孫紅娟,蔣經(jīng)偉,董 穎,高 杉,關(guān)曉燕,陳 仲,王 擺,潘泳嘉,肖 瑤,姜萍哲,李佩佩,張宸瑜,周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點試驗室,遼寧 大連 116023 )

胸腺素是具有生物活性的多肽,是從小牛胸腺中提取出來的,按照等電點(PI)分為α(PI<5)、β(57)亞型[1]。該家族從低等棘皮動物到高等脊椎動物均為高度保守的,但是在細菌和其他微生物中尚未發(fā)現(xiàn)[2]。β-胸腺素家族分子質(zhì)量約5 ku,由40～44個氨基酸組成,在生物體內(nèi)的表達具有物種特異性。β-胸腺素能夠調(diào)節(jié)肌動蛋白濃度,參與細胞骨架重排以及細胞的分化、遷移等細胞活動[3-4]。另外β-胸腺素作為抗菌肽,也具有抗菌和抗病毒等方面的活性。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門海參綱仿刺參屬,因其缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng),只能依靠先天性免疫系統(tǒng)抵御外界病原刺激[5]?？咕脑谙忍煨悦庖呦到y(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。胸腺素作為抗菌肽家族中的一員,在仿刺參中的作用機制尚無研究報道。研究仿刺參β-胸腺素的結(jié)構(gòu)特征以及在病原菌刺激后是否參與機體的免疫應(yīng)答,將為仿刺參活性多肽的研究提供材料,同時為仿刺參養(yǎng)殖過程中的病害防控以及生態(tài)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織和發(fā)育樣品

試驗用仿刺參取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心,體質(zhì)量(6.0±1.5) g,養(yǎng)殖水溫16～18 ℃,鹽度29,pH 8.3～8.5。試驗共取6種組織,包括體壁、肌肉、管足、呼吸樹、腸道和體腔細胞。不同發(fā)育時期包括受精卵、囊胚、原腸胚、小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體、樽型幼體、五觸手幼體和稚參。

1.1.2 免疫菌株

免疫刺激試驗采用從仿刺參腐皮綜合征病灶處分離出來的4種病原菌:希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和燦爛弧菌(Vibriosplendidus)。4種病原菌均在2216E培養(yǎng)基中,于28 ℃,150 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)密度達到108cfu/mL時,可用于免疫刺激。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因全長克隆

用動物組織RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取仿刺參體腔細胞RNA,以前期轉(zhuǎn)錄組測序得到的部分仿刺參β-胸腺素序列為基礎(chǔ),采用SMARTer 5′/3′RACE試劑盒(Clontech)對該基因5′端進行克隆,3′端的克隆采用3′-Full Race PrimeScripTMRTase試劑盒(Takara),RACE特異引物(GSP)見表1。反應(yīng)體系見表2。

表2 仿刺參β-Thymosin的RACE PCR反應(yīng)體系Tab.2 RACE PCR system of Ajβ-thymosin

1.2.2 生物信息學(xué)分析

在美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框的預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域分析;采用Expert Protein Analysis Systerm(http://www.expasy.org/tools/)進行核酸和氨基酸序列的翻譯;在SMART平臺(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。采用MEGA 4.0軟件對不同物種氨基酸序列進行比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,自展值設(shè)置為1000次重復(fù)。

1.2.3 仿刺參免疫

將同一批次的300頭健康仿刺參平均分為5組:對照組與4個免疫刺激組。試驗采用滅菌注射器對仿刺參進行體腔注射,對照組注射滅菌海水,刺激組分別注射不同的菌液。試驗采用的注射劑量均為100 μL/頭[6]。每組在注射后4、24、48、72 h和96 h分別選取9頭仿刺參解剖并獲取體腔液,隨機分成3份,每3頭混合成1份,4 ℃,3000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min,棄上清液收集體腔細胞保存用于RNA提取。

1.2.4 熒光定量試驗

使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA樣品。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行實時熒光定量PCR,以 Cytb作為內(nèi)參基因(表1)[7]。反應(yīng)體系為:0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×),1 μL cDNA 模板,10 μL TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) (2×Conc.),正、反引物各0.8 μL,7 μL dH2O。每個樣本重復(fù)3次。采用 2-ΔΔCt法對實時熒光定量PCR所獲取的Ct值進行分析。不同組之間表達差異水平采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和鄧肯多重比較,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參β-胸腺素基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)仿刺參β-胸腺素已知的部分序列,設(shè)計3′和5′末端引物(表1),采用RACE法進行克隆,將得到的3′和5′末端序列和已知序列進行拼接,獲得仿刺參β-胸腺素的mRNA全長1877 bp,命名為Ajβ-Thymosin。序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫,獲得登錄號:MF989226。開放閱讀框(ORF)長126 bp,翻譯后氨基酸序列為41個,分子量為4.6 ku,理論等電點為5.25,結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存在保守的β-胸腺素肌動蛋白結(jié)合基序(THY),不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 仿刺參β-胸腺素的序列(a)和結(jié)構(gòu)(b、c)分析Fig.1 Sequence (a) and structure (b, c) analyses of Ajβ-thymosina.灰色標記部分為開放閱讀框,黃色標記部分為G-actin 結(jié)合結(jié)構(gòu)域,紅色氨基酸序列為保守功能區(qū); b、c分別為功能結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu).a.the ORF and G-actin binding residues are highlighted in grey and yellow, respectively; the red amino acid sequence is conservative functional residues; b and c. the functional structure and secondary structure, respectively.

2.2 仿刺參β-胸腺素蛋白序列的進化分析

將Ajβ-Thymosin基因的氨基酸序列和其他物種的氨基酸序列(表3)進行比對分析發(fā)現(xiàn),在仿刺參β-胸腺素中存在著保守的功能序列EVASFDKSKLK(9-19)[8]和保守的G-actin 結(jié)合結(jié)構(gòu)域LKKTET[9](圖1)。系統(tǒng)進化分析顯示Ajβ-Thymosin基因和紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)、海綿和九孔鮑的β-胸腺素聚為一支(圖2)。

圖2 仿刺參β-胸腺素的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Ajβ-thymosin

表3 不同物種β-胸腺素的氨基酸序列Tab.3 The amino acid sequence of β-thymosin from different species

2.3 仿刺參β-胸腺素在不同組織和不同發(fā)育時期的表達模式

實時熒光定量PCR測得Ajβ-Thymosin基因在不同組織的表達結(jié)果見圖3。Ajβ-Thymosin基因在體腔細胞和呼吸樹中高表達,并且與腸道、管足、肌肉和體壁組織中的表達量存在顯著差異。β-胸腺素在仿刺參不同發(fā)育時期的表達結(jié)果見圖4。Ajβ-Thymosin基因在受精卵期、原腸胚期和囊胚期低表達,從小耳幼體期開始顯著上調(diào),并且在稚參期Ajβ-Thymosin基因的表達量達到最高。

圖3 β-胸腺素基因在仿刺參不同組織中的表達模式Fig.3 Expression level of Ajβ-thymosin at different tissues in sea cucumber A. japonicus

圖4 β-胸腺素基因在仿刺參不同發(fā)育時期的表達模式Fig.4 Expression level of Ajβ-thymosin at different developmental stages in sea cucumber A. japonicus

2.4 不同病原菌刺激后仿刺參β-胸腺素基因的表達變化

采用4種病原菌對仿刺參進行免疫刺激,檢測體腔細胞中Ajβ-Thymosin基因在刺激后4、12、24、48、72、96 h的表達變化情況(圖5)。對照組注射滅菌海水,在注射后6個時間點也同時取樣。在蠟樣芽孢桿菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表達水平顯著下調(diào),在12 h表達水平顯著上調(diào)并達到最高水平,隨后在24、48 h表達水平下調(diào),在72 h表達水平小幅度上調(diào)后在96 h表達水平又下調(diào)(圖5a)。在希瓦氏菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表達水平也出現(xiàn)顯著下調(diào),從12 h開始表達水平開始上調(diào),在48 h表達水平達到最高,隨后在72 h表達水平開始下調(diào),96 h表達水平顯著下調(diào)(圖5b)。在假交替單胞菌組中,Ajβ-Thymosin基因在注射后4、12 h表達水平下調(diào),至24 h表達水平上調(diào)并達到峰值,48 h表達水平上調(diào)但是上調(diào)不顯著,在72、96 h表達水平均下調(diào)(圖5c)。在燦爛弧菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4、12、24 h均下調(diào),48 h表達水平顯著上調(diào)達到最高,隨即在72、96 h表達水平均下調(diào)(圖5d)。

3 討 論

抗菌肽具有廣譜抗菌作用,在非特異性免疫系統(tǒng)中占據(jù)著重要位置。在海參抗菌肽研究方面,Beauregard等[10]從冰島刺參(Cucumariafrondosa)體腔液中分離出一種可以抑制綠膿桿菌(Pseudomonasaruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生長的抗菌肽。王明昌[11]從仿刺參消化道內(nèi)分離出一種顯著抑制蛭弧菌的抗菌肽。筆者克隆了一種仿刺參抗菌肽Ajβ-Thymosin基因,通過序列結(jié)構(gòu)、組織、發(fā)育和免疫表達分析,探索Ajβ-Thymosin基因是否具有免疫活性并且參與機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.1 仿刺參β-胸腺素基因的序列特征

胸腺素廣泛地存在于脊椎動物和無脊椎動物中,目前發(fā)現(xiàn)至少存在15種β-胸腺素[12]。筆者在仿刺參中克隆得到了Ajβ-Thymosin基因,氨基酸序列為41個,分子質(zhì)量為4.6 ku,等電點為5.25,具有高度保守的G-actin結(jié)合序列LKKTET[9],這些特征均表明Ajβ-Thymosin基因?qū)儆讦?胸腺素家族的成員。通過進化分析發(fā)現(xiàn),仿刺參β-胸腺素和紫色球海膽、海綿和九孔鮑的β-胸腺素聚為一支。海膽(Paracentrotuslividus)中的β-胸腺素能夠和G-actin結(jié)合并參與機體抗菌免疫反應(yīng)[8]。仿刺參和海膽β-胸腺素都有相同的保守功能結(jié)構(gòu)域EVASFDKSKLK(9-19)[8],因此推測Ajβ-Thymosin基因中也具有免疫功能。

3.2 仿刺參β-胸腺素基因的功能分析

在仿刺參不同發(fā)育時期,免疫系統(tǒng)也處在一個動態(tài)發(fā)育的過程。Ajβ-Thymosin基因的表達量從小耳幼體期開始表達上調(diào)。小耳幼體期是仿刺參胚胎發(fā)育結(jié)束幼體發(fā)育的開始,此時消化道開始分化,免疫系統(tǒng)也開始形成,表明Ajβ-Thymosin基因在機體發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。

β-胸腺素在不同物種體內(nèi)具有組織表達特異性,在仿刺參體腔細胞中表達最高。這與β-胸腺素在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[13]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[14]、皺紋盤鮑(H.discusdiscus)[15]、九孔鮑[16]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]中的組織分布研究結(jié)果相似。由于體腔細胞、血淋巴細胞和血細胞在無脊椎動物中發(fā)揮免疫作用[13],因此推測Ajβ-Thymosin基因具有免疫活性。

β-胸腺素具有抗菌和抗病毒活性,許多研究發(fā)現(xiàn)病原體能夠引起β-胸腺素上調(diào)表達。在斑節(jié)對蝦[13]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[18]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[19]、長牡蠣(Crassostreagigas)[20]、皺紋盤鮑[15]、九孔鮑[16]、中華絨螯蟹[17]和卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[21]面對細菌、病毒或免疫刺激劑刺激時,β-胸腺素的相對表達量出現(xiàn)了不同程度上升。仿刺參受到4種不同病原菌刺激后,Ajβ-Thymosin基因的表達量在4 h均發(fā)生下調(diào)。有研究顯示,仿刺參體內(nèi)9個免疫相關(guān)基因在病原菌刺激后4 h的表達水平也均發(fā)生了下調(diào)[22-23],這表明仿刺參免疫系統(tǒng)中一些免疫因子在病原入侵初期會受到抑制。在蠟樣芽孢桿菌和希瓦氏菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在12 h開始上調(diào)。在假交替單胞菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在24 h開始上調(diào)。在燦爛弧菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在48 h開始上調(diào)。Ajβ-Thymosin基因開始上調(diào)表達的時間不同可能是由不同細菌的細胞毒性不同造成的。Ajβ-Thymosin基因的動態(tài)表達模式表明其參與了仿刺參體腔細胞免疫應(yīng)答的過程。

4 結(jié) 論

β-胸腺素作為一種抗菌肽,具有廣譜抗菌活性。Ajβ-Thymosin基因具有β-胸腺素家族成員特有并且高度保守的結(jié)構(gòu)域,參與了仿刺參機體發(fā)育和免疫防御過程,這將為新型抗菌肽研究和病害防控提供理論支持。