車玄 鄭標(biāo) 成迪 謝遠(yuǎn)杰 曾昭明 莫中成

（1）桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣西糖尿病系統(tǒng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541199；2）南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，衡陽(yáng) 421001；3）湖南明舜制藥有限公司，邵東 422800；4）廣西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地（桂林醫(yī)學(xué)院&岳陽(yáng)市婦幼保健院），岳陽(yáng) 414000）

多囊卵巢綜合癥（PCOS）是育齡婦女常見的內(nèi)分泌代謝綜合征，全球發(fā)病率約為8%~13%，主要臨床癥狀包括高雄激素血癥（hyperandrogenism，HA）、少排卵或無(wú)排卵以及卵巢多囊樣改變。PCOS確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為是受遺傳、代謝和內(nèi)分泌異常等多種因素共同作用。研究發(fā)現(xiàn)，隨著PCOS病程的發(fā)展，患者代謝、血管、生殖等功能會(huì)持續(xù)受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生、情緒障礙等負(fù)面影響，嚴(yán)重影響PCOS患者生理和心理健康［1-2］。

有研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是PCOS發(fā)生發(fā)展中重要的病理生理變化之一，并且在PCOS患者血液中，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著升高的同時(shí)，炎性細(xì)胞因子如C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-6及IL-1β水平也顯著升高，PCOS患者卵巢中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且存在著大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示炎癥反應(yīng)與PCOS患者卵巢功能異常密切相關(guān)［3-5］。此外，單核細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生可能會(huì)加劇PCOS代謝和激素水平異常［6］。在干預(yù)因素存在的情況下，TNF-α、IL-1β的水平可以反映顆粒細(xì)胞炎癥狀況［7］。因此，研發(fā)抑制卵巢炎癥水平、改善PCOS患者生活質(zhì)量的藥物具有重要意義。

玉竹是百合科多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)和歐亞大陸，玉竹氣微、味甘，具有生津潤(rùn)肺、養(yǎng)陰、潤(rùn)燥、補(bǔ)腎的功效，作用緩和、不滋膩斂邪［8］；此外，植物化學(xué)研究表明，玉竹作為一種天然藥物在抗炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面也發(fā)揮著作用［9-10］。從中醫(yī)學(xué)整體觀來(lái)講，PCOS的病位主要在腎、脾、肝，腎虛痰淤是PCOS最常見的證型。中醫(yī)治療PCOS大多以補(bǔ)腎為基礎(chǔ)，具有補(bǔ)腎功效的玉竹可能對(duì)預(yù)防或治療PCOS有益［11］。本課題復(fù)制PCOS大鼠模型，以玉竹提取物（POD）進(jìn)行干預(yù)，采用免疫組織化學(xué)法（IHC）、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）等實(shí)驗(yàn)方法，觀察POD對(duì)PCOS模型大鼠卵巢功能以及炎癥狀態(tài)的具體影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物

實(shí)驗(yàn)鼠為無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD大鼠（合格證號(hào)：430726210100357456），由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，審查編號(hào)GLMC-IACUC-2020019。

來(lái)曲唑配制：將來(lái)曲唑藥片研磨成粉末后，溶于1%羧甲基纖維素鈉，配制成0.5 g/L來(lái)曲唑工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，工作濃度為1 mg/kg。

POD配制：將干燥的POD粉劑（由湖南明舜制藥有限公司提供），參考相關(guān)文獻(xiàn)［12］以及本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，溶于大鼠飲用水中，配制成200 g/L POD工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，工作劑量分別為1、2、3 g/kg。

1.2 動(dòng)物模型

取3周齡雌性SD大鼠，常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，提供充足的食物和水，自由飲食，保持動(dòng)物房溫度為（22±3）℃，濕度為（55±5）%，給予12 h光照（6:00 am~18:00 pm）和12 h黑暗（18:00 pm~6:00 am）。

實(shí)驗(yàn)分組包括對(duì)照組、模型組（Model）、POD處理組（1、2、3 g/kg）。對(duì)照組大鼠正常飲食；模型組大鼠在28日齡時(shí)給予來(lái)曲唑灌胃處理，每日1次，持續(xù)21 d，觀察PCOS模型是否造模成功；POD處理組大鼠在模型組處理的基礎(chǔ)上，分別采用濃度為1、2、3 g/kg POD溶液進(jìn)行灌胃處理，每日1次，持續(xù)21 d。

1.3 制作陰道涂片

生理鹽水潤(rùn)濕消毒棉簽，插入大鼠陰道內(nèi)1.5 cm左右，在陰道內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)后取出，將棉簽上的細(xì)胞均勻涂抹載玻片上并做好標(biāo)記。待涂片干燥后，滴加美蘭均勻覆蓋，固定10 min后用清水沖掉美蘭，鏡下觀察拍照。

1.4 糖耐量測(cè)試

大鼠禁食12 h后，尾靜脈取血，使用血糖儀測(cè)量血糖值并記錄，為大鼠空腹血糖。大鼠腹腔注射葡萄糖（100 g/L），工作劑量為2 g/kg。于注射后15、30、60、90、120 min進(jìn)行尾靜脈取血，使用血糖儀測(cè)得血糖值并記錄。

1.5 血清睪酮檢測(cè)及卵巢取材

對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉處理，工作劑量為0.02 ml/kg；待大鼠麻醉后，下腔靜脈取血，室溫靜置2 h，4℃，2 000 r/min，離心10 min，取上層淡黃色清亮液體，-80℃低溫保存待測(cè)。應(yīng)用自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)血清睪酮水平。

充分暴露大鼠腹腔器官，摘取雙側(cè)卵巢，剝離干凈后，使用生理鹽水沖洗并拍照、稱重；將左側(cè)卵巢和肝臟放置-80℃低溫保存，右側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛固定。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色以及免疫組織化學(xué)法

卵巢固定后，進(jìn)行石蠟包埋；在石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，標(biāo)記備用；將組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色（北京Solarbio公司），中性樹脂（北京Solarbio公司）進(jìn)行封片，使用倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）進(jìn)行觀察、拍照保存。

取石蠟切片，進(jìn)行脫蠟和水化；進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑進(jìn)行阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；一抗4℃孵育過(guò)夜；PBST清洗，反應(yīng)增強(qiáng)液室溫孵育20 min；PBST清洗，二抗室溫孵育20 min；PBST清洗，DAB顯色液，室溫孵育5~8 min；反藍(lán)、透明、中性樹脂進(jìn)行封片，置于倒置顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照保存。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（WB）

提取卵巢組織蛋白質(zhì)，采用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）測(cè)定濃度；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，200 mA，1 h）；室溫封閉2 h（5%脫脂奶粉）；一抗4℃孵育過(guò)夜（抗體儲(chǔ)存液稀釋比列1∶1 000）；PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h（抗體儲(chǔ)存液稀釋比列1∶5 000）；PBST洗膜，顯影并保存數(shù)據(jù)。采用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，重復(fù)檢測(cè)3次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）

TRIzol法提取卵巢組織RNA，使用超微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定濃度和純度；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing一步法cDNA合成試劑盒，KR118-02）合成cDNA單鏈，置于-20℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)引物序列（表1）設(shè)計(jì)引物，以GAPDH作為內(nèi)參，采取最佳反應(yīng)體系進(jìn)行qPT-PCR（SYBR-Green定量PCR試劑盒，F(xiàn)P201-02）擴(kuò)增反應(yīng)；使用2-ΔCt方法計(jì)算靶基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示為標(biāo)準(zhǔn)化GAPDH的相對(duì)量。

Table 1 Primer sequences

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用Prism8軟件分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采取t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POD對(duì)PCOS模型大鼠體重、卵巢體重指數(shù)以及動(dòng)情周期的影響

隔周記錄各組大鼠體重情況，比較體重增長(zhǎng)幅度。與模型組相比，POD處理組體重增長(zhǎng)幅度略有降低。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)束前大鼠體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POD處理組的體重明顯低于模型組（P<0.01，圖1a，b）。此外，分析各組大鼠卵巢體重指數(shù)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，POD處理大鼠的卵巢體重指數(shù)降低（圖1c），提示POD可改善PCOS模型大鼠卵巢的功能。

SD大鼠動(dòng)情周期一般為4~5 d［13］，動(dòng)情前期（proestrus）以膨大，橢圓形的有核上皮細(xì)胞為主（紅色箭頭），動(dòng)情期（estrus）幾乎都是不規(guī)則的無(wú)核角化細(xì)胞（黑色箭頭），動(dòng)情后期（metestrus）有核上皮、角化細(xì)胞和白細(xì)胞（綠色箭頭）數(shù)量相當(dāng)；間期（diestrus）則以白細(xì)胞為主（圖1d）。為明確POD對(duì)PCOS模型大鼠動(dòng)情周期的影響，連續(xù)14 d監(jiān)測(cè)各組大鼠動(dòng)情周期的變化，依據(jù)各階段陰道細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，繪制動(dòng)情周期折線圖。分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，模型組大鼠動(dòng)情周期消失，以間期為主；而POD處理組大鼠的動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)，部分出現(xiàn)了完整的動(dòng)情周期，提示POD可以改善PCOS模型大鼠動(dòng)情周期紊亂（圖1e）。

2.2 POD對(duì)PCOS模型大鼠血清睪酮、葡萄糖耐量的影響

HA作為PCOS患者最顯著的臨床指標(biāo)之一，雄激素在顆粒細(xì)胞功能和卵泡發(fā)育過(guò)程中扮演著十分重要的角色［14］。本研究檢測(cè)各組大鼠血清中睪酮的含量，發(fā)現(xiàn)POD處理后PCOS模型大鼠血清睪酮水平明顯降低（P<0.01，圖2a）。

檢測(cè)各組大鼠葡萄糖耐量情況，以大鼠血糖變化曲線下面積衡量大鼠糖耐量水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組曲線下面積明顯增多，提示大鼠糖耐量異常。經(jīng)過(guò)POD處理后，PCOS模型大鼠曲線下面積減少，提示糖耐量異常得到改善（圖2b~d）。

Fig. 1 Effects of POD on body mass, ovarian body index and estrous cycle of PCOS rats

Fig. 2 Effects of POD on serum testosterone, blood lipids and glucose tolerance in PCOS rats

Fig. 3 Effects of POD on ovarian morphology and expression of AMH in PCOS rats

Fig. 4 Effect of POD on ovarian inflammation in PCOS rats

2.3 POD對(duì)PCOS模型大鼠卵巢組織形態(tài)以及抗苗勒激素（AMH）表達(dá)的影響

通過(guò)比較各組大鼠卵巢大體形態(tài)發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠卵巢的體積明顯大于對(duì)照組；與模型組比較，POD處理組大鼠的卵巢體積無(wú)明顯變化（圖3a）。但是，卵巢切片HE染色結(jié)果顯示，POD處理后，PCOS模型大鼠卵巢中黃體數(shù)量明顯增加，囊性卵泡數(shù)量減少，表明POD可以改善PCOS模型大鼠卵巢的多囊樣變以及排卵異常（圖3b~d）。

PCOS患者中抗苗勒激素（AMH）水平與患者竇狀卵泡數(shù)目成正比，是卵巢儲(chǔ)備功能最可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［15-16］。檢測(cè)卵巢中AMH的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)POD處理可以顯著下調(diào)PCOS模型大鼠卵巢組織中AMH的表達(dá)（圖3e，f），提示POD可以改善PCOS模型大鼠的卵巢儲(chǔ)備功能。

2.4 POD對(duì)PCOS模型大鼠卵巢炎癥的影響

檢測(cè)大鼠卵巢炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平（圖4a~e）。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠卵巢組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，但在POD處理之后，PCOS模型大鼠卵巢組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)。

IHC檢測(cè)大鼠卵巢組織IL-1β（圖4f，g）和TNF-α（圖4h，i）的水平，結(jié)果與WB、qRT-PCR結(jié)果一致，提示POD處理可以減輕PCOS模型大鼠卵巢中的局部炎癥反應(yīng)。

3 討論

PCOS是卵巢排卵功能障礙主要原因之一，患者臨床癥狀主要表現(xiàn)在HA、因卵泡生長(zhǎng)停止和多囊卵巢改變引起少排卵或無(wú)排卵，此外，PCOS患者常表現(xiàn)為不孕癥、多毛癥、痤瘡等癥狀［17-19］?；颊呋挤逝职Y、代謝功能障礙、血管功能障礙、惡性腫瘤［20］、生殖并發(fā)癥和情緒障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加［21］，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。針對(duì)PCOS患者，目前臨床治療主要以飲食、運(yùn)動(dòng)及二甲雙胍、胰高血糖素樣肽（GLP-1）受體激動(dòng)劑等方法來(lái)改善PCOS患者情緒健康及卵巢功能［22-23］。但上述臨床治療方式只是針對(duì)PCOS患者相關(guān)癥狀進(jìn)行治療，具有一定的時(shí)效性。因此，在對(duì)PCOS的臨床治療及研究過(guò)程中迫切需要副作用小、效果顯著的治療方式。

中藥作為中國(guó)傳統(tǒng)的治療方式之一，在許多疾病治療過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)代謝、提高免疫功能、改善心血管功能、抗炎消炎等作用。文獻(xiàn)記載，玉竹作為傳統(tǒng)的中草藥和食用植物，其化學(xué)成分豐富，在食品保健及藥用存在著巨大的使用價(jià)值。文獻(xiàn)表明，玉竹多糖在免疫和抗菌活性方面以及高血糖和高甘油三酯血癥預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用［24-26］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，POD可以降低PCOS模型大鼠的卵巢體重指數(shù)。并且，連續(xù)14 d的陰道脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，PCOS模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂明顯，而POD處理之后，PCOS模型組大鼠可依然存在著完整的動(dòng)情周期。以上結(jié)果提示，POD在代謝性疾病PCOS中發(fā)揮著積極作用。

雄激素水平升高作為PCOS的重要現(xiàn)象［27］，可促進(jìn)PCOS患者卵巢炎癥發(fā)生、卵泡排卵異常等。本研究結(jié)果提示，經(jīng)POD處理的PCOS模型大鼠中血清睪酮顯著降低，表明POD可以改善PCOS模型大鼠的HA。PCOS作為一種內(nèi)分泌代謝性疾病［28］，同時(shí)也伴隨著胰島素抵抗［29］。糖耐量受損是PCOS常見的代謝異?，F(xiàn)象之一，糖尿病也是PCOS常見的并發(fā)癥，提示胰島功能損傷可能與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)［30］。本研究結(jié)果顯示，PCOS模型大鼠出現(xiàn)了糖耐量異常，但POD處理后顯著改善了PCOS模型大鼠糖耐量異常。雖然本課題實(shí)驗(yàn)未測(cè)量大鼠胰島素水平，但糖耐量試驗(yàn)結(jié)果也一定程度上反映機(jī)體胰島功能受損情況。

PCOS患者卵巢內(nèi)黃體計(jì)數(shù)減少以及囊性卵泡計(jì)數(shù)增加，并且患者體內(nèi)雌激素水平、月經(jīng)周期及其他卵巢功能受到影響。本研究結(jié)果表明，POD可以增加PCOS模型大鼠卵巢內(nèi)黃體數(shù)量并大幅度減少囊性卵泡的數(shù)量，提示POD可以改善PCOS模型大鼠卵巢相關(guān)功能的異常。AMH水平較高作為PCOS卵泡發(fā)育障礙的標(biāo)志［31］，在PCOS患者體內(nèi)血清中的水平較正常女性高100%~200%［19］。本研究結(jié)果表明，在POD作用下PCOS大鼠模型中AMH表達(dá)顯著下調(diào)，提示POD對(duì)PCOS模型大鼠卵泡發(fā)育障礙具有改善作用。

在卵巢功能紊亂評(píng)價(jià)中，炎癥標(biāo)志物水平評(píng)估是必不可少的。TNF-α、IL-1β是可以由巨噬細(xì)胞、卵巢組織內(nèi)皮細(xì)胞等部位產(chǎn)生的多效性信號(hào)分子，在PCOS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［32］。研究表明，TNF-α參與調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育、排卵、血管生成、癌變等過(guò)程并發(fā)揮作用直接影響著PCOS的發(fā)生發(fā)展［33-34］。為探究PCOS模型大鼠卵巢組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)水平，本研究檢測(cè)了PCOS模型大鼠中IL-1β和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著增加。而POD處理之后， PCOS模型大鼠卵巢內(nèi)TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著下調(diào)。提示POD可以抑制PCOS模型大鼠中卵巢炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，有研究表明，炎性細(xì)胞因子TNF-α可以影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)相關(guān)通路刺激相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生更多炎性細(xì)胞因子［35］。結(jié)合糖耐量結(jié)果，提示POD可能對(duì)胰島素發(fā)揮作用產(chǎn)生影響，且該種影響很可能與其顯著的抗炎功效相關(guān)，但具體的聯(lián)系仍不清楚。

綜上所述，在本課題研究了藥食兩用的POD對(duì)來(lái)曲唑復(fù)制的PCOS模型大鼠的影響。結(jié)果表明，POD可以有效抑制PCOS模型大鼠的卵巢炎癥，降低血清睪酮水平，改善卵巢功能，影響PCOS的發(fā)生發(fā)展，提示POD在PCOS模型大鼠病情轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要的作用。該研究結(jié)論的發(fā)現(xiàn)，可以為天然藥物預(yù)防PCOS的產(chǎn)生和治療提供新的基礎(chǔ)理論及研究方向。但是，本實(shí)驗(yàn)選用的POD粉劑為初步提取階段提取物，未經(jīng)過(guò)相關(guān)程序進(jìn)行深層加工，在本課題中發(fā)揮作用的具體成分不夠明確，因此，在本課題組接下來(lái)的研究中，將繼續(xù)對(duì)玉竹影響PCOS的具體作用成分及作用機(jī)制進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

本研究探究了不同濃度POD在PCOS模型大鼠中的作用，研究結(jié)果提示POD在PCOS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著積極作用。POD可以改善來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型中卵巢功能狀態(tài)，抑制PCOS卵巢炎癥反應(yīng)。為PCOS患者治療提供新的理論基礎(chǔ)和治療策略。