丁夢羽,肖葛瓊

(紹興文理學院附屬醫(yī)院 腫瘤內科,浙江 紹興 312000)

肝癌是世界范圍內癌癥相關死亡的第4大常見原因,也是發(fā)病率和死亡率逐年上升的少數腫瘤之一[1]。常規(guī)化療和放射治療對肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的療效有限[2],HCC患者的五年生存率小于5%[3]。近年來,微小RNA(miRNA)已被驗證在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起顯著作用。Piao等[4]發(fā)現過表達miR-424-5p可以抑制肝癌細胞增殖,并誘發(fā)細胞凋亡。KIF23屬于KIF家族,在多個腫瘤組織和細胞中高度表達[5]。已有研究[6]發(fā)現,正常肝組織中未檢測到KIF23的拼接變異(KIF23 V1和KIF23 V2),卻在HCC組織中呈異常表達。KIF23的表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關,但KIF23對肝癌的調控機制還不明確。本研究探究miR-424-5p和KIF23在肝癌中的調控機制,以探索新的肝癌靶向治療途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 正常人肝細胞系HL-7702[L-02](BNCC100012)、人肝癌細胞系HCCLM3(BNCC351888)、MHCC97-L(BNCC337741)均購買于北納生物。37 ℃、5% CO2的條件下,HL-7702[L-02]細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,HCCLM3和MHCC97-L細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中。

1.2 細胞轉染 miR-424-5p mimics(miR-mimics)、miR-NC、miR-424-5p inhibitor(miR-inhibitor)、inhibitor-NC以及pcDNA3.1-KIF23質粒(oe-KIF23)和空的pcDNA3.1質粒(oe-NC)均購自Ribobio(中國)。按照Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen,美國)說明書將miR-424-5p mimics、NC-mimics和質粒轉染到肝癌細胞系HCCLM3中,轉染24 h。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,美國)按照制造商使用說明書從細胞中提取總RNA,并使用iScript cDNA synthesis Kit(Bio-Rad,美國)將miRNA和mRNA反轉錄為cDNA。使用SYBR-Green方法(Qiagen,德國)在Bio-Rad CFX96定量實時PCR系統上檢測miR-424-5p和KIF23的相對表達,分別用U6和GAPDH作為內部參照。用2-ΔΔCt方法分析miR-424-5p和KIF23的表達。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞增殖實驗 將細胞懸液以每孔約2×103個細胞轉移到裝有100 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔板中,分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h將10 μL CCK-8溶液(碧云天,中國)添加到每個孔中。在37 ℃下孵育1.5 h后,使用Spectra Max 250分光光度計(Molecular Devices,美國)測量450 nm的吸光度。

1.5 流式細胞術實驗 調整細胞濃度為100個/mL離心收集細胞沉淀加入預冷75%乙醇于4 ℃固定后,用100 μL的RNase A(100 μg/mL,Sigma-Aldrich,美國)處理細胞。再加入500 μL碘化丙啶(PI染液,50 μg/mL,Sigma-Aldrich, 美國)后4 ℃避光孵育30 min。用流式細胞儀(Beckman-Coulter,美國)分析細胞周期分布,結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。測定各組G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分比,并進行比較。

1.6 克隆形成實驗 將肝癌細胞(2×103個/孔)接種于6孔板培養(yǎng)板中,在FBS的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng);當細胞形成肉眼可見的克隆(每個克隆細胞數在50～150個左右)時終止培養(yǎng),用4%多聚甲醛固定細胞并用0.1%的結晶紫染色。使用配備有MicroPublisher 3.3 RTV相機的光學顯微鏡捕獲圖像,計算每孔的克隆數。

1.7 劃痕愈合實驗 使用劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力。將細胞接種在6孔板中,當細胞覆蓋達到80%時使用200 μL移液管尖端輕輕刮擦穿過孔中心的單層,然后用PBS洗細胞2次以去除劃下的細胞,加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于0 h和24 h時拍照記錄。

1.8 雙螢光素酶實驗 使用位點突變法構建野生型(wt)KIF23-WT和突變型(mut)KIF23-MUT 3’-UTR的pmirGLO載體(Promega,美國)。使用Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen,美國)將100 nM miR-mimics/miR-NC和KIF23-WT/KIF23-MUT質粒共轉染到肝癌細胞系HCCLM3中。轉染后48 h,通過雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega,美國)檢測螢光素酶活性。

1.9 蛋白質免疫印跡(western blot,WB) 使用BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific,美國)測量蛋白質濃度并定量,10% SDS-PAGE上電泳分離蛋白并轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Millipore,美國),室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后在4 ℃下與一抗孵育過夜。將膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用增強型化學發(fā)光檢測系統(Thermo Fisher Scientific,美國)對蛋白質進行可視化。一抗為兔抗KIF23(Abcam,英國)、GAPDH(Abcam,英國),二抗為山羊抗兔IgG(Abcam,英國)。

1.10 生物信息分析 從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲得肝癌組織中差異表達的miR-424-5p,并在TCGA肝癌的mRNA差異分析中篩選出2 244個在腫瘤組織中上調的mRNA,同時利用TargetScan、miRTarBase、mirDIP數據庫對miR-424-5p進行靶基因預測,并與上調的2 244個DEmRNA取交集獲得與miR-424-5p相關性最大的基因KIF23。TCGA-LIHC數據集分析KIF23在正常組織和癌組織中的表達水平。利用Targetscan數據庫預測miR-424-5p和KIF23的結合位點(http://www.targetscan.org/mamm_31/)。

1.11 統計分析 應用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 8.0進行統計分析,組間數據差異比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-424-5p在肝癌中的表達情況 基于TCGA數據分析顯示,與正常組織比較,miR-424-5p在肝癌組織中顯著低表達(P<0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示,miR-424-5p在肝癌細胞系(HCCLM3、MHCC97-L)中的表達量(0.30±0.04、0.46±0.03)均低于正常人肝細胞系(HL-7702),差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 過表達miR-424-5p對HCCLM3細胞生物功能的影響 轉染miR-424-5p-mimics/miR-NC至HCCLM3細胞系中,細胞的miR-424-5p表達量顯著上調(P<0.05),見封三圖1A,可用于之后的實驗。CCK8和克隆形成實驗結果顯示,miR-424-5p過表達組的細胞增殖能力(1.09±0.08;26±3)低于NC組(1.42±0.09;54±4),差異有統計學意義(P<0.05),見封三圖1B、C。劃痕愈合實驗結果表明,轉染miR-424-5p-mimics的細胞遷移能力(16.70±1.33)低于miR-NC的細胞(29.40±2.16),差異有統計學意義(P<0.05),見封三圖1D。流式細胞術分析細胞周期分布,發(fā)現轉染miR-mimics后HCCLM3細胞阻滯在G0/G1期(封三圖1E)。

2.3 敲低miR-424-5p對MHCC97-L細胞生物功能的影響 qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-inhibitor后的細胞miR-424-5p表達量(0.39±0.03)顯著下調(P<0.05)。CCK8和克隆形成實驗結果顯示,與NC組(1.38±0.13,60±6.0)相比,敲低miR-424-5p(1.88±0.17,123±11)明顯增強MHCC97-L細胞的增殖能力,差異有統計學意義(P<0.05)。劃痕愈合實驗結果顯示,miR-inhibitor組的細胞遷移能力(37.0±4.0)高于inhibitor-NC組(26.0±3.0),差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞術分析細胞周期分布,結果顯示抑制miR-424-5p的表達使得MHCC97-L細胞周期阻滯于S期。

2.4 miR-424-5p與KIF23在肝癌細胞中的關系 分析結果顯示,miR-424-5p和KIF23 3’-UTR具有結合位點(圖1A),miR-424-5p與KIF23有靶向結合關系(圖1B)。TCGA-LIHC數據集分析結果顯示,KIF23在肝癌組織中的表達高于正常組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1C。qRT-PCR和WB 檢測發(fā)現KIF23在肝癌細胞系中的表達量(HCCLM3:2.50±0.20,MHCC97-L:2.10±0.18)均高于正常人肝細胞系,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1D、E。與miR-NC和inhibitor-NC組(1.00±0.10)相比,miR-424-5p過表達組的KIF23表達顯著下調(0.51±0.05);敲低miR-424-5p后,KIF23表達顯著上調(1.98±0.18);差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1F、G。

A.生信預測miR-424-5p與KIF23的靶向結合位點;B.雙螢光素酶實驗檢測不同處理組的熒光素酶活性;C.KIF23在正常組和腫瘤組的表達量箱線圖;D.qRT-PCR檢測在正常細胞系和肝癌細胞系中KIF23 mRNA 表達水平;E.Western blot 實驗檢測正常細胞和肝癌細胞系中KIF23蛋白水平;F.qRT-PCR檢測不同轉染組KIF23 mRNA的表達;G.Western blot檢測不同轉染組KIF23蛋白表達情況;* P<0.05。圖1 KIF23與miR-424-5p在肝癌細胞中的關系Figure 1 The relationship of KIF23 and miR-424-5p in liver cancer cells

2.5 miR-424-5p與KIF23共同作用對肝癌細胞生物功能的影響 構建對照組(miR-NC+oe-NC)、KIF23過表達組(miR-NC+oe-KIF23)、miR-424-5p和KIF23共過表達組(miR-mimics+oe-KIF23),qRT-PCR和Western blot實驗結果顯示oe-KIF23組中KIF23表達顯著上調(P<0.05),KIF23過表達組、共過表達組細胞中KIF23的表達量(3.10±0.30、1.12±0.10)與對照組相近(1.00±0.11),見圖2A、B。CCK8和克隆形成實驗結果顯示,過表達KIF23顯著增強肝癌細胞的增殖能力,進一步過表達miR-424-5p會抑制KIF23過表達對細胞增殖能力的促進作用(圖2C、D)。劃痕愈合實驗發(fā)現,KIF23過表達組的細胞遷移能力(39.00±2.16)高于對照組(31.00±3.33)和共過表達組(33.00±2.57),差異均有統計學意義(P<0.05),見圖2E。

A、B.不同轉染組細胞中KIF23 mRNA和蛋白的表達;C、D.CCK8和克隆形成實驗檢測不同轉染組細胞的增殖能力;E.劃痕愈合實驗檢測不同轉染組細胞的遷移能力;*P<0.05。圖2 miR-424-5p與KIF23共同作用對肝癌細胞生物功能的影響Figure 2 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the biological function of liver caner cells

2.6 miR-424-5p與KIF23共同作用對肝癌細胞周期的影響 流式細胞術分析顯示, KIF23過表達組細胞周期阻滯于S期,共過表達組細胞周期阻滯于G0/G1期,見圖3。

*P<0.05。圖3 流式細胞術分析不同轉染組的細胞周期分布情況Figure 3 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the cell cycle of liver cancer cells

3 討論

學者對miRNA在疾病中的發(fā)生和進展作用機制進行了廣泛研究,發(fā)現miR-424-5p在多種癌癥中發(fā)揮不同的調控作用:miR-424-5p作為抑制基因在結直腸癌[7]、甲狀腺癌[8]等多種癌癥中抑制腫瘤細胞增殖和遷移,同時也能作為促癌因子促進胃癌、胰腺癌等腫瘤的細胞增殖[9-10]。在本研究中,我們證實了miR-424-5p在肝癌細胞中低表達,且miR-424-5p能抑制肝癌細胞的增殖和遷移,使細胞周期進程阻滯于G0/G1期,說明miR-424-5p在肝癌細胞中是抑癌因子,發(fā)揮抑癌作用。

近年來,研究證實KIF23可作為肺癌[11]、胃癌[5]、卵巢癌[12]的潛在治療靶點。在有絲分裂晚期,中心紡錘體蛋白是由兩種成分組裝而成的復合體,而KIF23是這兩種必要成分之一,此復合體的形成被稱為細胞因子學的重要步驟[13]?；贙IF23在細胞周期中的重要地位,研究靶向KIF23的調控因子有助于揭示抑制腫瘤細胞增殖的相關機制。有研究[12]揭示在卵巢癌細胞中miR-424-5p能直接靶向抑制KIF23的表達,從而抑制卵巢癌細胞增殖和遷移。此外,KIF23還作為膠質瘤患者的獨立預后生物標志物。Sun等[14]研究發(fā)現,KIF23過度表達會促進腦膠質瘤的發(fā)展,減少KIF23的表達會抑制腦膠質瘤細胞的增殖。KIF23還被證實在晚期肺癌和原發(fā)性肺癌的極大部分轉移性淋巴結中過度表達,因此抑制KIF23表達能夠有效抑制肺癌細胞生長[11]。但KIF23在肝癌進展中的生物學功能研究較少,目前僅有Sun等[6]首次揭示了肝細胞癌中KIF23的表達及其表達與臨床特征的相關性。在本研究中我們通過生信分析預測KIF23與miR-424-5p存在靶向關系,雙螢光素酶實驗進一步驗證了miR-424-5p與KIF2的靶向結合關系。通過細胞生物學實驗,我們發(fā)現KIF23在肝癌細胞中表達上調,并且過表達KIF23后,肝癌細胞的增殖和遷移能力增強,導致細胞周期阻滯在S期,當同時過表達miR-424-5p和KIF23后能削弱過KIF23對肝癌細胞增殖和遷移,細胞周期進阻滯在G0/G1期。因此,在肝癌細胞中miR-424-5p能夠靶向下調KIF23的表達,抑制肝癌細胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述,本研究證明了在肝癌中miR-424-5p靶向KIF23調控細胞周期,抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力,這個結論可為探索肝癌靶向治療途徑提供新的方向。