謝艷,張榮臻,張葵東,呂興菊,張和,肖鵬,李仁輝,程耀,耿若真

(1.溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 溫州 325035;2.溫州市珊溪水利樞紐管理中心,浙江 溫州 325000;3.大理州洱海湖泊研究院,云南 大理 671000)

藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)是認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)藍(lán)藻生物多樣性的重要方法,對(duì)于了解自然生物群落中藍(lán)藻種群的功能非常重要.作為地球上最古老的生物類(lèi)群之一,藍(lán)藻具有漫長(zhǎng)且復(fù)雜的進(jìn)化歷史,部分藍(lán)藻化石的形態(tài)與現(xiàn)在的物種非常相似,是一類(lèi)非常具有挑戰(zhàn)性的分類(lèi)群體[1-2].在藍(lán)藻的原核特性被發(fā)現(xiàn)之前,由于藍(lán)藻形態(tài)多樣,傳統(tǒng)的藍(lán)藻分類(lèi)系統(tǒng)主要以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ),遵循植物學(xué)命名法則進(jìn)行命名和描述[3].隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及系統(tǒng)發(fā)育分析的出現(xiàn),利用分子手段解決藍(lán)藻的分類(lèi)學(xué)問(wèn)題已被越來(lái)越多的分類(lèi)學(xué)家所接受,藍(lán)藻的整個(gè)分類(lèi)階層(目、科、屬、種)經(jīng)歷了廣泛的重組和修訂[4-5].在這個(gè)過(guò)程中,基于形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和生態(tài)學(xué)等特征相結(jié)合的多相分析方法,逐漸成為研究藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)的最佳方法[6-8].藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)研究中多相方法的應(yīng)用導(dǎo)致大量屬種的修訂和新屬種的建立,為解決系統(tǒng)發(fā)育的單系分類(lèi)問(wèn)題提供了方法[5,9].

澤鞘絲藻屬(Limnoraphis)隸屬于顫藻目(Oscillatoriales),Sirenicapillariaceae,是一種能形成水華的浮游性絲狀藍(lán)藻,于2013年由KOMREK等人從鞘絲藻屬(Lyngbya)分離出來(lái)而成立為新屬,模式種為希羅澤鞘絲藻(Limnoraphishieronymusii)[10].該屬在形態(tài)學(xué)上與鞘絲藻類(lèi)(Lyngbya-like)藍(lán)藻相似,均為絲狀,不分枝;藻絲單列,具鞘,橫壁處不收縊或稍收縊,細(xì)胞圓盤(pán)狀;無(wú)異細(xì)胞和厚壁孢子.其中,澤鞘絲藻屬的種類(lèi)因能夠在細(xì)胞中形成氣囊從而在水體中自由漂浮,這是區(qū)分澤鞘絲藻屬和不含氣囊而非浮游性的鞘絲藻屬(Lyngbya)最主要的形態(tài)學(xué)特征.目前澤鞘絲藻屬中的4個(gè)物種均為淡水種類(lèi),在生態(tài)學(xué)上也能與海洋習(xí)性的鞘絲藻屬區(qū)分開(kāi)來(lái).此外,二者的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也相距較遠(yuǎn),擁有獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)育位置,彼此之間的16S rRNA基因相似度也低于細(xì)菌學(xué)和現(xiàn)代藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)中屬的界限[11-13].因此,KOMREK等將包含模式種在內(nèi)的4個(gè)原來(lái)歸屬于鞘絲藻屬的種類(lèi)(LyngbyahieronymusiiLemmermann 1905、LyngbyabirgeiG.M.Smith 1916、LyngbyacryptovaginataSchkorbatov 1923以及Lyngbyahieronymusiif.robustaParukutty 1940)從鞘絲藻屬中分離并成立了新型浮游性藍(lán)藻屬——澤鞘絲藻屬.

在本研究中,從中國(guó)云南省大理市的洱海北部湖灣采集并分離出一株浮游絲狀藍(lán)藻藻株,在形態(tài)學(xué)上與鞘絲藻屬相似,基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)分離的藻株與澤鞘絲藻屬的藻種聚為緊密的一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化分支,并顯示出最高的序列相似度(>99.84%).進(jìn)一步通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和比較,確定該藻株為澤鞘絲藻屬的模式物種希羅澤鞘絲藻.這也是我國(guó)對(duì)澤鞘絲藻屬的新記錄屬的報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、藻種分離及培養(yǎng)

2007年7月,使用25#浮游生物網(wǎng)在云南省大理市洱海北部湖灣表層水體的0.5 m處呈“∞”字形緩慢拖動(dòng)采集浮游植物.首先對(duì)聚集的群落進(jìn)行簡(jiǎn)單解聚和分散,待群落里面的藻體或者藻絲分散開(kāi)來(lái)以后使用毛細(xì)管分離藻種,即在40倍的倒置顯微鏡(Olympus CKX31,Japan)下用巴斯德吸管制作成的毛細(xì)管挑取單根藻絲或單個(gè)細(xì)胞,在干凈的無(wú)菌培養(yǎng)基中清洗數(shù)次后轉(zhuǎn)入含有無(wú)菌CT培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng).一定時(shí)間后,將鏡檢為單種藍(lán)藻的孔中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有10 mL無(wú)菌CT培養(yǎng)基的螺口管中,放置在培養(yǎng)條件為溫度25 ℃,光暗周期12 L:12 D,光照強(qiáng)度2 000 lx的培養(yǎng)箱中保存,每隔1～2月進(jìn)行藻種轉(zhuǎn)接.

1.2 藻株的形態(tài)觀察及形態(tài)特征計(jì)量

光學(xué)顯微鏡觀察:藻株生長(zhǎng)至一定生物量時(shí),無(wú)菌操作取1 mL藻液,適當(dāng)稀釋后用移液槍吸取適量藻液置于載玻片上,于Nikon eclipse 80i(Nikon,Japan)光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察,顯微鏡配備DS-Ri1用于顯微照片的拍攝,NIS-Elements 3.2 D用于形態(tài)特征的測(cè)量(Nikon,Japan).對(duì)不同藻株的每個(gè)形態(tài)特征(如藻絲和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)與寬等)均進(jìn)行100次以上的測(cè)量.

1.3 DNA的提取,PCR擴(kuò)增,克隆及測(cè)序

分離得到的藻株采用改良后的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取藻株DNA.將16S rRNA作為 PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)基因和序列測(cè)定,擴(kuò)增引物為PA(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)[14]和B23S(5′-CTTCGCCTCTGTGTGCCT AGG T-3′)[15].PCR擴(kuò)增體系為20 μL體系:由1 μL基因組DNA(100 ng/μL),0.5 μL每個(gè)引物(10 μmol/L),8 μL無(wú)菌水和10 μL 2×PCR TSINGKE Taq聚合酶(Beijing Tsingke Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)組成.擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物通過(guò)質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠電泳分析,切取的目的條帶使用TSINGKE DNA凝膠提取試劑盒(Beijing Tsingke Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)進(jìn)行純化回收,然后取5 μL純化產(chǎn)物在pMD18-T載體(TaKaRa,TaKaRa BioInc.,Otsu,Japan)進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α(TransGen Biotechnology,China)細(xì)胞中輕輕混勻,冰浴30 min后42 ℃熱擊30 s,冰上放置5 min后,在超凈臺(tái)中加入無(wú)氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基200 μL,于37 ℃轉(zhuǎn)速設(shè)置為190 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)45 min后,取70 μL菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)12 h.挑取單克隆子菌落加入800 μL LB液體培養(yǎng),37 ℃,190 r/min振蕩培養(yǎng)4～5 h后對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè),提取陽(yáng)性克隆子重組質(zhì)粒進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts USA).每個(gè)目標(biāo)片段至少獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆序列.

1.4 序列比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序獲得的序列首先在NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,檢測(cè)序列是否正確擴(kuò)增.目的序列與從NCBI網(wǎng)站上下載的相關(guān)序列利用BioEdit version 7.2.5.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析,手工檢查并校正,校正后的序列用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和貝葉斯推理法(Bayesian Inference,BI),其中最大似然法基于GTR+I+G核酸替代模型,使用PhyML 3.0[16]軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),步展值設(shè)為10 000.貝葉斯推理法使用軟件MrBayes v3.2.6[17]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),共運(yùn)行160萬(wàn)代,每100代采樣一次,舍棄前25%樣本樹(shù).軟件Fig Tree version 1.4.3(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可視化編輯.

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

澤鞘絲藻屬(Sirenicapillariaceae,Oscillatoriales)

希羅澤鞘絲藻(圖1)

Limnoraphishieronymusii(Lemmermann)J.Komárek,E.Zapomelová,J.Smarda,J.Kopecky,E.Rejmánková,J.Woodhouse,B.A.Neilan &J.Komárková,2013

生境:在淡水水體中自由漂浮.

分布:云南省大理市洱海.

標(biāo)本號(hào):WZUH-ZLYN200701.

參考藻株:CHAB 3367.

絲狀體單生或以小的聚集體生長(zhǎng),不分枝,直或稍彎曲,自由漂浮,具明顯鞘.鞘堅(jiān)固,無(wú)色,透明,薄或稍加寬,在末端開(kāi)放.藻絲單列,圓柱形,藍(lán)綠色到棕綠色,衰老時(shí)變黃,在橫壁處不收縊或稍收縊,向端部不漸狹.藻絲中部寬12～14 μm,頂端細(xì)胞圓形.細(xì)胞短柱形或盤(pán)狀,長(zhǎng)1.00～1.84～3.54 μm,寬8.75～10.60～12.90 μm,長(zhǎng)短于寬,含顆粒狀內(nèi)容物,具有氣囊,細(xì)胞壁無(wú)色.無(wú)異形胞和厚壁孢子.通過(guò)藻殖段進(jìn)行繁殖.

從形態(tài)學(xué)特征來(lái)看,分離的藻株CHAB 3367為絲狀,不分枝,具鞘等特點(diǎn)與鞘絲藻相似,但因該種類(lèi)具有氣囊,能在水體中自由漂浮,因此屬于從鞘絲藻中分出來(lái)的一類(lèi)具有兼性氣囊的澤鞘絲藻類(lèi)群.從細(xì)胞大小來(lái)看,CHAB 3367絲狀體和藻絲的寬度都比KOMREK等人于2013年描述的希羅澤鞘絲藻略窄,除此之外與該物種具有非常相似的形態(tài)學(xué)特征,因此,我們從洱海分離的藻株CHAB 3367為中國(guó)新記錄屬澤鞘絲藻屬的模式新記錄種,即希羅澤鞘絲藻(Limnoraphishieronymusii).

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

通過(guò)一代測(cè)序我們獲得了CHAB 3367藻株的16S rRNA基因序列(1 463 bp),其與澤鞘絲藻屬藻株16S rRNA的序列相似度為99.84%～99.92%(表1),高于細(xì)菌學(xué)中物種劃分的界線(xiàn).基于ML和BI方法,本研究以黏菌藻目的藻株(GloeobacterviolaceusPCC 7421)為外類(lèi)群,使用顫藻科和Sirenicapillariaceae下的68條序列來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).從圖2可知,CHAB 3367跟澤鞘絲藻屬的序列聚為一個(gè)緊密的系統(tǒng)進(jìn)化分支(clade A),ML步展值和貝葉斯后驗(yàn)概率分別為100%和0.998,與Sirenicapillariaceae中其他的6個(gè)屬分離(clade B～clade G),很大程度上表明分離的藻株CHAB 3367歸屬于澤鞘絲藻屬(圖2).

表1 CHAB 3367與澤鞘絲藻屬藻株16S rRNA基因序列相似度比較

3 討 論

隨著大量DNA序列的出現(xiàn)和分子生物學(xué)的發(fā)展,藍(lán)藻的分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)經(jīng)歷了幾番變化,多相特征方法在藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)中的大量應(yīng)用導(dǎo)致許多新屬和新種的出現(xiàn),并使藍(lán)藻屬向狹義單系的“小屬”方向推進(jìn)[5,9,18].在過(guò)去幾十年里,顫藻目中具有大型盤(pán)狀細(xì)胞的無(wú)異形胞分化的絲狀藍(lán)藻已被廣泛報(bào)道[18].其中,鞘絲藻類(lèi)藍(lán)藻是一類(lèi)廣泛存在于多種生境中的無(wú)異形胞分化的絲狀藍(lán)藻.根據(jù)國(guó)際權(quán)威藻類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)Algaebase統(tǒng)計(jì),目前已有952個(gè)淡水/海洋鞘絲藻屬的種類(lèi)被記錄描述,只有218個(gè)物種被現(xiàn)代分類(lèi)系統(tǒng)有效接受.眾多的分子生物學(xué)證據(jù)表明鞘絲藻屬是一個(gè)高度多系屬,系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上由幾個(gè)不同的進(jìn)化分支組成,一些與模式物種相距較遠(yuǎn)的類(lèi)群如Moorea、澤鞘絲藻屬(Limnoraphis)、Okeania和微線(xiàn)藻屬(Microseira),都是近年來(lái)從該屬中分離出來(lái)而成立的新屬[10,20-22].鑒于鞘絲藻屬的模式物種為海洋種類(lèi),預(yù)計(jì)這一擁有眾多物種的絲狀藍(lán)藻屬將在未來(lái)得到更多的修訂和關(guān)注.

澤鞘絲藻屬因其具有氣囊而浮游的特性,區(qū)別于傳統(tǒng)的附著類(lèi)的鞘絲藻類(lèi),是一類(lèi)可以形成水華的無(wú)異形胞分化的絲狀藍(lán)藻[10].澤鞘絲藻屬最初被描述為L(zhǎng)yngbyahieronymusii[23],2013年,KOMREK等[10]基于形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的差異,將具有氣囊能漂浮生長(zhǎng)的4個(gè)鞘絲藻物種Lyngbyahieronymusii、Lyngbyabirgei、Lyngbyacryptovaginata以及Lyngbyahieronymusiif.robusta從鞘絲藻屬中分離出來(lái)成立為新屬,即澤鞘絲藻屬,并在次年提出的8目系統(tǒng)中的顫藻目顫藻科中占據(jù)一席之地,該屬也是當(dāng)時(shí)顫藻科下唯一一個(gè)細(xì)胞具氣囊能形成水華的絲狀藍(lán)藻屬[5,10].2022年,BERTHOLD等[24]基于16S rRNA基因序列及p-距離的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,具有高支持度的7個(gè)絲狀藍(lán)藻屬,即Sirenicapillaria、Tigrinifilum、Affixifilum、Capilliphycus、Limnoraphis、Limnospira和Neolyngbya在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一個(gè)大的緊密的單系系統(tǒng)進(jìn)化支,因而將該分支重新定義為一個(gè)藍(lán)藻新科Sirenicapillariaceae.至此,澤鞘絲藻屬的分類(lèi)地位較為明確地確定下來(lái).

由于澤鞘絲藻屬物種間基因型的高度相似性,該屬內(nèi)的種類(lèi)主要依據(jù)形態(tài)特征作為進(jìn)一步的分類(lèi)依據(jù).當(dāng)前澤鞘絲藻屬中包括4個(gè)物種,基于絲狀體和藻絲寬度,這4個(gè)種類(lèi)由寬到窄依次為L(zhǎng).birgei、L.robusta、L.hieronymusii及L.cryptovaginata[10].本研究中從洱海分離得到的藻株具有與澤鞘絲藻屬相似的形態(tài)學(xué)特征,其中該藻株的絲狀體寬12～14 μm,藻絲寬8.75～10.60～12.90 μm,與KOMREK等[10]2013年描述的L.hieronymusii相比略小一些(絲狀體寬12～16 μm;藻絲寬11～14 μm),這可能是由于不同水體分離的藻株具有一定的生態(tài)表型差異.由于分離的藻種仍處于該種類(lèi)的形態(tài)特征的大致范圍內(nèi),我們?nèi)詫HAB 3367定種為澤鞘絲藻屬的模式物種,即L.hieronymusiiCHAB 3367.從16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看,CHAB 3367和包括模式種在內(nèi)的澤鞘絲藻屬的序列聚為一個(gè)緊密的進(jìn)化分支(圖2 clade A),擁有極高的ML步展值和BI后驗(yàn)概率(100/0.998).根據(jù)p-距離計(jì)算的16S rRNA基因相似度可知,CHAB 3367與該屬所有序列的相似度>99.84%(表1),遠(yuǎn)高于細(xì)菌學(xué)與藍(lán)藻分類(lèi)學(xué)中物種的分界線(xiàn)[10-12],進(jìn)一步證實(shí)了形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果.

此外,澤鞘絲藻屬在世界范圍分布廣泛,目前已知的有歐洲的德國(guó)[25]、捷克[26]、烏克蘭[27],中東的土耳其[28]、以色列[29],亞洲的薩哈(雅庫(kù)特)共和國(guó)[30]及塔吉克斯坦[31]等.本研究則是澤鞘絲藻屬在中國(guó)(洱海)的首次報(bào)道,也顯示出我國(guó)無(wú)異形胞絲狀藍(lán)藻的物種多樣性.同時(shí),澤鞘絲藻屬作為一種能產(chǎn)生水華的絲狀藍(lán)藻,與浮絲藻(Planktothrix)/擬浮絲藻(Planktothricoides)[32],氣絲藻(Aerosakkonema)[33]等無(wú)異形胞分化的顫藻目藍(lán)藻相似,其形成的藍(lán)藻水華的危害及生理生態(tài)學(xué)的研究仍需要更多的藻株來(lái)證實(shí).未來(lái)我們期待更多具有氣囊能形成藍(lán)藻水華的無(wú)異形胞的絲狀藍(lán)藻被發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定,利用更加先進(jìn)的宏基因組和高通量測(cè)序技術(shù)等探索不同氣候、不同生境(湖泊、河流、溫泉等)下的藍(lán)藻多樣性和豐富度信息.