朱晶惠,魏棟敏,任淑婷,楊彥玲,趙琳
脊髓損傷是脊柱損傷中最嚴(yán)重的并發(fā)癥,常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能障礙以及大小便等自主神經(jīng)功能障礙,傷后難以治愈,致殘率高。脊髓損傷后繼發(fā)性損傷會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。損傷后核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是一類免疫細(xì)胞激活后介導(dǎo)胱天蛋白酶1(caspase-1)活化的蛋白質(zhì)復(fù)合物[1],NLRP3 炎性小體活化可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴形成,產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),加重機(jī)體損害程度。靶向抑制脊髓損傷后NLRP3炎性小體激活,減輕脊髓損傷后機(jī)體的炎癥反應(yīng)、減少并發(fā)癥,是臨床治療脊髓損傷的有效方法。本文闡述了NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)和激活途徑,就脊髓損傷后靶向抑制NLRP3炎性小體激活的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
NLRP3 是一類胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物,由NOD 樣受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a card domain,ASC)銜接蛋白及pro-caspase-1 效應(yīng)蛋白3部分組成[2]。NLRP3炎性小體C端富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats,LRR);中間有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD),又稱NACHT 結(jié)構(gòu)域;N 端是吡啶域(pyrin domain,PYD)和半胱天冬蛋白酶募集域(caspase recruitment domain,CARD)。ASC 銜接蛋白同時(shí)具有1 個(gè)CARD 結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)PYD結(jié)構(gòu)域。pro-caspase-1效應(yīng)蛋白只含有1個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域。在機(jī)體損傷時(shí),PRRs 能快速識(shí)別損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)和病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),受體蛋白可被激活,通過(guò)PYD 介導(dǎo)下游信號(hào),利用ASC 和procaspase-1 的CARD 域相互作用,形成NLRP3 炎性小體復(fù)合物[3]。
NLRP3炎性小體的激活需要2條信號(hào)通路的參與。第1條是啟動(dòng)信號(hào)通路:細(xì)胞膜表面Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)能夠識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)分子DAMPs和PAMPs,進(jìn)而激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路[4],在炎性小體前體轉(zhuǎn)錄水平增加其表達(dá)量。第2條是激活信號(hào)通路:NLRP3炎性小體充當(dāng)感受器感受機(jī)體損傷釋放的DAMPs 和病原體釋放的PAMPs 的刺激,但是NLRP3 并非直接與所有激活劑相互作用,而是接受這些激活劑所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[5]。其激活的信號(hào)通路途徑見(jiàn)圖1?,F(xiàn)階段研究證明,NLRP3 激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)主要包括活性氧(ROS)生成、線粒體功能障礙、離子流失穩(wěn)及溶酶體損傷破裂[6]。
Fig.1 Signaling pathways activated by NLRP3 inflammasome圖1 NLRP3炎性小體激活的信號(hào)通路
脊髓損傷后NLRP3炎性小體上調(diào)參與炎癥反應(yīng),白細(xì)胞介素(IL)-18、IL-1β 等炎性因子表達(dá)量增加,并介導(dǎo)了細(xì)胞焦亡[7]。而這些促炎因子與焦亡后釋放的內(nèi)容物均可以作為促炎信號(hào)引發(fā)更大的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生有害物質(zhì),不利于機(jī)體恢復(fù)。
季英楠等[8]進(jìn)行了大鼠脊髓損傷后NLRP3 炎性小體表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)功能影響的研究,用白細(xì)胞三烯受體抑制劑減少NLRP3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠在組織學(xué)和行為學(xué)上較對(duì)照組損傷明顯減輕。Li 等[9]也證實(shí)抑制NLRP3 活化可以減輕微環(huán)境炎癥反應(yīng),促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型極化,改善小鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。因此靶向抑制NLRP3 的激活可以減輕脊髓損傷后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),減少神經(jīng)細(xì)胞損傷,促進(jìn)機(jī)體損傷后感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
NF-κB是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,許多促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的啟動(dòng)子區(qū)域均有其結(jié)合位點(diǎn),因而NF-κB信號(hào)通路是啟動(dòng)NLRP3 炎性小體活化最主要的通路。Zhao等[10]研究表明芍藥醇可通過(guò)抑制Toll 樣受體/髓樣分化因子88/核因子-κB(Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor-κB,TLR4/MyD88/NF-κB)信號(hào)通路減少大鼠脊髓損傷中NLRP3炎性小體的活化和細(xì)胞焦亡。Liu等[11]研究也證實(shí)山奈酚可以抑制絲裂原活化蛋白激酶/NFκB(mitogen activated protein kinases/NF-κB,MAPKs/NF-κB)信號(hào)通路,減輕大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。Guo等[12]研究提示腺苷酸蛋白活化激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是NF-κB和NLRP3炎性小體信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子,該因子的活化可抑制NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路的激活。紫雛菊苷[13]、雷公藤紅素[14]和長(zhǎng)托寧[15]等中藥提取物均可以通過(guò)對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的抑制,減少NLRP3 炎性小體的表達(dá)以及促炎因子前體的轉(zhuǎn)錄與成熟,進(jìn)而抑制NLRP3組裝和激活,減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善。然而NF-κB信號(hào)通路激活具有免疫耐受現(xiàn)象,其信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子功能喪失或調(diào)控關(guān)鍵效應(yīng)的基因突變?cè)鰪?qiáng)均可加重脊髓損傷后的炎癥效應(yīng)。因此,研發(fā)針對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制劑至關(guān)重要。
3.2.1 ROS生成和線粒體功能障礙
ROS 主要來(lái)源于線粒體釋放的線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS),此外,損傷后大量腺苷三磷酸(ATP)的釋放也可以誘導(dǎo)ROS生成,從而激活NLRP3 炎性小體[16]?;A(chǔ)研究中雖已明確ROS 是激活NLRP3 炎性小體的因素之一,但其介導(dǎo)的激活機(jī)制并不明了。Qayyum 等[17]研究表明,mtROS 介導(dǎo)的NLRP3 炎性小體激活可能是由硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)和硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的結(jié)合作用下誘導(dǎo)的,在正常情況下TPX 與TXNIP 緊密結(jié)合,而損傷后ROS的高表達(dá)導(dǎo)致TRX與TXNIP解離,隨后解離的TXNIP與NLRP3 炎性小體結(jié)合并被激活。線粒體損傷釋放mtROS 的同時(shí),也釋放線粒體DNA到細(xì)胞基質(zhì)中,氧化的線粒體DNA可與黑色素瘤缺乏因子2 相互作用并激活NLRP3 炎性小體[16]。
因此,抑制ROS 生成或維護(hù)線粒體穩(wěn)態(tài)減少其損傷,可減少NLRP3 炎性小體的激活。如N-乙酰-L-半胱氨酸以及白藜蘆醇[18]、阿魏酸鈉[19]、木犀草素[20]等具有抗氧化的藥物均可在脊髓損傷中抑制ROS 生成,減少NLRP3 炎性小體激活,從而減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Lin 等[21]采用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞制備了NLRP3 炎性小體的激活模型,再用亞甲藍(lán)抑制ROS后,NLRP3 炎性小體的表達(dá)量顯著降低,提示ROS 是NLRP3的上游信號(hào)通路。使用ROS 特異性抑制劑或可從源頭減輕NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而Mohamed等[22]研究發(fā)現(xiàn),即便是在TXNIP缺陷的情況下,IL-1β的成熟與caspase-1的活化并未被完全抑制,這表明可能存在其他激活機(jī)制。
3.2.2 離子流失穩(wěn)
離子流失穩(wěn)包括K+外流、Ca2+動(dòng)員和Na+內(nèi)流,這些生物事件已被確定與NLRP3 炎性小體激活有關(guān)。P2X7 受體(P2X7 receptor,P2X7R)是嘌呤能離子型P2X 受體家族的成員之一,是非選擇性ATP門控陽(yáng)離子通道受體。機(jī)體損傷后細(xì)胞釋放ATP 與P2X7 相互作用,離子通道被打開(kāi)[23]。K+外流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+濃度降低,誘導(dǎo)NIMA 相關(guān)激酶7 與NLRP3的LRR 結(jié)構(gòu)域作用,觸發(fā)NLRP3 炎性小體組裝激活[24]。離子通道打開(kāi)后細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)三磷酸肌醇受體和斯里蘭卡肉桂堿受體通道將Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中[25]。另一方面,溶酶體破裂導(dǎo)致細(xì)胞器膜破裂,細(xì)胞器中的Ca2+釋放也是細(xì)胞質(zhì)中Ca2+增多的一個(gè)重要途徑[26]。細(xì)胞質(zhì)中高濃度的Ca2+促使ASC 寡聚和pro-caspase-1 組裝以激活NLRP3炎性小體,其激活機(jī)制可能是Ca2+通過(guò)瞬時(shí)感受器電位M2 通道滲透作為ROS 內(nèi)源性傳感器而激活NLRP3 炎性小體[25]。Na+內(nèi)流激活NLRP3炎性小體具有K+依賴性,其機(jī)制可能是單鈉尿酸鹽晶體刺激增加了Na+負(fù)荷和細(xì)胞腫脹,然后通過(guò)水內(nèi)流被動(dòng)平衡細(xì)胞,使K+降低到閾值以下,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活。
Kong 等[27]研究證實(shí)酮代謝物β-羥基丁酸(βhydroxybutyric acid,BHB)可以通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體改善大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng),BHB是直接通過(guò)阻滯K+外流和ASC 寡聚來(lái)減少NLRP3 炎性小體的激活。尼莫地平是一種典型的Ca2+通道阻滯劑,具有擴(kuò)張脊髓血管的作用,可減少Ca2+內(nèi)流,減輕炎癥程度,減少細(xì)胞焦亡[28]。TWIK相關(guān)的K+通道1(TWIK-Related K+Channel 1,TREK-1)是雙孔鉀離子通道成員之一,該通道開(kāi)放可以介導(dǎo)細(xì)胞超極化,抑制Ca2+通道激活、減少Ca2+內(nèi)流。Fang 等[29]研究證實(shí)缺乏TREK-1 會(huì)使局部炎癥擴(kuò)大,而TREK-1激動(dòng)劑花生四烯酸和亞麻酸可以抑制炎癥反應(yīng),改善脊髓損傷小鼠運(yùn)動(dòng)功能。木犀草素同樣也具有阻滯Ca2+內(nèi)流、抑制NLRP3小體激活的作用[30]。利魯唑是一種用于治療肌萎縮側(cè)索硬化癥的鈉離子阻滯劑。Wu 等[31]研究證實(shí)利魯唑可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型極化,減少炎癥反應(yīng),抑制NLRP3 炎性小體的激活。離子流在NLRP3 的激活機(jī)制中具有重要作用,深入了解離子通量與NLRP3 炎性小體之間的分子聯(lián)系為研究脊髓損傷后靶向抑制NLRP3激活提供了新思路。
3.2.3 溶酶體破裂
Abuammar 等[26]研究發(fā)現(xiàn)一些晶體顆粒物,如膽固醇晶體、鈣晶體、二氧化硅晶體等可通過(guò)吞噬作用誘導(dǎo)溶酶體腫脹破裂,致使NLRP3炎性小體被激活。其機(jī)制可能是溶酶體破裂釋放的組織蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)可作為DAMPs被PRRs 識(shí)別,進(jìn)而引發(fā)NLRP3炎性小體的組裝激活[32]。脊髓損傷后,胞質(zhì)磷脂酶A2(cytoplasmic phospholipaseA2,cPLA2)被激活,導(dǎo)致溶酶體膜破裂釋放CTSB,參與NLRP3炎性小體的激活。Li 等[33]采用cPLA2 的抑制劑花生四烯酰三氟甲基酮抑制cPLA2 激活,減少溶酶體損傷破裂,恢復(fù)自噬通量,抑制炎癥反應(yīng),進(jìn)而減少大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞損傷。CA-074-Me 是一種有效的CTSB 抑制劑,可抑制caspase-1 活化,減少NLRP3 炎性小體的活化[34]。也有研究證明阿魏酸鈉可以調(diào)節(jié)溶酶體功能,減少NLRP3炎性小體激活,改善大鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能[19]。因此,減少CTSB的釋放進(jìn)而抑制NLRP3 炎性小體激活可成為治療脊髓損傷的重要靶點(diǎn)。
OLT1177是一類活性β-磺酰腈化合物,可直接靶向抑制NLRP3 炎性小體NOD 上的ATP 酶結(jié)合位點(diǎn),抑制NLRP3 炎性小體活化[35]。過(guò)表達(dá)miR-423-5p[36]和miR-451[37]可直接在轉(zhuǎn)錄水平抑制NLRP3 mRNA的表達(dá)水平,減輕大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。MCC950 是一種針對(duì)NLRP3 炎性小體成分蛋白的特異性抑制劑,在脊髓損傷模型中MCC950可以有效阻斷NLRP3誘導(dǎo)的ASC寡聚來(lái)抑制NLRP3炎性小體的激活,但它不能通過(guò)直接阻斷NLRP3 寡聚或NLRP3-ASC 相互作用來(lái)阻止炎癥小體的形成[38]。Jiang等[39]對(duì)脊髓損傷小鼠的研究表明,BAY 11-7082 和A438079 也可直接靶向抑制NLRP3炎性小體激活,改善炎癥,減輕脊髓損傷。
隨著對(duì)NLRP3炎性小體激活機(jī)制研究的深入,在脊髓損傷中靶向抑制NLRP3 激活機(jī)制的研究也越來(lái)越多。一些基礎(chǔ)和臨床研究均證實(shí)NLRP3 在脊髓損傷后繼發(fā)性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中至關(guān)重要。因而,以抑制NLRP3炎性小體為靶點(diǎn)或許可成為治療脊髓損傷的新方法。雖然一些藥物可以抑制NLRP3 的激活,或可通過(guò)阻斷其信號(hào)通路減少轉(zhuǎn)錄表達(dá),改善炎癥,促進(jìn)脊髓損傷后感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),但尚需更多的研究來(lái)驗(yàn)證。脊髓損傷中,NLRP3炎性小體的未知激活機(jī)制及信號(hào)通路之間的交聯(lián)反應(yīng)、NLRP3炎性小體及相關(guān)分子如何介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、如何實(shí)現(xiàn)臨床治療的轉(zhuǎn)化,依然需要更深入的探索。