獨(dú)占春×美花蘭雜交F1代基于SSR標(biāo)記的雜種鑒定和遺傳多樣性分析

韓豫　陳 彧 　饒丹丹　陳顯臻　陳國德

關(guān)鍵詞：獨(dú)占春；美花蘭；雜交F1 代；SSR；雜種鑒定；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

海南野生蘭花種類豐富，擁有蘭科植物96 屬302 種[1]， 其中獨(dú)占春（ Cymbidium eburneumLindl.）、美花蘭（Cymbidium insigne Rolfe.）等是海南特有種，也是國際上育種常用的起主要遺傳作用的品種。因蘭花的觀賞價(jià)值高，市場(chǎng)需求量大，海南野生蘭花資源被肆意采挖，野生蘭生境遭到嚴(yán)重破壞，物種多樣性降低[2]，部分蘭花種源已屬瀕危稀缺狀態(tài)[3]，美花蘭已被列為國家重點(diǎn)一級(jí)保護(hù)野生植物，獨(dú)占春被列為國家重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)野生植物、瀕危（IUCN 標(biāo)準(zhǔn)）。目前，海南從事野生蘭花研究工作主要集中在資源調(diào)查[4-6]、品種收集、遺傳多樣性分析[7-8]、雜交育種及組培繁育[9]等方面，而針對(duì)野生蘭保護(hù)性開發(fā)應(yīng)用的研究卻很少。此外，美花蘭對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，不易人工栽培，對(duì)其開發(fā)應(yīng)用效率較低。通過獨(dú)占春和美花蘭雜交育種，已獲得了一批適應(yīng)性強(qiáng)又具有較高觀賞價(jià)值的雜交群體。對(duì)雜交后代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，可降低育種成本，縮短育種時(shí)間，同時(shí)也為海南野生蘭種質(zhì)資源保存、種質(zhì)創(chuàng)新、野生蘭資源推廣應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

目前，蘭花育種研究普遍采用種間及種內(nèi)雜交，導(dǎo)致種源繁多、遺傳背景復(fù)雜，易造成“同物異名”和“同名異物”的現(xiàn)象，這就需要對(duì)雜交后代進(jìn)行鑒定分類。目前雜種鑒定方法主要有形態(tài)特征鑒定、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子細(xì)胞遺傳學(xué)和分子標(biāo)記等[10]。形態(tài)特征鑒定方法雖然簡(jiǎn)單直接，但是雜交后代性狀相近時(shí)鑒定難度加大，且受環(huán)境和人為觀測(cè)的影響。細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定方法是通過雙親和雜交后代染色體數(shù)目、形態(tài)和分裂時(shí)配對(duì)情況進(jìn)行鑒定[11-12]，但此鑒定方法僅適用于染色體倍數(shù)相同的后代。分子細(xì)胞遺傳學(xué)的FISH（fluorescence in situ hybridization）技術(shù)和GISH（genomic in situ hybridization）技術(shù)在遠(yuǎn)緣雜種鑒定方面應(yīng)用廣泛，其鑒定準(zhǔn)確、直觀，但在親本較近的親緣關(guān)系卻難以進(jìn)行鑒定[12]。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，具有較高的準(zhǔn)確性和有效性的分子標(biāo)記技術(shù)，包括ISSR、SRAP、SSR、RAPD 等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蘭科植物、農(nóng)作物等遺傳多態(tài)性[13]、品種鑒定[14]、遺傳指紋圖譜等研究方面。李玉萍等[15]采用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)春蘭紫萼×大花蕙蘭日本綠的10 個(gè)F1 代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，結(jié)果表明10 個(gè)F1 代均為真實(shí)雜種，且與母本相似性較高。阮稀[16]采用ISSR 分子標(biāo)記法對(duì)春劍皇梅和春蘭環(huán)球荷鼎雜交的8 個(gè)F1 代進(jìn)行鑒定，證實(shí)8 個(gè)F1 代為真雜種，并繼承了父本的基因條帶。林榕燕等[17]對(duì)文心蘭雜交后代進(jìn)行了EST-SSR 分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果表明46 個(gè)雜交后代株系均為真雜種，同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)雜交后代與母本遺傳相似系數(shù)大于父本。分子標(biāo)記法的可靠性、準(zhǔn)確性，證明了分子標(biāo)記法用于海南野生蘭雜交后代的鑒定的可行性。

本研究采用SSR 分子標(biāo)記鑒定獨(dú)占春和美花蘭雜交F1 代23 個(gè)單株，分析雜交后代與親本的親緣關(guān)系，研究雜交后代的遺傳多樣性，為觀賞性高的蘭花品種選育提供可能，也為種質(zhì)資源可持續(xù)開發(fā)、瀕危野生資源保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交試驗(yàn)在海南省林業(yè)科學(xué)研究院云龍科研基地蘭花圃完成，以獨(dú)占春（Cymbidium eburneumLindl.）為母本，美花蘭（Cymbidium insigne Rolfe.）為父本進(jìn)行雜交，獲得雜交F1 代23 個(gè)單株，每個(gè)單株隨機(jī)采集2～3 片無病蟲害的新鮮葉片，用無水乙醇擦拭干凈葉片表面，晾干后貯藏于有硅膠的自封袋中帶回試驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA 提取 使用基因組DNA 提取試劑盒（武漢納磁生物科技有限公司）按說明書提取樣品葉片DNA，采用微量分光光度計(jì)（ThermoFisher Nano Drop ONE）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA 的濃度和純度，并將待檢測(cè)樣品DNA保存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 引物篩選 根據(jù)陳起馨[18]在構(gòu)建蘭花圖譜研究中的引物信息，選擇48 對(duì)引物組合，在1%濃度瓊脂糖凝膠上120 V 電壓電泳20 min，篩選出多態(tài)性好、重復(fù)性高的引物組合8 對(duì)，用于遺傳多樣性分析。

1.2.3 SSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng) 在Veriti 384 well 型PCR 儀上進(jìn)行SSR-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積為10 μL，其中，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，10 pmol/μL F-primer、R-primer 各0.5 μL，模板DNA（20 ng）1 μL，ddH₂O₃μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸20 min，4 ℃保存。最后，取2 μL PCR產(chǎn)物在1%濃度瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GeneMarker 3.0 分析軟件對(duì)每對(duì)引物擴(kuò)增的多個(gè)等位基因位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)記，樣品中有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，構(gòu)建SSR 標(biāo)記的0、1 矩陣。采取UPGMA 聚類方法，利用NTSYS-pc 2.10 計(jì)算遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析。利用GenAIex 6.502 軟件獲得遺傳多樣性信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交后代的性質(zhì)鑒定

參考陳起馨[18]蘭花圖譜中應(yīng)用的引物，從48對(duì)SSR 引物中篩選出8 對(duì)引物（表1），利用這8對(duì)引物對(duì)獨(dú)占春和美花蘭雜交F1 代的23 個(gè)單株進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定（表2）。引物Cym45、Hub131和Hub8 檢測(cè)到23 個(gè)單株均兼具雙親特異位點(diǎn)，引物Cym25 和Hub125 檢測(cè)到23 個(gè)單株僅具父本特異位點(diǎn)，引物Cym172 檢測(cè)到12 個(gè)單株兼具雙親特異位點(diǎn)，11 個(gè)單株僅具父本特異位點(diǎn)，鑒定率達(dá)100%；引物Cym9 檢測(cè)到6 個(gè)單株兼具雙親特異位點(diǎn)，16 個(gè)單株僅具父本特異位點(diǎn)，1 個(gè)單株出現(xiàn)新位點(diǎn)，鑒定率為95.65%。綜合以上7個(gè)引物的鑒定結(jié)果，受測(cè)的23 個(gè)單株均為真雜種，真雜種率為100%。

2.2 SSR 擴(kuò)增遺傳多樣性分析

由表3 可知，利用篩選出的8 對(duì)引物對(duì)23個(gè)F1 代單株進(jìn)行SSR 產(chǎn)物擴(kuò)增（部分樣品在引物Cym172 的擴(kuò)增結(jié)果見圖1），共檢測(cè)出14 條多態(tài)性條帶，平均每個(gè)引物3.11 條；檢測(cè)到25 個(gè)等位基因（Na），其中引物Cym172 擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最多，擴(kuò)增出4 個(gè)；引物Hub8 擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最少，擴(kuò)增出2 個(gè)；平均Na 為3.13 個(gè)；有效等位基因數(shù)（Ne）變化范圍為1.08～2.85，平均為1.76 個(gè)；觀測(cè)雜合度（Ho）變化范圍為0.04～0.96，平均值為0.54；期望雜合度（He）變化范圍為0.08～0.65，平均值為0.36；Shannon 信息指數(shù)（I）變化差異較大，變化范圍為0.20～1.18，其中最大的引物為Cym172 ， 最小的引物為Hub125，平均值為0.62；遺傳多樣性（Hs）平均值為0.68，多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍為0.08～0.59，平均值為0.31，其中只有引物Cym172呈高度多態(tài)性（PIC>0.5），引物Cym45、Hub131、Hub8 和Cym9 呈中高度多態(tài)性（0.25

2.3 親本與其F1 代聚類分析

對(duì)親本和雜交F₁代計(jì)算的遺傳距離分析可知，遺傳距離最小的是X₁₈等14 個(gè)F₁ 單株，僅為0.0769，說明在雜交F₁ 代中樣品X₁₈等14 個(gè)單株遺傳差異較??；遺傳距離最大的是親本（分別標(biāo)記為D 和M），為0.9583，說明親本的遺傳表現(xiàn)較大。當(dāng)遺傳距離為0.1177 時(shí)，將親本和23 個(gè)雜交F₁代單株分為3 個(gè)類群（圖2）。第1、2 類均是親本；第3 類是23 個(gè)雜交F₁代單株，即雜交群體。第3 類又可分為3 個(gè)分支，X₇為一個(gè)分支，X₆和X₂₁聚類在一起，其余20 個(gè)F₁代單株聚類為一簇。

3 討論

雜交育種是觀賞性植物新品種培育的重要途徑[20]，而雜交后代數(shù)量較多，對(duì)雜交后代進(jìn)行雜種鑒定，從中篩選出所需要的真雜種，從而提高育種效率、縮短育種周期，對(duì)蘭花新品種培育具有重要意義。常用的RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子標(biāo)記已在多種植物雜種鑒定中得到廣泛應(yīng)用[21]。分子標(biāo)記是在DNA 水平上直接反映的，具有較高的可靠性和穩(wěn)定性，不受環(huán)境影響，且能在苗期進(jìn)行早期鑒定[22-25]。SSR 標(biāo)記具有高多態(tài)性、共顯性遺傳、易操作等優(yōu)點(diǎn)[21]，可更準(zhǔn)確地反映雜種與親本遺傳信息的差異。本研究的SSR 分析結(jié)果顯示，獨(dú)占春和美花蘭雜交后代中既有兼具雙親特異位點(diǎn)，也有僅具有父本和母本一方的特異位點(diǎn)，同時(shí)也產(chǎn)生了新的特異位點(diǎn)，說明本研究的雜交后代既有遺傳又有變異。通過SSR 分子標(biāo)記法，在獨(dú)占春和美花蘭雜交后代中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，表明SSR 分子標(biāo)記法可應(yīng)用在海南野生蘭遺傳多樣性分析，可建立適合海南野生蘭科植物的SSR 分子標(biāo)記反應(yīng)體系。

蘭科植物中，基于分子標(biāo)記研究最多的主要是國蘭、蝴蝶蘭等[18， 26]。而海南野生蘭因其資源的稀缺性和人工培育技術(shù)難等原因，利用分子標(biāo)記方法研究海南野生蘭的報(bào)道卻很少。本研究采用SSR 分子標(biāo)記對(duì)獨(dú)占春和美花蘭F1代真實(shí)性進(jìn)行鑒定，這是對(duì)海南野生蘭雜交后代的首次鑒定分析，對(duì)資源稀缺的海南野生蘭種質(zhì)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究從48 對(duì)引物中篩選出的8 對(duì)引物能較好的區(qū)分F1 代的真實(shí)性，而引物Cym45、Hub131、Hub8、Cym25、Hub125 和引物Cym9鑒定效率分別為100%和95.65%，說明23 個(gè)雜交后代單株均為真雜種。

分子標(biāo)記法也應(yīng)用于蘭科植物的遺傳關(guān)系、遺傳多樣性分析等多個(gè)方面中。王宏利等[27]采用ISSR 方法對(duì)39 份建蘭品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，將其分為6 個(gè)群集。袁媛等[28]采用SRAP 方法對(duì)154 份國蘭種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，分析其遺傳相似系數(shù)在0.772～1.000 之間。王曉英等[29]對(duì)蘭屬9 個(gè)品種進(jìn)行AFLP 分析，遺傳相似系數(shù)為0.416～ 0.606，發(fā)現(xiàn)蓮瓣蘭品種與春蘭品種親緣關(guān)系較近，而春劍品種與春蘭品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。楊光穗[8]利用SRAP 分子標(biāo)記研究了8 種海南野生蘭屬植物，將其劃分為4 類。顏平[30]對(duì)168 份海南鉆喙蘭進(jìn)行SRAP 分析，其遺傳相似系數(shù)為0.486～0.959。本研究?jī)H對(duì)雜交后代的真實(shí)性進(jìn)行鑒定分析，而親本間的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。