邢春濤,余 琦,張璐莎,李 玨,3,關(guān) 華,王 樂,李 蓉,4

0 引言

在眼科研究中,小鼠模型是廣泛應(yīng)用的實驗動物之一,常用于研究各種眼部疾病的發(fā)病機制以及新型治療方法的篩選[1-3]。然而,由于小鼠眼球較小,活體實驗很難對其進行視網(wǎng)膜血管觀察,因此需要使用其他技術(shù)來觀察小鼠視網(wǎng)膜血管的變化。常見的小鼠視網(wǎng)膜血管觀察技術(shù)包括熒光素標(biāo)記[4-5]、光學(xué)相干斷層掃描血管造影[6-7]、熒光素血管造影[8-9]等方法,靜脈伊文思藍(lán)推注聯(lián)合視網(wǎng)膜鋪片是研究視網(wǎng)膜血管性疾病的常用技術(shù)方法[10-11]。該方法可以清楚地觀察到視網(wǎng)膜血管的走形、分布及滲漏情況[12-13],還能夠?qū)o灌注區(qū)的視網(wǎng)膜面積進行估算[14-15],且具有成本低、易操作、高靈敏度等特點。但在視網(wǎng)膜鋪片染色過程中,由于伊文思藍(lán)注射后在體內(nèi)循環(huán)時間、小鼠眼球在4%多聚甲醛固定液中的固定時間、視網(wǎng)膜鋪片所用的時間等存在差異,加之使用的封片劑種類不同等技術(shù)問題,均會對實驗結(jié)果的分析比較產(chǎn)生影響。因此,為了獲得更好的實驗結(jié)果,本實驗中我們對上述問題進行了比較分析,并總結(jié)了視網(wǎng)膜鋪片染色的實驗技巧,優(yōu)化了實驗方案,以期為視網(wǎng)膜血管性疾病的相關(guān)研究提供更為準(zhǔn)確、可靠的實驗技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料C57BL/6雄性17周齡小鼠30只,購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗部分均由陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室倫理委員會審核并批準(zhǔn)(SQXZDSYS202201)。1%伊文思藍(lán)溶液:0.3g伊文思藍(lán)(Evans blue,美國Sigma公司)溶于30mL生理鹽水中,震蕩溶解,過濾,4℃低溫避光保存,使用前取適量,且需水浴預(yù)熱至37℃?zhèn)溆谩?%組織固定液(陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥公司),抗熒光淬滅劑(索萊寶生物科技有限公司),體視顯微鏡(SZ2-ILST,日本OLYMPUS公司),倒置熒光顯微鏡(IXT3,日本OLYMPUS公司),小鼠尾注靜脈顯像儀(ZH-XQ,原陽振華教學(xué)儀器公司),15°眼科手術(shù)穿刺刀(南京易樂醫(yī)療器械有限公司),顯微彈簧剪、顯微有齒鑷(瑞沃德生命科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 尾靜脈注射將小鼠置于自制小鼠固定器中,肉眼找到小鼠相對較粗的尾靜脈,再用小鼠尾注靜脈顯像儀找到該靜脈粗細(xì)均勻的部位,用1mL注射器(斜面朝上)與尾部呈15°角穿刺進針,當(dāng)注射器斜面基本完全沒入尾部,將注射器尾部下壓,盡量使其與鼠尾平行,同時向前行針,此時會有明顯的無阻力感[16]。當(dāng)針進入血管約1/4～1/3時,推注1%伊文思藍(lán)溶液0.3mL,注射后立即可見小鼠通體變?yōu)樗{(lán)色,尤其是口唇、耳、爪等裸露部位,表明該操作成功。分別于10min(26眼)、20min(6眼)后處死小鼠[17-18]。當(dāng)鼠尾靜脈注射失敗時,給予小鼠腹腔注射1%伊文思藍(lán)溶液0.3mL,分別在腹腔注射后1、2、3h觀察小鼠體表顏色,發(fā)現(xiàn)在3h小鼠體表顏色與靜脈注射10min最接近,因此,當(dāng)尾靜脈注射失敗時,可以給予小鼠1%伊文思藍(lán)溶液0.3mL腹腔注射后循環(huán)3h的補救方法(8眼),見圖1。

圖1 實驗流程圖。

1.2.2 視網(wǎng)膜鋪片小鼠處死后立即摘取雙側(cè)眼球,去除眼球后部肌肉及結(jié)締組織等眼球附屬組織,置于4%多聚甲醛固定液中進行固定,分別固定20min(10眼)、40min(10眼)、60min(20眼)后,在體視顯微鏡下用15°眼科手術(shù)穿刺刀在角鞏膜緣處做穿刺口(圖2A),用顯微彈簧剪從穿刺口沿角鞏膜緣剪開(圖2B),去除角膜、虹膜、晶狀體、玻璃體,將眼杯以視神經(jīng)為中心,放射狀均勻剪開,分為4部分(圖2C),鞏膜面朝上置于載玻片上,剪去視神經(jīng)及鞏膜與視神經(jīng)移形處,使視網(wǎng)膜與葡萄膜完全脫離,去除鞏膜、葡萄膜及視網(wǎng)膜上殘留的色素組織,將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上,滴1～2滴抗熒光淬滅劑,立即蓋上蓋玻片,置于倒置熒光顯微鏡下,通過綠色熒光進行拍照。

圖2 視網(wǎng)膜剝離過程示意圖 A:在體視顯微鏡下用15°眼科手術(shù)穿刺刀在角鞏膜緣處做穿刺口;B:用顯微彈簧剪從穿刺口沿角鞏膜緣剪開;C:剝離的眼組織。

1.2.3 滲漏點計數(shù)使用Image J軟件計數(shù)每高倍視野下(HPF)視網(wǎng)膜熒光滲漏,其中片狀滲漏僅記錄1次。

2 結(jié)果

2.1 尾靜脈注射與腹腔注射對比當(dāng)鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液成功后,可見小鼠口唇爪等皮膚裸露部位即刻明顯變藍(lán),此為伊文思藍(lán)注射成功的標(biāo)志。當(dāng)鼠尾靜脈注射失敗時,給予小鼠1%伊文思藍(lán)溶液0.3mL腹腔注射循環(huán)3h后,小鼠的外觀顏色對比無明顯區(qū)別(圖3),且運用此兩種伊文思藍(lán)注射方法制作的視網(wǎng)膜鋪片,在熒光顯微鏡下觀察可見血管走形及顯影清晰程度無明顯區(qū)別(圖4)。

圖3 正常小鼠、伊文思藍(lán)尾靜脈注射、伊文思藍(lán)腹腔注射三者體表顏色對比 尾靜脈注射及腹腔注射伊文思藍(lán)后小鼠口鼻、爪、耳變藍(lán),且兩者外觀無明顯區(qū)別。

圖4 伊文思藍(lán)尾靜脈注射與腹腔注射兩者視網(wǎng)膜成像對比 血管走形及顯影清晰程度無明顯區(qū)別。A、B:500μm;C、D:200μm。

2.2 伊文思藍(lán)體內(nèi)循環(huán)時間的影響當(dāng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)成功后,體內(nèi)循環(huán)10min與20min相比,循環(huán)10min取材時,視網(wǎng)膜熒光拍照:血管外組織無熒光著色,血管與周圍組織熒光對比明顯,血管形態(tài)、走形清晰(圖5A、D)。循環(huán)20min取材時,視網(wǎng)膜熒光拍照:血管外組織明顯著色,血管與周圍組織熒光對比不強烈,血管形態(tài)、走形欠清晰(圖5B、E)。若尾靜脈注射伊文思藍(lán)失敗后,要立即進行腹腔注射進行補救,若尾靜脈注射失敗后與腹腔注射間隔時間過長或過夜,視網(wǎng)膜組織會出現(xiàn)過染(圖5C、F)。

圖5 伊文思藍(lán)體內(nèi)循環(huán)時間的影響 A:血管外組織無熒光著色,血管與周圍組織熒光對比清晰;B:血管外組織明顯著色,血管與周圍組織熒光對比不明顯;C:背景熒光過強,僅能看到大血管走形;D:血管形態(tài)、走形清晰;E:血管形態(tài)模糊,走形觀察不清晰;F:背景熒光過強,血管網(wǎng)形態(tài)模糊,血管與周圍組織無法形成對比。

2.3 組織固定時間的影響4%多聚甲醛固定小鼠眼球20、40、60min對比,固定60min[19]時小鼠視網(wǎng)膜與葡萄膜脫離更加完全,可以減少因不完全脫離進行操作造成的視網(wǎng)膜損傷。固定20min時,熒光顯微鏡下可見視網(wǎng)膜血管形態(tài)模糊不清,熒光滲漏明顯(圖6A);高倍鏡下可見,血管走形不連續(xù),背景熒光不均勻,無法形成很好的觀察(圖6D)。固定40min時,低倍鏡下可見視網(wǎng)膜血管形態(tài)明顯清晰,雖仍存在熒光滲漏,但明顯減少(圖6B);高倍鏡下可見血管走形清晰、連續(xù),背景熒光偶見不均勻(圖6E)。固定60min時,低倍鏡下可見視網(wǎng)膜血管形態(tài)十分清晰(圖6C);高倍鏡下可見血管走形清晰連續(xù),背景熒光均勻,偶見熒光滲漏,可以清晰明確地進行觀察(圖6F),組織固定20min進行操作時,視網(wǎng)膜出現(xiàn)熒光滲漏個數(shù)明顯高于固定40、60min(圖7)。

圖6 組織固定時間的影響 A:血管走形模糊不清,熒光滲漏明顯;B:血管走形可以觀察,仍存在少量熒光滲漏;C:血管走形清晰,無熒光遮擋;D:血管形態(tài)模糊,背景熒光形成遮擋;E:血管形態(tài)較為清晰、連續(xù),背景熒光偶見遮擋;F:血管形態(tài)清晰連續(xù),背景熒光均勻。白箭頭示熒光滲漏。

圖7 組織固定20、40、60min視網(wǎng)膜熒光滲漏的差異 bP<0.01 vs組織固定20min。

3 討論

視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色及視網(wǎng)膜鋪片是研究視網(wǎng)膜血管性疾病的常用技術(shù)方法[10,20]。伊文思藍(lán)注射聯(lián)合視網(wǎng)膜鋪片是研究視網(wǎng)膜血管形態(tài)和血管滲漏的常用方法[21-22],該方法能夠清晰顯示視網(wǎng)膜內(nèi)整體的血管走形、形態(tài)及滲漏情況。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)伊文思藍(lán)溶液不同的注入方式、不同的體內(nèi)循環(huán)時間,以及不同的組織固定時間均可影響視網(wǎng)膜鋪片染色實驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,不利于研究者進行實驗。故本研究對當(dāng)前伊文思藍(lán)注射聯(lián)合視網(wǎng)膜鋪片技術(shù)進行了系統(tǒng)地歸納總結(jié)以及優(yōu)化。我們采用尾靜脈注射的方式注入小鼠體內(nèi)1%伊文思藍(lán)溶液0.3mL,與之前文獻報道的心臟灌注法、上腔靜脈穿刺灌注法相比優(yōu)勢在于以下3個方面:(1)小鼠不需要進行麻醉,絕對避免了因麻醉造成的意外事件[23-24]。(2)尾靜脈注射與心臟灌注及上腔靜脈灌注相比,小鼠尾靜脈注射不需要打開小鼠胸腔或者頸部皮膚,直接通過尾靜脈進行注射,明顯減少操作時間,操作更加簡便。(3)若尾靜脈注射失敗,可以通過立即進行腹腔注射來補救實驗。通過分析本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射方法雖然簡單易操作,但是需要體內(nèi)循環(huán)3h才能與尾靜脈注射體內(nèi)循環(huán)10min體表染色程度相近,其時間成本過高,大大延長實驗時間。文獻顯示通過上腔靜脈推注2%伊文思藍(lán),體內(nèi)循環(huán)5min[10],視網(wǎng)膜血管形態(tài)清晰。由于伊文思藍(lán)有一定毒性以及參考伊文思藍(lán)使用說明,本實驗通過尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)溶液觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài),結(jié)果顯示1%伊文思藍(lán)溶液體內(nèi)循環(huán)10min時,視網(wǎng)膜血管形態(tài)清晰,視網(wǎng)膜血管外組織無熒光著色,血管與周圍組織對比更加明顯。由于組織固定時間[25]及環(huán)境溫度[26]均可影響眼球固定效果,通過查閱文獻我們分別觀察了眼球固定20、40、60min對實驗結(jié)果的影響,對比發(fā)現(xiàn),室溫16℃條件下,眼球固定20min時,視網(wǎng)膜與葡萄膜黏連較為緊密,在剝離時會對視網(wǎng)膜組織造成較大面積的損傷,嚴(yán)重影響實驗結(jié)果;固定40min時,視網(wǎng)膜與葡萄膜存在少量黏連,且黏連緊密程度明顯降低,剝離黏連處時仍存在損傷視網(wǎng)膜的風(fēng)險;固定60min時,視網(wǎng)膜近乎完全脫離,減少因視網(wǎng)膜與葡萄膜黏連緊密,剝離視網(wǎng)膜組織造成的組織損傷。本研究為清晰地觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)和血管滲漏提供了一種簡便的、穩(wěn)定的、重復(fù)性高的操作技術(shù)。

將實驗中的技巧與心得進行總結(jié)與分析:(1)尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)0.3mL成功后,要嚴(yán)格把控10min的循環(huán)時間,及時處死小鼠進行眼球固定,循環(huán)時間過長,會出現(xiàn)血管周邊組織著色。(2)尾靜脈注射伊文思藍(lán)失敗后,立即進行腹腔注射進行補救,腹腔注射1%伊文思藍(lán)0.3mL循環(huán)3h與尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)0.3mL循環(huán)10min相比,體表染色程度相近且熒光顯微鏡下視網(wǎng)膜血管形態(tài)、走形、血管周邊組織著色情況大致相同。如若尾靜脈注射失敗后間隔較長時間再進行腹腔注射,視網(wǎng)膜組織會出現(xiàn)過染,將無法對視網(wǎng)膜血管進行觀察。(3)眼球在進行4%多聚甲醛固定前,要先剪除眼外肌及筋膜等組織,充分暴露眼球外壁,確保眼球可以充分固定。小鼠眼球固定時,在室溫16℃情況下,以50～60min為宜,此時視網(wǎng)膜與葡萄膜基本完全脫離,可以有效避免實驗者手動脫離對于視網(wǎng)膜造成的損傷。室溫不同,固定的時間應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長或縮短。(4)眼杯制作成功后,要觀察切緣是否殘存視網(wǎng)膜移形部位,因移形部位是視網(wǎng)膜與葡萄膜結(jié)合緊密部位,因此在最大程度保存視網(wǎng)膜組織的同時,盡量將視網(wǎng)膜移形部位剪除干凈,避免在鋪片過程中牽扯視網(wǎng)膜組織。(5)視神經(jīng)處同樣是視網(wǎng)膜與周圍組織黏連緊密處,此處盡量將視神經(jīng)平齊視網(wǎng)膜剪除,降低視網(wǎng)膜黏連程度,同時保證視網(wǎng)膜組織及視盤的完整性。(6)將眼杯以視盤為中心,放射狀剪開4處,剪開深度以眼杯邊緣至視盤總長的2/3為宜,過于接近視盤,操作時容易造成視網(wǎng)膜組織撕裂損傷,剪開過于接近眼杯邊緣,容易造成視網(wǎng)膜邊緣卷曲,不易展片。(7)切忌先將視網(wǎng)膜剝離,再轉(zhuǎn)移至載玻片上進行鋪片。單純視網(wǎng)膜很難在載玻片上展片成功,且在轉(zhuǎn)移過程中極易損傷視網(wǎng)膜組織。應(yīng)將整個眼杯轉(zhuǎn)移至載玻片上進行展片。(8)將剪好的眼杯在載玻片上進行展片時,應(yīng)將視網(wǎng)膜面朝下,滴1～2滴無菌PBS溶液或生理鹽水可防止視網(wǎng)膜組織干裂,同時有助于展片的順利進行。(9)封片前用吸水紙吸取多余水分,滴1～2滴抗熒光淬滅劑,立即蓋上蓋玻片并進行熒光顯微鏡下拍照,時間過長視網(wǎng)膜組織會發(fā)生固縮。

小鼠伊文思藍(lán)靜脈推注聯(lián)合視網(wǎng)膜鋪片技術(shù)是一種用于研究小鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)和功能的方法[27-28]。該方法的優(yōu)點包括可以同時觀察視網(wǎng)膜血管的形態(tài)及滲漏情況,并且能夠研究視網(wǎng)膜血管性疾病相關(guān)病理變化和發(fā)展動態(tài)。另外,和其他檢測方法相比,靜脈推注技術(shù)不需要特殊設(shè)備和操作技能,其操作簡單,成本低廉[29-30]。