郭新穎，謝超

（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南通 226001）

草甘膦，化學名稱為N-磷酸甲基甘氨酸，化學式為C3H8NO5P，是農(nóng)田莊園道路中廣泛使用的一種內(nèi)吸傳導型廣譜滅生性除草劑，也是農(nóng)藥孟山都農(nóng)達的一種有效活性成分[1?2]。由于草甘膦穩(wěn)定性好、極性強、除草效率高，極易溶于水，美國于20世紀70年代中期批準其用于農(nóng)作物。當草甘膦滲入土壤后會與金屬離子結(jié)合而失活，繼而在環(huán)境和生物體內(nèi)不斷富集，通過環(huán)境介質(zhì)和食品進入人體，對身體健康構(gòu)成不可逆威脅[3?4]。2017 年10 月27 日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)公布的致癌物清單中，將草甘膦列入2 A類致癌物清單，目前草甘膦的精準檢測及其所引發(fā)的健康風險問題已成為國內(nèi)外學者的研究熱點[5?6]。蜂蜜制品因其具有豐富的營養(yǎng)成分和活性功能而成為消費者青睞的綠色天然食品，作為重要出口支柱產(chǎn)業(yè)，我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)正處于轉(zhuǎn)型升級的特殊時期，由于生產(chǎn)技術(shù)水平較低、行業(yè)標準存在缺陷、市場環(huán)境不規(guī)范等原因，我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)正面臨國際綠色貿(mào)易壁壘的風險。蜂蜜中草甘膦檢出和超標事件頻頻爆出和持續(xù)發(fā)酵[7?8]，警示著嚴格規(guī)范蜂蜜中草甘膦檢測方法與行業(yè)標準勢在必行。目前，草甘膦的測定方法主要有離子色譜法[9?10]、酶聯(lián)免疫法[11?12]、高效液相色譜法[13?15]和液相色譜-質(zhì)譜法[16?19]等。離子色譜定性能力較差，需要與其它具有定性能力的分析技術(shù)聯(lián)用；酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)主要用于輔助現(xiàn)場檢驗診斷，定量檢測的特異性和靈敏性有待提高；質(zhì)譜方法需要昂貴的儀器，難以普遍推廣。液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法的樣品處理常常采用固相萃取小柱凈化、二氯甲烷等毒性有機溶劑液液萃取和試劑衍生化等進行聯(lián)合操作，流程繁瑣復(fù)雜，有機試劑耗費較多，而且過柱和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)流程需要專業(yè)操作才能保證提取效率，耗時費力。筆者采用純水提取蜂蜜中草甘膦，用多壁碳納米管(MWCNTs)和十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)材料進行混合分散固相萃取凈化，經(jīng)過高效的試劑衍生化，采用高效液相色譜熒光檢測器進行定量測定。該方法樣品處理操作簡單快速，回收率高，精密度好，分離能力強，速度快，能夠滿足蜂蜜中草甘膦農(nóng)藥殘留的定量測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260 型，美國安捷倫科技有限公司。

超聲波清洗器：HN10-300D 型，中國上海漢諾儀器有限公司。

高速冷凍離心機：Primo B 型，美國賽默飛科技有限公司。

高純水發(fā)生器：Milli-Q 型，德國默克密理博實驗室設(shè)備有限公司。

草甘膦標準品：質(zhì)量分數(shù)不小于99%，上海安譜實驗科技公司。

電子天平：AG245 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒(上海)有限公司。

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：粉末狀，粒徑為40 μm，孔徑為60 ?，上海安譜實驗科技公司。

9-芴甲基氯甲酸酯：質(zhì)量分數(shù)不小于98%，上海源葉生物科技有限公司。

多壁碳納米管(MWCNTs)：國藥集團化學試劑有限公司。

四硼酸鈉：分析純，西格瑪試劑公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

蜂蜜樣品：瓶裝，市售。

1.2 樣品處理

準確稱取2.0 g 蜂蜜樣品于試管中，加入10 mL水充分溶解，室溫震蕩超聲提取30 min，以4 000 r/min離心10 min，取上清液。移取2 mL提取液先經(jīng)MWCNTs和C18混合分散固相吸附劑吸附凈化，然后加入0.05 mol/L 四硼酸鈉溶液0.5 mL 和1.0 mg/mL 9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液1.0 mL 充分混勻振搖，于室溫下反應(yīng)1 h進行試劑衍生，衍生液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，經(jīng)色譜柱分離，采用熒光檢測器檢測。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：ZORBAX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A 相為乙腈，B相為0.30 g/L 磷酸二氫鉀溶液(pH 2.0)，流量為1.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；激發(fā)波長：254 nm；發(fā)射波長：315 nm。

1.4 溶液配制

準確稱取草甘膦標準物質(zhì)50.5 mg (精確至0.1 mg)，用水稀釋并定容于50 mL 容量瓶中，得到1 000 μg/mL 草甘膦標準儲備液。分別移取適量的草甘膦標準儲備液，用水稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度依次為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL的草甘膦系列標準工作溶液。

1.5 測定方法

分別取草甘膦系列標準工作溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，在1.3儀器工作條件下測定，以標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以標準工作溶液的色譜峰面積為縱坐標進行線性擬合，樣品中的草甘膦采用外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑選擇

草甘膦屬于強極性分子，極易溶于水，幾乎不溶于有機溶劑，因此樣品處理中不宜采用有機溶劑作為提取液，綜合考慮提取效果和提取成本，直接選擇水作為樣品提取劑。

2.2 衍生條件選擇

2.2.1 衍生試劑濃度

分別選擇0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mg/mL 的9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液對蜂蜜樣品中的草甘膦進行衍生，考察不同質(zhì)量濃度的衍生試劑對草甘膦回收率的影響，結(jié)果見表1。由表1 可知，當衍生試劑9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液的質(zhì)量濃度小于1.0 mg/mL時，草甘膦的回收率偏低，說明衍生試劑的質(zhì)量濃度較低時衍生效果較差，而當衍生試劑的質(zhì)量濃度大于或等于1.0 mg/mL時，草甘膦的回收率較高，表明衍生效果較好。綜合考慮，選擇衍生試劑9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度衍生試劑時草甘膦的回收率

2.2.2 衍生時間

在室溫條件下，分別選擇衍生時間為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 h 進行試驗，比較樣品中草甘膦的回收率，結(jié)果見表2。由表2 可知，當衍生時間大于或等于1 h時，草甘膦的回收率較高，而當衍生時間小于1 h 時，草甘膦的回收率較低，說明適當延長衍生時間有利于衍生反應(yīng)完全，衍生效果較好?？紤]到檢測效率，最終選擇衍生時間為1.0 h。

表2 不同衍生時間時草甘膦的回收率

2.2.3 衍生溫度

分別選擇在室溫25 ℃、水浴30、35、40、50、60 ℃條件下進行試驗，比較草甘膦回收率，結(jié)果見3。由表3可知，當溫度不高于30 ℃時，草甘膦的回收率較高，衍生效果較好；當溫度高于30 ℃時，草甘膦的回收率較低，衍生效率降低，說明高溫不利于目標組分草甘膦與衍生試劑的衍生反應(yīng)，考慮到在常溫條件下即可滿足試驗需要，因此最終將反應(yīng)溫度設(shè)定為室溫25 ℃。

表3 不同衍生溫度時草甘膦的回收率

2.3 固相萃取劑用量

MWCNTs和C18混合固相萃取劑用量對草甘膦的萃取效果產(chǎn)生直接影響。在2 mL 加標蜂蜜樣品提取液中，分別加入不同質(zhì)量的MWCNTs和C18，漩渦混勻離心后測定，結(jié)果見表4。由表4 可知，加標樣品提取液經(jīng)不同用量的MWCNTs 和C18萃取，均能夠檢測到草甘膦，當萃取劑的用量為60 mg MWCNTs和120 mg C18時，草甘膦的回收率最高，表明萃取效果最好，所以最終采用混合固相萃取劑用量為60 mg MWCNTs和120 mg C18。

表4 MWCNTs和C18不同用量時草甘膦的回收率

2.4 色譜條件選擇

參考國家標準[20?21]選擇色譜條件，優(yōu)化結(jié)果見1.3。

2.5 色譜圖

在1.3 儀器工作條件下，分別測定質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL 的草甘膦標準溶液、陰性樣品溶液和加標樣品溶液，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，在選定的色譜條件下，草甘膦色譜峰形良好，可用于定量分析。

圖1 草甘膦標準溶液、空白樣品溶液和加標樣品溶液色譜圖

2.6 線性方程與檢出限

在1.3儀器工作條件下，由低濃度到高濃度依次進樣測定草甘膦系列標準工作溶液，以草甘膦質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線，計算得草甘膦的標準工作曲線方程為y=1 016.494 5x+5.801 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，質(zhì)量濃度線性范圍為0.005～5.00 μg/mL。表明該方法線性良好，滿足測定要求。

取質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的草甘膦標準溶液，用水逐級稀釋，在1.3儀器工作條件下進行測定，將信噪比(S/N)為3∶1時對應(yīng)的草甘膦的質(zhì)量濃度換算為樣品中草甘膦的質(zhì)量分數(shù)，作為方法檢出限，得檢出限為0.025 mg/kg。

2.7 加標回收與精密度試驗

在蜂蜜樣品中分別添加0.02、0.1、0.25 μg/mL三種質(zhì)量濃度水平的草甘膦標準溶液，按照本試驗的樣品處理方法提取凈化后進行測定，每個樣品平行測定6 次，結(jié)果見表5。由表5 可知，草甘膦的平均加標回收率為78.1%～92.3%，測定結(jié)果的相對標準偏差為2.8%～8.4%，表明該方法的精密度、準確度均較高，滿足樣品的測定要求。

表5 加標回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

以MWCNTs和C18作為混合分散固相萃取吸附劑聯(lián)合高效液相色譜熒光檢測技術(shù)，建立了一種定量測定蜂蜜中強極性農(nóng)藥草甘膦殘留的分析方法。兩種吸附劑聯(lián)合用于處理樣品可獲得良好的凈化效果。該方法操作簡單、快速高效、綠色環(huán)保、省時省力、定量準確，可作為一種蜂蜜中草甘膦農(nóng)藥殘留檢測新方法。