高鋮鋮，燕麗萍，吳德軍，王因花

（山東省林業(yè)科學研究院 山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014）

白蠟屬Fraxinusspp.又稱為梣屬，該屬樹種統(tǒng)稱為白蠟，屬于木犀科Oleceae 木犀亞科Oleoideae，全世界約70 種，我國約30 種，其中有10 余種從國外引進[1-2]。作為我國北方鹽堿地主要造林樹種和先鋒樹種，該屬樹種主要分布在我國東北地區(qū)、西北地區(qū)、黃河流域和長江流域，四川、廣東和福建等省份也有分布，垂直分布海拔在400～2 000 m[3-4]。白蠟大多數(shù)喜光或稍耐陰，因生長迅速、樹齡較長、成長繁殖快、適應性強、抗性強、樹木材質(zhì)較好等優(yōu)點備受青睞，是我國北方地區(qū)用來防風固沙和鹽堿地改造的優(yōu)良樹種[5]。因此，綜合研究白蠟的種質(zhì)資源情況，對其耐鹽性價值進行深入分析和挖掘，對鹽堿地區(qū)林業(yè)建設具有重要意義。近年來，由于白蠟廣泛栽培的復雜性和試驗條件的局限性，目前對白蠟種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結構的研究還十分不足，嚴重制約著對白蠟耐鹽性資源有效保護和利用的科學認識。

隨著分子生物技術的發(fā)展，基于分子標記的遺傳學分析能夠解決表型和生理生化指標受環(huán)境和顯隱性基因影響這一難題，從而更好地評估群體的遺傳多樣性[6]。SSR（Simple sequence repeats）即為簡單重復序列，又稱為微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），通常是由1～6 個堿基為基元經(jīng)過多次重復串聯(lián)構成的DNA 序列，因在基因組中具有共顯性、多等位基因、多態(tài)性等優(yōu)點，已被普遍應用于林木遺傳學研究[7-9]，但針對白蠟屬遺傳多樣性的研究較少。燕麗萍等[3]應用SSR熒光標記技術對202 份白蠟種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行研究，構建出40 份核心種質(zhì)，以期為白蠟早期選擇提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎；鄭鵬麗等[10]利用6 對cpSSR 分子標記探討對節(jié)白蠟Fraxinus hupehensis10 個自然居群的遺傳多樣性水平，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性處于中等水平且變異多發(fā)生于居群內(nèi)；Abbate 等[11]通過cpSSR 和nSSR 評估瀕危白蠟樹種Fraxinus“mannaash”的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)用于甘露聚糖生產(chǎn)的該種質(zhì)屬于尖果梣Fraxinus angustifoliaVahl.，西西里島可能存在一個冰川避難所。鑒于此，本研究通過評估12 對核心SSR 引物在白蠟屬中的多態(tài)性和通用性，對北方9 個較具代表性的白蠟居群進行遺傳多樣性分析，進一步認識其遺傳組成和群體結構，以期為保護和利用白蠟種質(zhì)資源提供有效的科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013—2019 年，課題組在全國收集白蠟種子和枝條，在山東省林業(yè)科學研究院壽光鹽堿地造林試驗站播種、嫁接繁育，建立種質(zhì)資源圃。

于春季采集白蠟當年生嫩葉，用變色硅膠干燥，帶回實驗室后放入超低溫冰箱中-80 ℃下保存，以備后續(xù)試驗。以380 份白蠟種質(zhì)資源為材料，其中北京29 份、甘肅17 份、河北68 份、遼寧49 份、內(nèi)蒙古28 份、寧夏52 份、山東70 份、山西24 份、陜西43 份，具體來源地信息見表1。

表1 白蠟來源地信息Table 1 Information on the origin of Fraxinus spp.

1.2 總DNA 的提取與SSR 引物篩選

采用TIANGEN 植物基因組DNA 提取試劑盒提取白蠟葉片基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。測定DNA 的純度和濃度采用紫外分光光度法，稀釋并在-20 ℃下冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

從已經(jīng)發(fā)表的白蠟引物中篩選多態(tài)性良好的標記用于遺傳多樣性分析（由山東沃恩科技有限公司合成）[3]。熒光引物PCR 擴增體系：2×Mix10 μL，10 μM 的F/R0.15 μL，DNA 原液1 μL，加ddH2O 補足20 μL。熒光引物PCR 擴增程序：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。

采用毛細管電泳上機檢測法，取PCR 產(chǎn)物0.3 μL、分子量內(nèi)標（LIZ500）0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR 板中，95 ℃下變性5 min，4 ℃下冷卻后離心，1×Buffer 緩沖液上機檢測。

1.3 SSR 分析與數(shù)據(jù)處理

將毛細管電泳上機結果的原始文件導入Genemarker 2.2.0，按位點導出峰圖和Excel 位點信息表。讀取DNA 樣品擴增的產(chǎn)物序列大小，采用GenAlEx 6.51 計算等位基因數(shù)量(Na)、有效等位基因數(shù)量(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、群體近交系數(shù)(Fit)、群體分化率(Fst)和基因流(Nm)，采用PowermarkerV3.25 軟件計算多態(tài)性信息含量(PIC)和Nei’s 多樣性指數(shù)(H)，GenAlEx 6.51 也用于AMOVA 分析、PCoA 分析和Mantel 檢驗。采用Powermarke V3.25 軟件對白蠟群體結構進行UPGMA 聚類分析，繪制UPGMA 樹并導出到iTOL 在線工具進行美化和編輯。群體結構分析采用Structure 2.3.4 軟件估測，根據(jù)似然值最大原則，結合ΔK值確定一個合適的K值，確定該群體的亞群體數(shù)目，計算每份材料屬于各亞群的概率（即Q值）。

2 結果與分析

2.1 SSR 分子標記多態(tài)性

提取白蠟葉片基因組DNA 后在紫外分光光度計上測定OD 值，OD260/OD280為1.8～2.0，表明DNA 較純，可以進行擴增（圖1）。從42 對SSR引物中篩選出12 對擴增穩(wěn)定、特異性好、多態(tài)性強的分子標記（圖2），篩選出的引物信息見表2。

圖1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis results

圖2 部分SSR 引物篩選的毛細電泳圖譜Fig.2 The electrophoresis for some screened SSR primers

表2 12 對引物信息Table 2 12 pairs of primers

12 對SSR 引物擴增出的序列遺傳多態(tài)性指數(shù)如表3 所示，擴增出的序列觀察到Na共51 個，平均每對引物觀察到4.287 個等位基因；Ne共28.410 個，范圍在1.173～3.718，平均為2.368個；I為0.241～1.541，平均值為0.961，說明遺傳提供的信息度高；PIC 為0.119 7～0.750 9，平均為0.532 9，高于0.5，說明遺傳標記的多態(tài)性高；Ho為0.112～0.943，平均為0.526；He為0.123～0.721，平均為0.518；H為0.123 4～0.772 3，平均為0.576 0?？梢钥闯鲞@些SSR 分子標記多態(tài)性良好，能夠有效分析遺傳多樣性。

表3 12 個SSR 標記的多態(tài)性分析Table 3 Polymorphic analysis of the 12 SSR markers

2.2 白蠟居群遺傳分化

由表3 可以看出，F(xiàn)is中4 個位點為負，總體平均為0.016，顯示雜合頻率高，地方居群的近交較多；Fit中4 個位點為負，總體平均為0.091，顯示雜合頻率高，整個居群的近交較多；Fst中2個位點顯示居群間有較高的遺傳分化水平（0.15 ＜Fst＜0.25），其余的位點則表明居群間遺傳分化程度較低（Fst＜0.15），平均為0.095，白蠟各居群整體的遺傳分化水平較低。Nm中1 個位點小于1，其余位點大于等于1，平均為4.199，說明各位點反映出居群間基因交流非常豐富。

2.3 白蠟居群遺傳多樣性與遺傳結構

基于SSR 標記分析的白蠟各居群的遺傳多樣性指數(shù)如表4 所示，白蠟9 個居群Na為3.167～5.250，平均為4.287；Ne為2.016～2.983，平均為2.367；I為0.746～1.209，平均為0.961，其中I最高的白蠟居群是山東，表明該居群內(nèi)遺傳多樣性比較最為豐富；Ho為0.397～0.620，平均為0.526，He為0.423～0.641，平均為0.518，僅2個居群的Ho小于He，說明群體各居群內(nèi)雜合子個體較多。其中，Na、Ne和I指標均以北京、山東、陜西居群的最大，山西居群的最小。遺傳多樣性分析表明白蠟居群整體遺傳多樣性水平較高。

表4 白蠟居群遺傳多樣性指數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of Fraxinus spp.

AMOVA 分析結果（表5）顯示，9%的變異來自居群間，屬于較低程度的遺傳分化水平，91%的變異來自個體間，為主要變異來源，這與白蠟居群遺傳分化分析和遺傳多樣性分析結果基本一致。

表5 白蠟居群遺傳變異的 AMOVA 分析Table 5 AMOVA analysis for genetic variation of Fraxinus spp.

2.4 白蠟居群UPGMA 聚類與PCoA 分析

基于Nei’s 遺傳距離，利用UPGMA 方法對來自9 個居群的380 份白蠟種質(zhì)進行聚類分析，結果如圖3 所示。亞群1 共7 份，包含河北1 份、遼寧1 份、內(nèi)蒙古2 份、寧夏2 份、山西1 份；亞群2 共40 份，包含甘肅2 份、河北12 份、遼寧3 份、內(nèi)蒙古10 份、寧夏8 份、陜西5 份；亞群3 共333 份，包含北京29 份、甘肅15 份、河北55 份、遼寧45 份、內(nèi)蒙古16 份、寧夏42 份、山東70 份、山西23 份、陜西38 份。

圖3 基于12 個SSR 標記的380 份白蠟種質(zhì)資源遺傳關系的進化樹Fig.3 Dendrogram of the genetic relationship among 380 Fraxinus spp.germplasm resources based on 12 SSR markers

根據(jù)Nei’s 遺傳距離，對9 個白蠟居群構建UPGMA 遺傳關系聚類圖，結果如圖4 所示。不同地區(qū)的白蠟居群被分為三大類，其中，北京和山東地區(qū)被聚為一類，甘肅地區(qū)單獨一類，河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏、山西、陜西地區(qū)被聚為一類。將9 個居群間遺傳距離矩陣與地理距離矩陣進行Mantel 檢驗，結果如圖5 所示。遺傳距離與地理遺傳距離相關性的r值為0.044，顯著性水平P值為0.460，則說明不同居群白蠟間的遺傳距離與地理距離不相關（P＞0.05）。上述結果表明，白蠟自然居群的地理分布和遺傳距離之間沒有呈現(xiàn)出顯著的聯(lián)系，距離相近的地區(qū)并沒有被優(yōu)先聚為一類，且存在距離較遠的地區(qū)被聚為一類的現(xiàn)象。

圖4 不同白蠟居群間遺傳關系聚類分析Fig.4 Dendrogram of UPGMA analysis of 9 Fraxinus spp.Populations

圖5 9 個白蠟居群間遺傳距離與地理距離的Mantel 檢驗Fig.5 Mantel test of the genetic distance and geographical distance among 9 populations of Fraxinus spp.

380 份白蠟種質(zhì)的PCoA 分析結果（圖6）顯示，PCoA1 和PCoA2 分別占所有白蠟種質(zhì)總遺傳變異的23.95%和10.86%。PCoA 分析結果與UPGMA聚類分析的結果基本一致。

圖6 基于12 個SSR 標記的380 份白蠟種質(zhì)資源的主坐標分析（PCoA）Fig.6 Principal coordinate analysis (PCoA) of the 380 Fraxinus spp.germplasm resources based on 12 SSR markers

2.5 白蠟居群群體結構

為了揭示380 份白蠟種質(zhì)的群體結構，基于貝葉斯方法分析了來自不同地理分布的9 個居群群體的遺傳結構，其中推定的種群數(shù)量（基因庫）用K值表示。采用Structure 2.3.4 軟件對該自然群體進行群體遺傳結構分析，計算每份材料的Q值。結果顯示對數(shù)似然函數(shù)值L’(K)在K=3 時有明顯的峰值（圖7），表明該自然群體的適宜亞群數(shù)被劃分為3 類，各類亞群材料數(shù)量分別為261、77、42 和30 份。其中，亞群Ⅰ包含北京3 份、甘肅10 份、河北68 份、遼寧48 份、內(nèi)蒙古23 份、寧夏49 份、山東1 份、山西24 份、陜西35 份；亞群Ⅱ包含北京23 份、遼寧1 份、內(nèi)蒙古3 份、寧夏2 份、山東48 份；亞群Ⅲ包含北京3 份、甘肅7 份、內(nèi)蒙古2 份、寧夏1 份、山東21 份、陜西8 份（圖8）。所有白蠟材料的Q值均高于0.6，推測該部分白蠟材料遺傳組分相對單一。

圖7 基于Structure 軟件分析估算的L’(K)和ΔK 值Fig.7 Estimated values of L’(K) and ΔK based on structure analysis

圖8 基于12 對SSR 分子標記估算的380 份白蠟群體結構Fig.8 Population structures of 380 Fraxinus spp.based on 12 pairs of SSR markers

3 討 論

本研究從42 對SSR 引物中篩選出12 對，對9 個白蠟來源地群體共380 份材料進行了遺傳多樣性分析，結果與前人相似[3,12]。12 對SSR 引物的PCI 指數(shù)較高，平均PIC 指數(shù)為0.532 9（0.119 7～0.750 9），PIC 越高說明引物多態(tài)性越好、穩(wěn)定性越高。12 對多態(tài)性引物共產(chǎn)生51 個Na，每對引物主要從2.333～7.778 個等位基因中產(chǎn)生，平均頻率為4.287 0 個；Ne為2.367 5，I為0.960 9，PIC 為0.532 9，H為0.576 0。以上結果表明，該12 對SSR 分子標記在收集的380 份白蠟種質(zhì)資源間遺傳多樣性豐富。

遺傳分化指數(shù)（Fst）可以用于評估群體間遺傳分化的程度，F(xiàn)st由F統(tǒng)計量演變而來，而F統(tǒng)計量主要有Fis、Fit和Fst3 種。Fis是整個群體中觀察的雜合體頻率相對于地方群體為理想群體的期望雜合體頻率減少量的比值，數(shù)值為負則觀察的雜合體頻率高于期望雜合體頻率；Fit是整個群體中觀察的雜合體頻率相對于整個群體為理想群體的期望雜合體頻率減少量的比值，數(shù)值為負則觀察的雜合體頻率高于期望雜合體頻率；Fst是地方群體為理想群體的期望雜合體頻率相對于整個群體為理想群體的期望雜合體頻率減少量的比值，依據(jù)Fst值的大小可將其劃分為弱（0～0.05）、中（0.05～0.15）、高（0.15～0.25）和極高（≥0.25）4 個群體遺傳分化等級水平[13]。在本研究中，計算的Fst值為0.021～0.236，平均值為0.095，表明所測白蠟群體間存在中等程度的遺傳分化?；蛄鳎∟m）是影響群體間遺傳分化的重要因素。Nm＜0.249、0.250 ＜Nm＜0.990、Nm≥1.0 分別代表低、中、高3 個等級水平[14]，并且當Nm＞1時，基因流就能有效地防止近交引起的遺傳分化和遺傳漂變。本研究中Nm值為4.199，說明居群間基因交流程度很高，造成這種現(xiàn)象的原因可能與不同群體種質(zhì)資源之間栽培引種導致的基因交流頻率增加有關。該白蠟居群間的基因流動性大，居群間的基因分化程度低，推測可能是居群間較為頻繁的基因流動在一定程度上阻止了白蠟居群間的遺傳分化。除了基因流的阻礙作用，環(huán)境的選擇同樣是影響群體間遺傳分化的重要因素，生境破碎化、生態(tài)系統(tǒng)越小、環(huán)境變異對不同白蠟居群的遺傳結構影響越顯著[15]。因此，白蠟居群間遺傳分化可在一定程度上說明其對不同環(huán)境的適應程度，群體間的變異越大，說明該物種適應環(huán)境的能力越強[16]，白蠟群體趨于中等程度的遺傳分化反映了該物種具有一定的環(huán)境適應能力，但是容易受到不同環(huán)境的影響。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，在遺傳多樣性分析的基礎上與植物的表型、生理指標和組織結構相結合，能夠在育種過程中得出更科學的結論[17]。衡量一個物種遺傳多樣性水平的主要指標是Shannon 信息指數(shù)（I）。本研究中，9 個來源地的白蠟居群的I為0.746～1.209，平均為0.961，在木犀科植物中遠小于Chen 等[18]分析的四川盆地西南部鋸葉桂OsmanthusserrulatusRehder 的10 個自然居群（SSR，I＝1.492），但是遠大于女貞Ligustrumlucidum（ISSR，I＝0.2060～0.2953）[17]、絨毛白蠟FraxinusvelutinaTorr.（AFLP，I＝0.300）[19]、流蘇Chionanthusretusus（SRAP，I＝0.207～0.245）[20]和連翹Forsythiasuspensa（ISSR，I＝0.394±0.220）[21]等。這說明該白蠟群體在該水平上具有較高的遺傳多樣性，并且山東、北京和陜西的白蠟群體遺傳多樣性極其豐富，這3 個居群的遺傳關系也較為接近（圖4）。AMOVA 分析結果表明，9%的遺傳變異來源于居群間，91%來自于居群內(nèi)個體間。遺傳多樣性分析和AMOVA 分析結果與上述白蠟居群的遺傳分化分析的研究結果一致。推測產(chǎn)生這種變異的主要原因是白蠟廣泛分布于中國南北方各省區(qū)且多為栽培，不同地區(qū)的栽培品種可能來源于相同省份（地區(qū)），使不同居群間的白蠟基因交流頻繁，遺傳變異變小。因此，在白蠟遺傳改良過程中，應以優(yōu)樹選擇和單株改良為主，種源研究為輔。

根據(jù)SSR 分子標記分析的遺傳距離系數(shù)，利用UPGMA 方法和PCoA 分析可以將本研究收集的9 個白蠟居群劃分為3 類亞群。UPGMA 方法結果顯示，380 份白蠟種質(zhì)被分為3 個亞群，亞群1來自河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏和山西居群，共7份，亞群2 來自甘肅、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏和陜西，共40 份，亞群3 來自北京、甘肅、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏、山東、山西和陜西，共333 份。其中，北京和山東兩居群白蠟材料全部包含在亞群3 中，這與不同白蠟居群間UPGMA 聚類分析圖分析基本一致，該亞群群體數(shù)量多，分布面積大，是主要的白蠟群體。3 類亞群遺傳相似度較近，但因地理因素與國內(nèi)其他地區(qū)群體有一定基因交流，因此群體之間有一定遺傳差異，其他2 類亞群可作為補充進行單獨保存和利用。

群體結構分析結果顯示，來自不同地理分布的9 個白蠟居群在進化上相對獨立，存在一定程度的遺傳混合，遺傳組分相對單一（圖8），這與UPGMA 和PCoA 的結果基本一致（圖3 和圖6）。通常地理位置或地理環(huán)境對植物群體之間的遺傳混合影響較大[13,22]。在本研究中，9 個居群的白蠟種質(zhì)資源分別采自黃河流域、華北和東北。黃河流域具有豐富的水資源和植被資源，城鎮(zhèn)化建設和退耕還林還草政策的實施使得該河流生態(tài)系統(tǒng)中人類活動較為普遍[23]。因此，白蠟9 個居群之間一定程度的遺傳混合可能與黃河流域及周邊地區(qū)的人類活動密切相關。經(jīng)校對，選擇的自然群體被分為3 個亞群，推測本研究中的9 個白蠟居群起源3 個基因庫。

本研究利用SSR 分子標記技術對白蠟種質(zhì)資源進行遺傳多樣性與群體結構的分析，但由于條件的制約，各居群的供試材料偏少，SSR 標記的數(shù)量也較少，缺乏對白蠟遺傳多樣性的全面綜合分析。另外，沒有利用其他分子標記技術進行檢驗，也沒有應用形態(tài)學、細胞學和生物學標記相結合的方法進行比較，因此得出的結論不夠全面。在后續(xù)研究中，可在我國適生分布區(qū)加大對白蠟資源的采集和保護力度，在開展種源試驗時進一步開發(fā)多個分子標記，并在表型和分子水平上綜合篩選出適宜栽培區(qū)域的良種，推進白蠟的育種進程，為更加科學合理地推廣利用白蠟資源奠定基礎。

4 結 論

綜上所述，本研究利用SSR 分子標記分析了北方9 個較具代表性的白蠟居群的遺傳多樣性和群體結構，為白蠟種質(zhì)資源的保護和利用提供了理論依據(jù)。本研究中，12 對SSR 引物在所有白蠟中都能進行擴增，平均PIC為0.532 9，多態(tài)性較好、穩(wěn)定性較高；白蠟居群的平均Fis為0.016，平均Fit為0.091，顯示雜合頻率高，居群近交較多；白蠟居群的平均Fst為0.095，平均Nm為4.199，表明存在中等程度的遺傳分化，居群間基因交流非常豐富；AMOVA 分析結果表明，9 個白蠟居群的遺傳差異91%存在于個體間，是主要的變異來源；群體結構分析結果顯示，9 個來自不同地理區(qū)域的白蠟居群中存在3 個不同的基因庫，居群間在進化上相對獨立，存在一定程度的遺傳混合，遺傳組分相對單一。在后續(xù)的白蠟育種工作及研究中，應重視優(yōu)樹選擇和單株改良，以種源研究為輔，建立資源保護區(qū)，涵蓋更多的白蠟種源類別，以適地適樹為原則選育優(yōu)良品種，為白蠟資源的進一步推廣利用奠定基礎。