劉紅艷,熊 飛,翟東東,王 瑩,夏 明,陳元元

( 1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430056; 2.江漢大學(xué),持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430056 )

鲿科屬輻鰭魚綱真骨下綱鲇形目,為鲇形目中形態(tài)高度多樣化的類群之一[1],其種類繁多,分布廣,形態(tài)多樣,而且不斷地有鲿科新物種被發(fā)現(xiàn)[2-5],對魚類研究來說,精確的鑒定物種至關(guān)重要。傳統(tǒng)鑒定主要以形態(tài)特征為主要依據(jù),如可數(shù)性狀和可量性狀及一些解剖結(jié)構(gòu)特點。然而,傳統(tǒng)的魚類分類需要測量大量完整的標(biāo)本。有時,我們只能獲得少量的樣本或不完整的樣本,此外,形態(tài)相似的物種很難通過表型特征來區(qū)分,這些因素給鲿科物種鑒定帶來了較大的困難[6]。黃顙魚屬(Pelteobagrus)、擬鲿屬(Pseudobagrus)和屬(Leiocassis)的一些種的屬名已被修訂過多次[7-9],鲿科相似種的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍存在爭議。因此,選擇一種更為有效和便捷的魚類鑒定方法,對其分類和進化關(guān)系的研究是十分重要的。

DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、有足夠變異的、標(biāo)準(zhǔn)的、易擴增的并且相對較短的DNA片段,可以快速、準(zhǔn)確地進行物種鑒定[10-11],DNA條形碼已成為物種鑒定的重要工具[12]。線粒體DNA的COⅠ基因進化速率適中,并且引物通用性好,易于擴增,已經(jīng)成為物種快速、準(zhǔn)確鑒定的一個標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)簽[13-15]。

鲿科是魚類區(qū)系里的一個復(fù)雜分類單元。彭作剛等[16]以線粒體Cytb基因片段分析了部分鲿科魚類的系統(tǒng)分類關(guān)系,但一些鲿科魚類的歸屬問題仍未得到一致結(jié)論;梁宏偉等[17]用線粒體的COⅠ基因研究了部分鲿科魚類的分類關(guān)系,但涉及的物種較少。筆者通過對鲿科5屬36種魚類214條線粒體COⅠ基因序列進行分析,探討基于線粒體COⅠ基因作為DNA條形碼在鲿科魚類物種鑒定中的有效性,同時闡明其系統(tǒng)進化關(guān)系,以期為鲿科魚類的物種鑒定和系統(tǒng)分類提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2016—2018年于金沙江下游溪洛渡-向家壩庫區(qū)水域采集了黃顙魚(P.fulvidraco)、瓦氏黃顙魚(P.vachellii)、烏蘇里黃顙魚(P.ussuriensis)、凹尾擬鲿(P.emarginatus)和中臀擬鲿(P.medianalis)5種鲿科魚類樣本44尾。采集物種的形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)《中國動物志:硬骨魚綱 鲇形目》[1]和《四川魚類志》[18],每個樣品取其尾鰭和肌肉組織保存于95%乙醇中備用。另外從美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載31種鲿科魚類的COⅠ基因序列170條。共有鲿科魚類的5屬36種,214尾魚類樣本(表1)。

表1 研究所用樣本信息和GenBank登錄號Tab.1 Species information and GenBank accession numbers of COⅠ genes

1.2 DNA提取、PCR擴增和序列測定

鲿科魚類基因組DNA采用Foregene動物組織基因組試劑盒法進行提取,獲得的DNA用TE緩沖液溶解,存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增引物采用魚類COⅠ序列通用引物FishF1/FishR1和鲇形目魚類COⅠ序列特異性擴增引物CatF1/CatR1。Fish F1:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′￠;Fish R1:5′-TAG ACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′￠;Cat F1:5′-TCTCAACCAACCATAAAGACATTGG-3′;Cat R1:5′-TATACTTCTGGGTGCCCAAAGAATCA-3′￠。

PCR反應(yīng)總體積為50 μL:上、下游引物各1.0 μL (濃度為10 μmol/L),基因組DNA模板1.0 μL(約20 ng),滅菌蒸餾水22.0 μL,2×PCR mixture溶液25.0 μL。PCR 擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,之后進行35個循環(huán):94 ℃變性30 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s,最后再72 ℃延伸10 min。反應(yīng)在T100型PCR儀(BIO-RAD)上進行。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,判定PCR產(chǎn)物為目的條帶后,送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進行雙向測序,測得的序列提交至GenBank(MN660185～MN660228)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Chromas軟件查看測序波峰圖,將雙向測得的序列拼成一條完整的序列。使用MEGA 7.0軟件[19]中的Muscle程序?qū)λ械男蛄羞M行同源比對,進行序列的編輯和剪切,保留相同長度的同源序列用于后續(xù)遺傳分析。利用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計變異位點、堿基組成情況,基于K2P雙參數(shù)模型計算種內(nèi)、種間遺傳距離。利用ABGD軟件[20]確定物種的運算分類單元,采取默認(rèn)參數(shù)設(shè)置,選取K2P距離矩陣模型,計算物種的運算分類單元數(shù)。利用RAxMLv8.1.17軟件[21]構(gòu)建鲿科魚類的最大似然法系統(tǒng)進化樹,選取GTR+I+G替代模型,運行1 000 000代重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 COⅠ序列信息

筆者獲取了214尾鲿科魚類的形碼序列,包含鲿科5個屬,36個物種。經(jīng)過同源比對后,保留線粒體COⅠ基因的528 bp序列用于條形碼分析。所有COⅠ序列均未發(fā)現(xiàn)缺失、插入。A、T、C、G平均堿基組成分別為:A 24.7%、T 30.0%、C 27.7%、G 17.6%,平均堿基含量A+T(54.7%)高于C+G(45.3%)。在528 bp的COⅠ序列位點中,有456個不變位點和72個變異位點;變異位點中,有51個是轉(zhuǎn)換位點,21個是顛換位點。

2.2 遺傳距離分析

圖1 鲿科魚類種內(nèi)、種間遺傳距離頻率分布Fig.1 Histogram of genetic distance within species and between species

表2 鲿科魚類平均種內(nèi)遺傳距離和平均種間遺傳距離Tab.2 Mean intraspecific and interspecific genetic distances of Bagridae species

表3 種內(nèi)和種間最大和最小遺傳距離的條形碼間隙Tab.3 Barcoding gap of maximum and minimum intraspecific and interspecific genetic distances

2.3 運算分類單元分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

ABGD分析結(jié)果顯示,36個物種可分為25個運算分類單元(圖2、圖3),少于形態(tài)學(xué)分類的物種。瓦氏黃顙魚、長須黃顙魚、光澤黃顙魚、烏蘇里黃顙魚、短尾擬鲿、圓尾擬鲿、白邊擬鲿、粗唇擬鲿、長吻鮠9個物種被劃分為同一個運算分類單元,凹尾擬鲿和切尾擬鲿被劃分為同一個運算分類單元,中臀擬鲿、盎堂擬鲿和朝鮮擬鲿被劃分為同一個運算分類單元,大鰭半鲿和斑點半鲿被劃分為同一個運算分類單元,似威氏半鲿的S3和小頭半鲿被劃分為同一個運算分類單元。馬拉巴爾鳠和似威氏半鲿2個物種各自分為多個運算分類單元。其余的17個物種分別劃分為各自的運算分類單元。運算分類單元的劃分與距離法結(jié)果大體一致,種間遺傳距離較小的物種被劃分為同一個運算分類單元中,種內(nèi)遺傳距離較大的物種分化為2個運算分類單元。

圖2 ABGD劃分的鲿科魚類的操作分類單元Fig.2 Operational taxonomic units of Bagridae species defined by ABGD analysis

圖3 鲿科魚類ML系統(tǒng)發(fā)育樹與ABGD界定的運算分類單元Fig.3 ML tree constructed based on COⅠ gene sequences and OTU grouping analysis by ABGD softwareOTU.運算分類單元;節(jié)點上的數(shù)字表示支持率,標(biāo)尺代表遺傳距離單位0.05;歐洲巨鲇和大口鲇為外群;黑色形狀標(biāo)記的表示此物種與其他物種聚在一起,綠色突出顯示的表示幾個物種歸為1個運算分類單元,藍(lán)色突出顯示表示1個物種分化為多個運算分類單元.OTU. operational taxonomic unit; The values at the node were the bootstrap supporting; scale bar indicated the genetic distance; Silurus glanis and S. meridionalis was the outgroup; the black graphic marker represented the samples of species were converged to the sample of other species; the highlighted clusters in green indicated several species being categorized as one OTU, and the highlighted clusters in blue indicated one species being separated into several OTUs.

以歐洲巨鲇和大口鲇作為外群時,整個鲿科魚類形成1個單系群(圖3)。鲿科5個屬形成3個大的分支:分支Ⅰ包含黃顙魚屬、擬鲿屬和屬,這3個屬不能分別形成單系,而是個體之間相互混雜在一起,形成1大支;分支Ⅱ主要為半鲿屬魚類,但其中含有鳠屬的1個物種恒河鳠;分支Ⅲ主要為鳠屬魚類,但其中含有半鲿屬的1個物種絲鰭半鲿,表明半鲿屬與鳠屬之間存在不完全的譜系分選。

3 討 論

3.1 DNA條形碼在鲿科魚類鑒定中的適用性

不同物種的種間和種內(nèi)遺傳距離大小是物種鑒定的重要判別標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)種間最小變異超過種內(nèi)最大變異時,可以有效區(qū)分物種[22]。本研究中,鲿科魚類的種內(nèi)平均遺傳距離為0.016,種間平均遺傳距離為0.158, 種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的9.875倍,大多數(shù)鲿科物種的最小種間遺傳距離大于最大種內(nèi)遺傳距離,這些物種可以通過DNA條形碼進行有效識別。鲿科魚類最大種內(nèi)遺傳距離大于最小種間遺傳距離的7個物種不能形成條碼間隙,同樣,聚類樹中這些物種不能形成單系群,運算分類單元分析也表明這些物種不能形成各自的運算分類單元,因此,對這些遺傳上密切相關(guān)的鲿科物種進行條形碼鑒定存在局限性。

種內(nèi)遺傳距離最大的是似威氏半鲿,如此大的種內(nèi)遺傳距離是由該物種的樣本S3造成的。S3與S1之間的遺傳距離為0.183,S3與S2之間的遺傳距離為0.192,S3可能被錯誤地識別為似威氏半鲿。馬拉巴爾鳠的種內(nèi)最大遺傳距離達(dá)到0.122,聚類樹和運算分類單元結(jié)果均顯示,馬拉巴爾鳠分化為2個明顯的分支,2個分支內(nèi)的遺傳距離比較小(0～0.004),而2個分支間的遺傳距離比較大(0.117～0.122),這可能是隱存種的信號[23],由于隱存種形態(tài)十分相似,根據(jù)外部特征不能把它們區(qū)分開來,但在分子水平上表現(xiàn)出異質(zhì)性[24-25],因此條形碼相對于傳統(tǒng)生物鑒定的優(yōu)勢在于可以揭示隱存種的存在。長須黃顙魚、光澤黃顙魚、切尾擬鲿、圓尾擬鲿、白邊擬鲿、粗唇擬鲿種內(nèi)與種間遺傳距離有一定的重疊,可能是由這些物種間的遺傳變異較小造成的,聚類樹也揭示了這些物種聚在一起,可以用快速物種形成事件來解釋,原因可能是黃顙魚屬、擬鲿屬某些現(xiàn)存物種是在過去短時間內(nèi)快速分化而來的,這些物種可能還沒有積累足夠多的堿基變異[26-27]。

3.2 鲿科魚類系統(tǒng)進化的DNA條形碼分析

彭作剛等[16]認(rèn)為半鲿屬是單系群,而曾慶等[29,31]認(rèn)為半鲿屬是非單系類群,為多源起源類群。本研究結(jié)果顯示,8種半鲿屬魚類聚在一起,但絲鰭半鲿卻與鳠屬魚類聚在一起,本研究結(jié)果支持半鲿屬為非單系起源類群?！端拇~類志》[18]將大鰭半鲿和斑點半鲿歸為鳠屬,而陳海港等[32]隨后將其歸于半鲿屬。本研究中,這2個物種與半鲿屬魚類聚成一支,因此筆者認(rèn)為它們應(yīng)該歸屬于半鲿屬,有效名稱應(yīng)為Hemibagrusmacropterus、Hemibagrusguttatus。de Pinna等[7,32]認(rèn)為,鳠屬為單系類群,但曾慶等[29,31]認(rèn)為鳠屬為非單系類群。本研究中,恒河鳠與半鲿屬魚類聚在一起,因此,筆者認(rèn)為鳠屬并非單系類群,半鲿屬與鳠屬之間存在不完全的譜系分選現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

本研究中,大部分鲿科物種可以形成條碼間隙,基于COⅠ基因的DNA條形碼可以有效識別這些物種,但對一些近緣種,條形碼鑒定存在局限性。此外,筆者也進行了鲿科魚類系統(tǒng)進化分析,黃顙魚屬、擬鲿屬和屬的魚類聚成1個大的單系群,支持將這3個屬合并為1個屬。半鲿屬和鳠屬并非單系類群,這2個屬之間存在不完全的譜系分選現(xiàn)象。鲿科在屬的劃分上一直比較混亂,可能是選取了不恰當(dāng)?shù)男螒B(tài)特征作為分類依據(jù)。因此,對鲿科魚類近緣種及分類關(guān)系混亂的物種,有待根據(jù)形態(tài)及DNA條形碼和多種分子標(biāo)記輔助鑒定進行系統(tǒng)而詳細(xì)的修訂。