王曉磊 姜彤彤 張潔 劉美學 劉云國 隋智海

摘 要：為探究臨沂市某草魚養(yǎng)殖場發(fā)生病害的原因，從患病的草魚（ Ctenopharyngodon idellus ）肝臟和腎臟混合組織中分離得到一株優(yōu)勢致病菌G-13，通過細菌形態(tài)學觀察、革蘭氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因測序，以及系統(tǒng)發(fā)育分析等完成菌株鑒定，并測定其耐藥特性。形態(tài)特征顯示G-13是一種短桿狀的革蘭氏陰性菌，在LB固體平板上形成乳白色、圓形、整體呈隆起狀、邊緣較為整齊、表面光滑濕潤的菌落；16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化分析發(fā)現(xiàn)G-13與熒光假單胞菌（ Pseudomonas fluorescens ）聚在一支，序列同源性高達100%；生理生化試驗顯示葡萄糖、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、氧化酶、無鹽和3% NaCl胰胨水等7項指標為陽性，與假單胞菌屬特征相近，確定分離株G-13為 P. fluorescens 。藥敏試驗結果顯示菌株G-13對丁胺卡那、多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等13種抗生素敏感，對氨芐西林、頭孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮等7種抗生素耐藥。

關鍵詞：草魚（Ctenopharyngodon idellus）；熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）；生理生化；16S rRNA；藥敏實驗

草魚（ Ctenopharyngodon idellus ）是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，被譽為“中國四大家魚”， 其產(chǎn)量在2020 年高達557.11 萬噸[1]。因其肉質蛋白質含量高，脂肪含量低，廣受消費者青睞，具有較高的經(jīng)濟價值[2]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大和集約化程度提高，草魚在養(yǎng)殖過程中容易受到氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬等細菌感染，影響了其生長發(fā)育，可引發(fā)大面積死亡，阻礙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3]。

熒光假單胞菌（ Pseudomonas fluorescens ）屬于假單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界如土壤、水、食物和空氣中[4]。 P. fluorescens 是魚類養(yǎng)殖中常見的病原菌，可感染鱘、半滑舌鰨、虹鱒等，引起赤皮病、敗血癥等病癥，造成經(jīng)濟損失[5-7]。隨著抗生素及其他藥物不合理使用， P. fluorescens 產(chǎn)生了對青霉素、頭孢他定、紅霉素等抗生素的耐受性，給治療帶來困難和挑戰(zhàn)[8-10]。

2021年5月山東省臨沂市河東區(qū)某草魚養(yǎng)殖場暴發(fā)疾病，出現(xiàn)游動緩慢，食欲減退，鱗片脫落伴隨皮膚潰爛，臀鰭基部充血，肛門紅腫，腹腔充血，肝臟腫大。為確定本次草魚病害的病原菌，本研究從瀕臨死亡的草魚肝腎混合組織中分離純化細菌，通過分離純化細菌、形態(tài)特征觀察、革蘭氏染色、生理生化特性分析、16S rRNA序列分析以及構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析等方法鑒定細菌種類，利用紙片擴散法分析其耐藥性，可為草魚養(yǎng)殖業(yè)有效防控提供有力的科學參考和治理方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉（北京拜爾迪生物技術有限公司）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；瓊脂糖、DNA分子量標準 Marker （100～2 000 bp，生工生物工程（上海）股份有限公司）；50×TAE、6×DNA上樣緩沖液（寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司）；2×Taq PCR MasterMix、細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）（天根生化科技（北京）有限公司）；革蘭氏染色液試劑盒（HB8278）、生理生化鑒定管（青島海博生物有限公司）；藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.1.2 主要設備 生物安全柜BSC-1304IIA（蘇州安泰空氣技術有限公司）、低速研磨器（天根生物有限公司）、臺式離心機Pico-21（Thermo Fisher）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)FR-1000（上海復日科技有限公司）、PCR儀ETC 811（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、恒溫搖床QYC-200（上海?，攲嶒炘O備有限公司）、培養(yǎng)箱DMJM-358（寧波江南儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)勢菌株分離純化 75%乙醇擦拭體表，無菌解剖魚體，挑取部分肝臟和腎臟于100 μL PBS中并研磨，10倍稀釋后涂布在LB固體平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小等特征進行分類，選取優(yōu)勢菌株在LB固體平板上劃線純化2次后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)16 h，加入終濃度為20%的甘油，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 細菌形態(tài)特征觀察 用無菌接種環(huán)從保菌管中蘸取菌液于LB固體平板劃線， 28 ℃過夜培養(yǎng)，觀測菌落形態(tài)特征。從平板上挑取單菌落于生理鹽水中制備成菌懸液，根據(jù)革蘭氏染色液試劑盒說明書，將細菌懸液涂布在載玻片上，經(jīng)結晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脫色、沙黃復染和自然干燥后，光學顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.2.3 生理生化特性鑒定 用無菌接種環(huán)從平板上挑取3個單菌落于無菌水中，調整成 0.5 麥氏濁度的菌懸液，滴加 50 μL菌懸液至生理生化鑒定管中，用封口膜密封，靜置培養(yǎng)24～48 h，觀察各生化鑒定管的現(xiàn)象并記錄。

1.2.4 16S rRNA擴增及其序列分析 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細菌基因組DNA作為擴增模板。利用16S rRNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCATGGCTCAG和1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增菌株16S rRNA序列，預期大小約為1 400 bp。PCR反應體系（50 μL）：基因組DNA 1 μL、2×Taq Master Mix 25 μL、27F（10 μmol/L）2.5 μL、1 492 R（10 μmol/L）2.5 μL、無菌水19 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃保溫10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并送到上海生工生物有限公司測序。

根據(jù)測序結果利用NCBI的BlastN在線比對分析該菌株的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列的相似性；在比對結果中挑選20個序列，運用MEGA X軟件，利用Bootstrap法，設置1 000次，構建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其進化地位。

1.2.5 耐藥特性測定 利用紙片擴散法進行藥敏試驗，28 ℃過夜培養(yǎng)細菌，按照1%轉接至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.8左右（濃度約為2.4×108 CFU/mL），將100 μL菌液均勻涂布在LB平板上，待菌液干燥后，貼上藥敏紙片，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，用游標卡尺測量抑菌圈大小，對照藥敏紙片說明書判斷該菌對抗生素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

從瀕死的草魚肝臟和腎臟混合組織中分離純化出一株優(yōu)勢菌，命名為G-13。該菌在LB固體平板上28 ℃培養(yǎng)24 h，形成乳白色、圓形、整體呈隆起狀、邊緣較為整齊、表面光滑濕潤的菌落（封三，圖1A）；經(jīng)革蘭氏染色后，細菌呈現(xiàn)短桿狀和紅色，這表明該菌是一種革蘭氏陰性菌（封三，圖1B）。

2.2 生理生化鑒定

經(jīng)過生理生化鑒定管試驗，其結果顯示：菌株G-13可分解葡萄糖，但不能發(fā)酵蔗糖、甘露糖、乳糖、甘露醇、纖維二糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖苷等；精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、氧化酶等4項試驗呈陽性；可在無鹽和3%NaCl胰胨水中生長；V-P試驗、尿素酶、明膠酶、6%～10% NaCl胰胨水、ONPG等試驗結果為陰性（見表1）。

2.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用基因組試劑盒提取G-13基因組DNA，并以其為模板，利用通用引物27F/1 492R擴增菌株16S rRNA基因序列。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：G-13基因組DNA條帶單一，比較完整；16S rRNA擴增條帶單一，無非特性擴增，條帶大小在1 000～2 000 bp之間，與預期結果相符合，陰性對照無條帶（封三，圖2）。

將該菌株的16S rRNA序列與GenBank中序列進行BlastN比對，發(fā)現(xiàn)該菌與熒光假單胞菌 P. fluorescens? S16 （GenBank序列號：DQ095904.1）的同源性最高，高達100%。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果發(fā)現(xiàn)G-13菌株與 P. fluorescens 聚在一支，由此確定該分離菌G-13為 P. fluorescens （封三，圖3）。

2.4 耐藥特性分析

對分離株G-13完成20種抗生素敏感性試驗，根據(jù)平均抑菌圈直徑與杭州微生物試劑有限公司的藥敏試驗標準判斷書對照，發(fā)現(xiàn)該菌株對7種抗生素（氨芐西林、頭孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮、羧芐西林、苯唑西林、麥迪霉素）表現(xiàn)出抗藥性；對12種抗生素（丁胺卡那、多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松、諾氟沙星、米諾環(huán)素、多粘菌素、哌拉西林）則表現(xiàn)敏感性（表2）。根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年2號，可考慮適當使用鹽酸多西環(huán)素粉（水產(chǎn)用）和硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）來進行防治。

3 討論與結論

草魚是我國產(chǎn)量較大的淡水魚類之一，但細菌性疾病也日益嚴重，制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[11]。其中， P. fluorescens 是危害淡水養(yǎng)殖業(yè)的最常見病原菌之一，屬于革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在自然界中，具有較強的適應能力，宿主范圍廣，可感染包括魚、蝦、植物甚至人類等引起相應的疾病[12-13]。目前為止，已從多種魚類包括鱖魚、錦鯉、羅非魚等分離出 P. fluorescens， 引起赤皮病、敗血癥、肝出血等臨床癥狀，造成經(jīng)濟損失[14-16]。本研究從患有皮膚潰爛病的草魚體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢革蘭氏陰性菌株G-13，經(jīng)過16S rRNA 基因克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育分析并結合其生理生化特性，鑒定此分離菌株為 P. fluorescens? G-13。利用形態(tài)學、生理生化特征與分子生物學方法相結合，可更加準確診斷暴發(fā)魚類疾病的病原菌，為其防治提供科學依據(jù)[17]。

目前針對魚類皮膚潰爛病、爛鰓病、出血癥等疾病的治療方法主要是抗菌藥物。但隨著抗菌藥物的不合理使用，會導致病原菌抗藥性和水體污染，給治療帶來困難，同時也威脅著人類健康[18]。通過分析 P. fluorescens? G-13對不同抗生素的敏感性，其結果顯示 P. fluorescens? G-13對丁胺卡那、多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素、環(huán)丙沙星等13種抗生素都有不同程度的敏感性，可根據(jù)水產(chǎn)用藥規(guī)定，選擇合適的敏感藥物如鹽酸多西環(huán)素粉（水產(chǎn)用）和硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）進行相應的治療；但也發(fā)現(xiàn)了其對氨芐西林、頭孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮等7種抗生素耐受，需要在用藥時規(guī)避多重耐藥的風險。

本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法結合分子生物學方法，對患病的草魚完成了病原菌的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)了一株熒光假單胞菌G-13，通過藥敏試驗確定了其對不同抗生素的敏感程度不同，可考慮使用敏感藥物防治，同時規(guī)避耐受抗生素的使用，該研究結果可為臨沂市草魚養(yǎng)殖過程中熒光假單胞菌的感染和防治提供理論基礎和科學依據(jù)。

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Abstract：In order to explore the causes of disease in a grass carp （ Ctenopharyngodon idellus ） farm in Linyi City， Shandong Province， a dominant pathogenic bacteria G-13 was isolated from the mixed tissues of liver and kidney of diseased grass carp. The strain was identified by bacterial morphological observation， gram staining， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA gene sequencing， and phylogenetic analysis， and its drug resistance characteristics were determined. The results showed that G-13 was a short rod-shaped gram-negative bacterium， which formed milky white， round， overall raised， neat edges， smooth and moist colonies on LB agar plates. 16S rRNA phylogenetic analysis showed that G-13 and? Pseudomonas fluorescens? were clustered together， and the sequence homology was as high as 100%. Physiological and biochemical tests showed that seven indexes including glucose， arginine dihydrolase， ornithine decarboxylase， lysine decarboxylase， oxidase， salt-free and 3% NaCl peptone water were positive， which were similar to the characteristics of the genus? Pseudomonas.? Then， the isolate G-13 was identified as? Pseudomonas fluorescens.? The results of antibiotic susceptibility test showed that strain G-13 was sensitive to 13 antibiotics such as bumicana， doxycycline， tetracycline， neomycin， ciprofloxacin and ofloxacin， and was resistant to 7 antibiotics such as ampicillin， cefaradine， clindamycin and furazolidone.

Key words：grass carp（ Ctenopharyngodon idellus）; Pseudomonas fluorescens;? physiology and biochemistry; 16S rRNA; antibiotic susceptibility test（收稿日期：2023-02-15）