邢秀梅,沈銘浩,李 杰,寧先會(huì),張 凱, 尹紹武

( 1.南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心,江蘇 南京 210023; 2.南京市高淳區(qū)青松水產(chǎn)專業(yè)合作社,江蘇 南京 211300 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目方蟹科絨螯蟹屬,又名河蟹、大閘蟹[1]。中華絨螯蟹因含有礦物質(zhì)元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和膽固醇等多類營養(yǎng)物質(zhì)而深受長江流域居民喜愛,其肌肉中蛋白質(zhì)品質(zhì)高且肌苷酸的含量豐富,雄蟹性腺中更是包含25種脂肪酸[2]。近年來,我國中華絨螯蟹的種業(yè)保護(hù)措施較薄弱,加上無序引種和苗種盲目放流,導(dǎo)致種質(zhì)混雜和退化,嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展[3-4]。國外水產(chǎn)選育多以種業(yè)企業(yè)為主體,投入大、效果顯著;國內(nèi)則以科研單位為主,這樣會(huì)造成產(chǎn)業(yè)集中度低、良種化水平和覆蓋率均較低、苗種質(zhì)量不穩(wěn)定等一系列問題[5]。因此,對種業(yè)的投入和育種技術(shù)的突破刻不容緩。

2021年中央一號(hào)文件指出,“打好種業(yè)翻身仗。農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化,種子是基礎(chǔ)……加強(qiáng)國家作物、畜禽和海洋漁業(yè)生物種質(zhì)資源庫建設(shè)……有序推進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用”[6]。目前已成功選育出中華絨螯蟹“長江1號(hào)”(GS-01-003-2011)、“光合1號(hào)”(GS-01-004-2011)、“長江2號(hào)”(GS-01-004-2013)、“江海21號(hào)”(GS-02-003-2015)和“諾亞1號(hào)”(GS-01-005-2016)共5個(gè)新品種,推動(dòng)了中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。但隨著市場競爭的日益激烈及產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展,現(xiàn)有品種遠(yuǎn)不能滿足中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求。此外,目前中華絨螯蟹新品種的選育方法為傳統(tǒng)的選擇育種,難以避免出現(xiàn)遺傳漂變、混雜衰退等問題[7]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展,為中華絨螯蟹遺傳育種提供了新的途徑,將現(xiàn)代分子育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)結(jié)合,可提高育種效率、完善性狀評價(jià)體系。此外,中華絨螯蟹高質(zhì)量基因組和遺傳圖譜的相繼公布,也為其現(xiàn)代分子育種奠定了基礎(chǔ)。

1 中華絨螯蟹傳統(tǒng)育種方法與現(xiàn)狀

1.1 選擇育種

選擇育種是一種傳統(tǒng)有效的新品種培育方法,通過對群體的反復(fù)選擇淘汰、優(yōu)中選優(yōu),培育出符合選育目標(biāo)的優(yōu)良個(gè)體[8]。該方法能夠分離并固定優(yōu)良性狀,保留有益的變異,提高中華絨螯蟹的經(jīng)濟(jì)性狀,提純和復(fù)壯其品種[9]。中華絨螯蟹的選育主要有群體選育、配套系選育和家系選育等。群體選育是挑選表現(xiàn)型優(yōu)良的中華絨螯蟹群體作為基礎(chǔ)群,逐代根據(jù)生長速度、體型特征、抗逆性等選育指標(biāo)選種選配[10]。迄今為止,已通過群體選育培育出了4個(gè)新品種(中華絨螯蟹“長江1號(hào)”、“長江2號(hào)”、“光合1號(hào)”、“諾亞1號(hào)”)。配套系育種是將擁有某種經(jīng)濟(jì)性狀和遺傳特性的品系或選育系進(jìn)行配組繁育,聚合培育出具有父本和母本優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的一種育種方法,中華絨螯蟹“江海21號(hào)”為國內(nèi)首例中華絨螯蟹配套系新品種[11]。吳廉等[12]比較了正、反交兩個(gè)配套組合與親本群體的遺傳多樣性后,發(fā)現(xiàn)配套系育種可以聚合選育系的優(yōu)良性狀,提高種群遺傳多樣性及環(huán)境適應(yīng)能力。家系選育是通過建立大規(guī)模家系并開展系統(tǒng)性選擇的一種育種方法,已廣泛應(yīng)用于多種甲殼類動(dòng)物遺傳育種中[13-14]。2008年江蘇省淡水水產(chǎn)研究所成功突破長江水系大規(guī)格中華絨螯蟹家系構(gòu)建,并不斷改進(jìn)技術(shù),于2017年選擇長江水系中華絨螯蟹不同群體的大規(guī)格親蟹構(gòu)建ES-P2017家系,成功定向構(gòu)建全同胞家系96個(gè),家系構(gòu)建成功率達(dá)96.00%[15-16]。劉偉等[17]通過建立10個(gè)長江系中華絨螯蟹家系,進(jìn)行系統(tǒng)選擇育種,經(jīng)過LSD多重比較得出不同家系生長性能差異顯著的結(jié)論,為中華絨螯蟹家系選育奠定了理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段中華絨螯蟹選擇育種技術(shù)體系已經(jīng)較為成熟,選育效果顯著,應(yīng)用推廣成果突出。

1.1.1 群體選擇與選育指標(biāo)

目前選育成功的新品種均采用選擇育種方法。中華絨螯蟹“長江1號(hào)”是以2000年從國家級(jí)江蘇高淳固城湖中華絨螯蟹原種場收集1000組體形特征標(biāo)準(zhǔn)、健康無病的長江水系原種中華絨螯蟹作為基礎(chǔ)群體,以生長速度和個(gè)體規(guī)格為選育指標(biāo),連續(xù)5代群體選育而成的[4]。 中華絨螯蟹“長江2號(hào)”是以2003年從荷蘭引回的萊茵河水系中華絨螯蟹作為基礎(chǔ)群體,將生長速度、個(gè)體規(guī)格、形態(tài)特征作為選育指標(biāo),通過連續(xù)5代群體選育而成的[4]。中華絨螯蟹“光合1號(hào)”是將來自鴨綠江、遼河、海河、黃河4個(gè)不同地理群體的遼河水系中華絨螯蟹組建基礎(chǔ)群體,以體質(zhì)量和規(guī)格為主要選育指標(biāo),以外觀形態(tài)為輔助選育指標(biāo),經(jīng)過連續(xù)5代選育而成的具有成活率高、抗逆性強(qiáng)、生長速度快等標(biāo)志性狀的中華絨螯蟹新品種[18]。中華絨螯蟹“諾亞1號(hào)”是以2004年挑選的體型健壯、附肢齊全、活力強(qiáng)、性腺發(fā)育良好、背甲淡青色的689只野生親蟹構(gòu)建選育基礎(chǔ)群體,其中雌蟹365只、雄蟹324只,組建保種核心群體,開展定向?qū)Ρ确敝撑嘤傻腫19]。中華絨螯蟹“江海21號(hào)”是以2004年和2005年從長江干流南京江段采捕的野生中華絨螯蟹、從國家級(jí)江蘇高淳長江水系中華絨螯蟹原種場和國家級(jí)安徽永言中華絨螯蟹原種場收集的保種群體,構(gòu)建基礎(chǔ)群體,以生長速度、步足長和額齒尖為選育指標(biāo),連續(xù)4代選育而成的[20]。除中華絨螯蟹 “長江2號(hào)”[21]外,所有新品種的基礎(chǔ)群體均來自長江、遼河水系。中華絨螯蟹“長江2號(hào)”通過引種馴化,選育效果勝過“長江1號(hào)”,定向改造了中華絨螯蟹的區(qū)系組成,提高質(zhì)量和產(chǎn)量,充實(shí)育種材料。并且新品種的選育指標(biāo)也早已不局限于生長速度和個(gè)體規(guī)格,開始出現(xiàn)具有高辨識(shí)度的形態(tài)特征。

1.1.2 選育效果評估

通過選擇育種,中華絨螯蟹“長江1號(hào)”生長速度快,2齡成蟹生長速度提高16.7%;形態(tài)特征明顯,背甲寬大于背甲長,呈橢圓形,體型好;規(guī)格整齊,雌、雄體質(zhì)量變異系數(shù)均小于10%[22]。中華絨螯蟹“長江2號(hào)”生長速度提高約19.4%,平均個(gè)體規(guī)格增加約18.5%;成蟹養(yǎng)殖群體規(guī)格整齊,雌雄體質(zhì)量變異系數(shù)均小于10%,遺傳性狀穩(wěn)定[21]。中華絨螯蟹“光合1號(hào)”規(guī)格大,成活率高;背甲寬度(額寬、第一側(cè)齒寬)較長、背甲厚度(體高)較高,第4步足較短,多態(tài)位點(diǎn)比例降低了2.58%,遺傳性狀穩(wěn)定[23]。中華絨螯蟹“諾亞1號(hào)”體型健壯、附肢齊全、活力強(qiáng)、性腺發(fā)育良好;有4個(gè)額齒尖,額齒間缺刻深,內(nèi)額齒間缺刻呈“U”型;生長速度提高19.86%,雄蟹200 g以上比例逾56%,300 g以上比例超過10%;雌蟹150 g以上比例逾42%,200 g以上比例超過12%[19]。中華絨螯蟹“江海21號(hào)”生長快、規(guī)格大、產(chǎn)量高;步足長、成活率高、遺傳穩(wěn)定等;生長速度提高17.8%以上,雌蟹150 g、雄蟹200 g以上的大規(guī)格比例可超過50%[20]。由此可見,新品種選育成效顯著,適合應(yīng)用推廣。

1.2 雜交育種

雜交育種一般指不同品系、品種間,甚至種間、屬間或亞科間個(gè)體的交配[23]。利用雜交優(yōu)勢,能夠獲得生長速度、抗病性、品質(zhì)等養(yǎng)殖性狀優(yōu)于雙親的中華絨螯蟹新品種,或使后代獲得遺傳改良,在品種改良以及生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)揮作用,是一種基礎(chǔ)有效的育種途徑[24]。目前,研究人員已在中華絨螯蟹雜交育種領(lǐng)域進(jìn)行了一系列嘗試。彭武漢[25]將中華絨螯蟹分別與“珠江毛蟹”(中華絨螯蟹)、日本絨螯蟹(E.japonica)雜交,均能培育出幼蟹,觀察發(fā)現(xiàn)雜交子代的前緣齒及側(cè)齒存在不同程度的變異。此外唐士橋等[26]將綏芬河水系日本絨螯蟹與遼河水系中華絨螯蟹進(jìn)行雜交試驗(yàn),所獲得的雜交一代側(cè)缺刻較淺,中缺刻呈V形,后疣突不明顯,沒有明顯的雜種優(yōu)勢,可正常繁育后代。吳旭干等[27-28]將日本絨螯蟹及其雜交子代性腺發(fā)育和生化組成以及遺傳多樣性進(jìn)行了比較分析,結(jié)果表明,絨螯蟹屬不同種間是可雜交的。雖然以上研究尚未發(fā)現(xiàn)具有明顯優(yōu)良性狀的中華絨螯蟹雜交品種,但為絨螯蟹屬的種間雜交提供了實(shí)踐基礎(chǔ),隨著對中華絨螯蟹潛在經(jīng)濟(jì)性狀的挖掘,較為成熟的雜交育種技術(shù)能更直接地將性狀保留下來。

2 中華絨螯蟹現(xiàn)代育種方法與現(xiàn)狀

我國中華絨螯蟹育種方式正將傳統(tǒng)的選育方法與現(xiàn)代分子遺傳學(xué)手段相結(jié)合,進(jìn)行現(xiàn)代育種方式有細(xì)胞工程育種、分子標(biāo)記輔助育種等。

2.1 細(xì)胞工程育種

細(xì)胞工程育種技術(shù)研究目前主要集中在中華絨螯蟹多倍體育種以及性別控制方面。多倍體育種是通過物理、化學(xué)以及生物學(xué)方法,增加中華絨螯蟹的染色體組至3組及3組以上,改造其遺傳基礎(chǔ),從而培育出個(gè)體大、生長快、抗病力強(qiáng)、成活率高的優(yōu)良品種[29]。實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)是多倍體育種的第一步,但中華絨螯蟹的抱卵特性使受精卵離體培養(yǎng)十分困難[30]。李泰煌等[31-32]以“殺蟹取卵”的人工授精法成功實(shí)現(xiàn)了中華絨螯蟹受精卵的體外培養(yǎng);邱高峰等[33-35]已攻克抱卵及體外孵化的難題。體外培養(yǎng)技術(shù)的突破為中華絨螯蟹多倍體育種奠定了基礎(chǔ)。陳立僑等[36-37]利用細(xì)胞松馳素B處理法誘導(dǎo)出三倍體和四倍體中華絨螯蟹,誘導(dǎo)率高達(dá)51.61%和57.89%,這是中華絨螯蟹多倍體育種的首次報(bào)道,證明了多倍體育種技術(shù)應(yīng)用于中華絨螯蟹的可行性。崔朝霞等[38]改進(jìn)方法,運(yùn)用細(xì)胞松弛素B、KCl等化學(xué)藥物處理中華絨螯蟹,獲得77.5%的三倍體率和79.8%的四倍體率。但其采用的方法是直接處理含受精卵的母體,未運(yùn)用體外培養(yǎng)技術(shù)。綜上可知,目前中華絨螯蟹的多倍體誘導(dǎo)雖有成功的案例,但其成活率低,且因試劑價(jià)格高昂,難以大規(guī)模推廣。細(xì)胞工程育種的突破主要圍繞誘導(dǎo)技術(shù)的開發(fā)以及存活率的保證,多倍體在其他水產(chǎn)生物中的優(yōu)勢若能呈現(xiàn)于中華絨螯蟹中,在個(gè)體的生長性狀或是群體的種質(zhì)保護(hù)上都具有重大意義。

2.2 分子標(biāo)記輔助育種

分子標(biāo)記輔助育種是利用與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記,對具有性狀優(yōu)勢的等位基因或基因型的個(gè)體進(jìn)行選擇育種,將分子生物學(xué)、基因組學(xué)的研究結(jié)果用于品種選育的技術(shù)[39-40]。它能在DNA水平上進(jìn)行選擇,并且選擇的準(zhǔn)確性較高,不受環(huán)境影響,大大縮短育種周期。在中華絨螯蟹遺傳育種研究中廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記為微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性分子標(biāo)記。

近年來,微衛(wèi)星標(biāo)記由于其多態(tài)性好、雜合率高和共顯性遺傳等特點(diǎn),被廣泛開發(fā)和應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建[41]、遺傳多樣性分析[42]和物種鑒定[43]等方面。熊良偉等[44]利用60個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對中華絨螯蟹F1群體的雙親及其子代進(jìn)行多態(tài)性檢測,并進(jìn)行了親子遺傳分離類型及連鎖關(guān)系分析,成功構(gòu)建了中華絨螯蟹遺傳連鎖圖譜。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建是開發(fā)分子標(biāo)記的一個(gè)重要環(huán)節(jié),為中華絨螯蟹的分子標(biāo)記輔助育種提供服務(wù)。吳滟等[45]從30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中成功篩選出與中華絨螯蟹生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,有望應(yīng)用于輔助選育。

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記為第3代分子標(biāo)記,在有關(guān)中華絨螯蟹單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的研究中,Xiao等[46]從轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)驗(yàn)證了42個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),給中華絨螯蟹的遺傳多樣性分析和選擇育種方案提供了理論方向;Qiu等[47]通過SLAF-seq技術(shù)鑒定到127 677個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),并且將其中的17 680個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)定位于染色體上,構(gòu)建了中華絨螯蟹的首張單核苷酸多態(tài)性連鎖圖譜,在研究某一經(jīng)濟(jì)性狀時(shí)可以尋獲與其關(guān)聯(lián)或有作用關(guān)系的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),為中華絨螯蟹分子標(biāo)記輔助育種提供了重要依據(jù)。

近年來開發(fā)性別標(biāo)記、構(gòu)建高密度遺傳圖譜等已成為中華絨螯蟹性別決定及分化機(jī)制研究的手段[48-49]。Cui等[50]利用高密度遺傳連鎖圖譜揭示中華絨螯蟹性別決定機(jī)制為ZW/ZZ型。崔朝霞等[51]公開了1種鑒定中華絨螯蟹性別的特異性分子標(biāo)記,通過對中華絨螯蟹的雌性、雄性基因組重測序數(shù)據(jù)比對,篩選雌性特異性片段,經(jīng)過篩選得到2對引物8227-F1&R1和8227-F23&R23。2對引物均可根據(jù)電泳條帶結(jié)果表明雌雄差異,即只有雌性擴(kuò)增產(chǎn)物能夠產(chǎn)生特異性條帶,據(jù)此成功對中華絨螯蟹進(jìn)行性別鑒定。陳曉雯等[52]通過中華絨螯蟹雄性特異Etse基因片段標(biāo)記進(jìn)行中華絨螯蟹性別鑒定,電泳結(jié)果顯示,雄性擴(kuò)增產(chǎn)物有1條特異性條帶,雌性擴(kuò)增產(chǎn)物沒有特異性條帶,實(shí)現(xiàn)了中華絨螯蟹的性別鑒定,用于滿足定向生產(chǎn)需求。

3 展望及對策

目前我國通過傳統(tǒng)的選擇育種培育出了5個(gè)中華絨螯蟹新品種,仍需進(jìn)一步優(yōu)化肥滿度、成活率等選育指標(biāo),關(guān)注不同行為學(xué)特點(diǎn)(如好斗與溫和)、營養(yǎng)品質(zhì)、不同環(huán)境適應(yīng)能力等性狀。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展,需要在全基因組選擇育種、單性育種和基因編輯育種等方面實(shí)現(xiàn)突破和攻關(guān):

(1)開展全基因組選擇育種研究。隨著中華絨螯蟹全基因組信息的相繼破譯,快速選擇優(yōu)良基因型的全基因組關(guān)聯(lián)研究將成為其育種的新方向。而近年中華絨螯蟹病害頻發(fā),嚴(yán)重影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展,因此,對中華絨螯蟹抗病相關(guān)基因及其功能的研究是防控其重大疾病(白斑病、肝胰腺壞死病、牛奶病、甲殼潰瘍病等)的重要基礎(chǔ)工作?？梢酝ㄟ^構(gòu)建抗病中華絨螯蟹家系,在全基因組水平上實(shí)現(xiàn)抗病分子標(biāo)記輔助育種,挖掘抗病性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記,從而選育出抗病中華絨螯蟹新品種。

(2)加強(qiáng)性別控制和單性育種研究。進(jìn)一步研究中華絨螯蟹性別遺傳特性和性別決定機(jī)制,探索其單性(全雌和全雄)育種的路徑和可行性,為后續(xù)中華絨螯蟹單性育種打下基礎(chǔ)。

(3)建立中華絨螯蟹基因編輯技術(shù)平臺(tái)用于育種。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是未來中華絨螯蟹育種的方向。將基因編輯應(yīng)用于實(shí)際育種還有許多難點(diǎn)需要攻克,如從蟹類中找到有效遞送基因編輯原件Cas9和sgRNA的方法、尋找調(diào)控優(yōu)良性狀或高抗逆性具有遺傳效應(yīng)的基因等。鑒于部分水生甲殼動(dòng)物[如脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicavda)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等][53-55]基因編輯技術(shù)的初步成功,對今后建立中華絨螯蟹基因編輯技術(shù)平臺(tái)提供了參考,為提高育種效率、優(yōu)化種質(zhì),最終實(shí)現(xiàn)中華絨螯蟹的基因編輯育種提供了方向。

目前制約中華絨螯蟹遺傳育種的關(guān)鍵技術(shù)是育種材料的保存與評估技術(shù)。今后,應(yīng)加快建立中華絨螯蟹種質(zhì)資源庫,增設(shè)中華絨螯蟹原種場,采取活體保種與DNA樣本保存相結(jié)合的方式,充實(shí)育種材料;針對不同性狀的評價(jià)方法,建立一套精準(zhǔn)的適合中華絨螯蟹表型測定方法,貫穿從育種材料選擇和保存、親本選配到新品種育成整個(gè)過程。