蘿卜VQ1基因的克隆與序列分析

霍燕琦　李紫薇　張文靜　徐銘婕　劉同金

摘要 利用RT-PCR技術(shù)克隆了蘿卜（Raphanus sativus L.）VQ1基因CDS序列，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，RsVQ1開放閱讀框長(zhǎng)861 bp，編碼286個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為31.3 kD，理論等電點(diǎn)為6.49，脂肪指數(shù)為62.69，為不穩(wěn)定的親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。RsVQ1蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，預(yù)測(cè)其可定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該蛋白與十字花科作物VQ蛋白存在較高同源性。本研究為RsVQ1的表達(dá)和基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 蘿卜；VQ1基因；基因克隆；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S631.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）10-0042-05

Cloning and sequence analysis of VQ1 gene in radish

HUO Yanqi? ?LI Ziwei? ?ZHANG Wenjing? ?XU Mingjie? ?LIU Tongjin*

（College of Horticulture，Jinling Institute of Technology，Nanjing Jiangsu 210000）

Abstract The full length coding sequence of VQ1 gene was cloned from radish （Raphanus sativus L.） by reverse transcription-PCR amplification and analyzed by bioinformatics. The results showed that the open reading frame （ORF） of RsVQ1 gene is 861 bp，encoding 286 amino acids with a molecular weight of 31.3 kD，isoelectric point of 6.49 and aliphatic index of 62.69. It was predicted to encode an unstable hydrophilic protein，and with no transmembrane structure or signal peptide. The protein structure of RsVQ1 is mainly composed of random coiled structures. Protein subcellular localization prediction results showed that it was probably localized in the nucleus. Phylogenetic analysis showed that RsVQ1 is closely related to Brassicaceae homologous proteins. Present study provides a basis for exploring the expression and function of RsVQ1 gene in the future.

Keywords radish; VQ1 gene; gene clone; bioinformatics

VQ蛋白是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄輔助蛋白[1]，因其含有高度保守的VQ基序（FxxhVQxhTG）而得名，其中x和h分別代表任意氨基酸和疏水性氨基酸[2]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，高等植物中多數(shù)VQ基因不含內(nèi)含子，而苔蘚基因組中包含的18個(gè)VQ基因均至少含有一個(gè)內(nèi)含子[3]。

研究表明，VQ蛋白參與植物不同發(fā)育過程的調(diào)控，包括光形態(tài)的建成，種子、花、葉和下胚軸的發(fā)育及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)[3]。VQ家族蛋白可以通過其保守的V和Q殘基與WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作，進(jìn)而調(diào)控下游一系列的生理生化過程[4]。鹽脅迫特異性誘導(dǎo)AtVQ9上調(diào)表達(dá)，并與AtWRKY8互作而調(diào)控植物的耐鹽性[5]。此外，ABA、高鹽、高滲透壓及低溫或高溫脅迫誘導(dǎo)與AtWRKY8互作的AtVQ10、AtVQ11和AtVQ23/SIB1編碼基因顯著上調(diào)表達(dá)，表明其可能參與植物對(duì)多種非生物逆境調(diào)控[6]。轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY2和AtWRKY34與AtVQ20蛋白互作調(diào)控花粉萌發(fā)、發(fā)育及花粉管的伸長(zhǎng)[7]，AtVQ14可與VQ基序蛋白IKU1互作調(diào)節(jié)種子大小和胚乳發(fā)育[8]，表明VQ蛋白參與植物發(fā)育過程的調(diào)控。VQ基因家族成員在對(duì)病原菌的防御過程中也發(fā)揮著重要作用[9]。丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染誘導(dǎo)擬南芥AtVQ23/SIB1上調(diào)表達(dá)，其功能缺失突變會(huì)抑制SA和JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)[10]。AtVQ16/SIB2和AtVQ23/SIB1可增強(qiáng)AtWRKY33的DNA結(jié)合活性以增強(qiáng)植株對(duì)真菌病的防御能力[4]，且過表達(dá)AtVQ23可增強(qiáng)植株對(duì)丁香假單胞菌的抗性[10]。AtVQ12、AtVQ22和AtVQ29負(fù)調(diào)控植物對(duì)灰霉菌（B. cinerea）的抗性[11]，而VQ10與WRKY8互作增強(qiáng)擬南芥對(duì)灰霉病的基礎(chǔ)防御[12]。

蘿卜（Raphanus sativus L.）是一種重要的蔬菜作物，具有較高的食用與藥用價(jià)值，在世界范圍內(nèi)被廣泛栽培。其生長(zhǎng)發(fā)育過程常遭受多種生物及非生物脅迫，極大影響了產(chǎn)量與品質(zhì)，已成為蘿卜種植生產(chǎn)過程中亟需解決的問題。然而，目前有關(guān)蘿卜對(duì)生物及非生物脅迫的抗性機(jī)制研究較少，制約了其遺傳改良進(jìn)程。前人研究表明VQ基因家族成員廣泛參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)，但尚未見有關(guān)于蘿卜VQ基因的報(bào)道。本研究克隆了蘿卜VQ1基因，并進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，將為下一步RsVQ1的表達(dá)調(diào)控和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為‘心里美蘿卜高代自交系，種植于金陵科技學(xué)院園藝站，取成熟期肉質(zhì)根置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成。使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）進(jìn)行總RNA的提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）將其反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。根據(jù)已發(fā)表的蘿卜基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)并合成RsVQ1基因特異性引物VQ1-InF（CACCATGCAATCTTCAAGCGGCG）和VQ1-InR（CGAGGCGTGAAAGATGCGT），以cDNA為模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO CO.，LTD）進(jìn)行RsVQ1基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L Forward Primer 1.5 μL，10 μmol/L Reverse Primer 1.5 μL，2 mM dNTPs 5 μL，酶（1U） 1 μL，ddH₂O補(bǔ)充至50 μL；PCR擴(kuò)增程序使用兩步法：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，68 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

1.2.3 目的片段的回收、載體構(gòu)建與測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收，并將其連接到pENTER-TOPO為載體（Invitrogen），重組產(chǎn)物通過熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體基中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行搖菌和菌液PCR，篩選陽(yáng)性克隆送上海生工進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析。利用ExPASy-ProtScale在線軟件翻譯堿基序列，并分析其分子式、分子量、理論等電點(diǎn)（PI）、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、親疏水性；使用NovoPro在線工具預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽序列；使用SPOMA在線工具預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Plant-mPLoc在線軟件預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位；采用NCBI中Conserved Domains 在線工具對(duì)RsVQ1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用NetPhos-3.1在線工具對(duì)RsVQ1蛋白磷酸位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用NCBI中Blast工具獲取其他物種同源蛋白序列，運(yùn)用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建（Neighbor-joining法，Bootstrap值設(shè)置為1 000）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及RsVQ1基因擴(kuò)增

對(duì)‘心里美蘿卜肉質(zhì)根提取出的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖1），結(jié)果表明提取質(zhì)量較好，條帶清晰，可用于后續(xù)試驗(yàn)。以其反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出了861 bp的目的條帶（圖2）。

2.2 RsVQ1蛋白的理化性質(zhì)分析

將測(cè)序獲得的RsVQ1堿基序列翻譯成氨基酸并對(duì)其進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：RsVQ1編碼286個(gè)氨基酸，其中Asn（N）、Ser（S）和Leu（L）含量較高，分別為11.9%、14.3%和9.1%；Cys（C）與Trp（W）含量最低，均為0.3%。該蛋白分子式為C1345H2092N404O451S5，分子量大小為31.3 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為6.49，不穩(wěn)定系數(shù)為72.08，脂肪指數(shù)為62.69，總平均親水性為-0.748，說(shuō)明其為不穩(wěn)定的親水性蛋白。ProtScale預(yù)測(cè)表明RsVQ1親水區(qū)含量高于疏水區(qū)，進(jìn)一步說(shuō)明其為親水性蛋白。NovoPro預(yù)測(cè)結(jié)果表明，RsVQ1蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)、無(wú)信號(hào)肽，表明其為非分泌性蛋白。

2.3 RsVQ1蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

SPOMA預(yù)測(cè)表明RsVQ1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-折疊所占比例分別為55.94%、20.28%、17.83%和5.94%（圖3）。Plant-mPLoc在線軟件預(yù)測(cè)RsVQ1蛋白極可能定位于細(xì)胞核。

2.4 RsVQ1蛋白保守結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用NCBI中Conserved Domains在線工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)RsVQ1蛋白具有一個(gè)VQ保守結(jié)構(gòu)域。NetPhos-3.1預(yù)測(cè)RsVQ1蛋白有44個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分別有31、10和3個(gè)（圖4）。

2.5 RsVQ1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究蘿卜RsVQ1與其他植物蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA軟件構(gòu)建了RsVQ1與14個(gè)不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RsVQ1與白芥（Sinapis alba）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、甘藍(lán)（Brassica oleracea ）、白菜（Brassica rapa）和芝麻菜（Eruca vesicaria subsp. sativa）等十字花科植物的同源蛋白聚為一類，表明蘿卜RsVQ1與十字花科植物同源蛋白的親緣關(guān)系較近，而與醉蝶花（Tarenaya hassleriana）、苦菊（Cichorium endivia）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis）和旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，VQ基因家族成員在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中均發(fā)揮重要作用。秈稻（Oryza sativa subsp. Indica）多個(gè)OsMHVQs響應(yīng)溫度脅迫[13]，甜瓜（Cucumis melo L.）中6個(gè)VQ家族基因響應(yīng)白粉病菌侵染[14]，鹽脅迫誘導(dǎo)普通煙草（Nicotiana tabacum）NtVQ16和NtVQ52基因顯著上調(diào)表達(dá)，NtVQ9、NtVQ46、NtVQ23和NtVQ26響應(yīng)青枯菌的侵染，推測(cè)其可能參與煙草對(duì)青枯菌的免疫防御調(diào)控[15]，小麥（Triticum aestivum）VQ家族部分成員響應(yīng)高溫與干旱脅迫[16]。此外，研究表明多種植物VQ1基因參與對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)。茉莉酸、脫落酸和低溫處理誘導(dǎo)香蕉（Musa paradisiaca）MaVQ1顯著上調(diào)表達(dá)，高溫與干旱抑制其表達(dá)水平[17]；青杄（Picea wilsonii M.）VQ1基因參與溫度、干旱、ABA、鹽脅迫等多種非生物脅迫的響應(yīng)[18]；侯俊斌[19]發(fā)現(xiàn)棉花（Anemone vitifolia Buch）GhVQ1在根中具有較高的表達(dá)水平，且受植物抗病相關(guān)激素水楊酸與茉莉酸的影響，抑制其表達(dá)可降低棉花對(duì)枯萎病的敏感性。

目前蘿卜VQ基因相關(guān)研究尚未見有報(bào)道，基于前人對(duì)VQ基因功能的研究，推測(cè)蘿卜VQ基因可能參與調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育及生物與非生物脅迫的響應(yīng)。本研究從‘心里美蘿卜中克隆出RsVQ1基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，RsVQ1蛋白為不穩(wěn)定的親水性非分泌性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，含有VQ保守結(jié)構(gòu)域，具有44個(gè)磷酸化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其次為延伸鏈結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明該蛋白極可能存在于細(xì)胞核中。RsVQ1蛋白與白芥、芝麻菜等十字花科物種的同源性較高。本研究為進(jìn)一步解析RsVQ1基因的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：王 菁）