藥散能調(diào)控抑制NF-κB 信號通路激活降低炎癥反應(yīng)，但當歸芍藥散是否能調(diào)控TLR4 信號通路抑制AD 神經(jīng)炎癥仍不清楚。

Toll 樣受體是一種重要的天然受體免疫蛋白。TLR 的激活可通過促進細胞內(nèi)信號通路促進炎性細胞因子的表達，這對識別和清除入侵病原體至關(guān)重要[18]。MyD88 依賴性途徑是TLR 的主要信號途徑之一，MyD88 具有模塊化結(jié)構(gòu)，在其N 端有一個死亡域（DD），DD 結(jié)構(gòu)域激活后，MyD88 通過產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6），激活kappa B 抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）并泛素化、磷酸化降解核因子κB 抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），使得胞漿內(nèi)NF-κB 解離活化并轉(zhuǎn)移入核（尤其是p65 亞單位），從而與炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥[19]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的核心，可以活化包括小膠質(zhì)細胞在內(nèi)的炎性細胞，從而促進炎癥反應(yīng)的形成、發(fā)展和惡化[20]。本研究中，在大鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42后，Western Blot 結(jié)果顯示Aβ1-42注射后大鼠腦內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB 含量增加，表明Aβ1-42毒性刺激不僅影響到NF-κB 途徑啟動炎癥因子，還影響到TLR4/MyD88 信號通路的激活，促進炎癥因子的分泌。另外，給予當歸芍藥散干預(yù)后膠質(zhì)細胞活化減少，炎癥因子的表達水平明顯下降，一定程度上表明當歸芍藥散作用于MyD88 及其下游的信號通路，并參與調(diào)控NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用，這與我們前期的細胞實驗結(jié)果一致[17]。

綜上所述，AD 中Aβ 聚集物的持續(xù)毒性刺激驅(qū)動腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞過度活化導致促炎細胞因子和趨化因子產(chǎn)生過多損傷神經(jīng)元，最終導致神經(jīng)退行性病變和認知能力下降。當歸芍藥散能改善Aβ1-42誘導的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其機制可能是通過調(diào)控TLR4/MyD88 信號通路抑制炎癥因子的激活，發(fā)揮抗炎作用，從而保護神經(jīng)元。