湯環(huán)宇，錢且奇，陳 圳，徐靜雯，朱玉潔，許文靜，姬進寶，高 策，張曉君

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，隸屬甲殼綱十足目螯蝦科，具有食性雜、養(yǎng)殖周期短、環(huán)境適應能力強等特點，具有較高的經(jīng)濟價值，是我國常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[1]。自1929年從日本引入國內(nèi)后，克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)進入快速發(fā)展期，已成為一些地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)及重要經(jīng)濟來源[2]。同時，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及水環(huán)境的急劇惡化，小龍蝦病害問題日趨頻繁和嚴重。近年來，細菌性病害已成為克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要制約因素，且病原細菌呈現(xiàn)種類多、致病性強、發(fā)病率高和耐藥性增強等特點。目前已有報道可引起克氏原螯蝦暴發(fā)性死亡的病原菌主要包括豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)[3]、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)[4]、維氏氣單胞菌(A.veronii)[5]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[6]等，病蝦表現(xiàn)為食欲減退、行動遲緩、活力減弱，鰓部附著大量污物等。

氣單胞菌屬是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)常見的致病源之一，易引起多種水生養(yǎng)殖動物的大規(guī)模死亡[7]。維氏氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，是一種廣泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中的條件致病菌，感染魚類后主要引發(fā)細菌性敗血癥，以引起皮膚潰爛及壞死為典型癥狀[8]。已有報道該菌可導致草魚(Ctenopharyngodonidella)[9]、鯽(Carassiusauratus)[10]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[12]、黃鱔(Monopterusalbus)[13]、錦鯉(P.fulvidraco)[14]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[15]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[16]等魚類發(fā)病死亡。此外，維氏氣單胞菌也會引起中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[18]、青蝦(Macrobrachiummipponensis)[19]等甲殼類水生養(yǎng)殖動物大量死亡。周慧華等[20]在2017年6月從患病中華絨螯蟹中分離出致病性維氏氣單胞菌；姜光明等[21]報道，2016年也從江蘇某地患菌血癥的克氏原螯蝦上分離到強致病性的維氏氣單胞菌；胡騫等[22]報道維氏氣單胞菌感染克氏原螯蝦后可導致其反應遲鈍，引起肝胰腺等組織損傷，且死亡數(shù)量大。 5-7月是克氏原螯蝦養(yǎng)殖與出售的關(guān)鍵時期，而此時水溫與維氏氣單胞菌的最適溫度區(qū)間相重合，正是維氏氣單胞菌繁殖最為旺盛的時候，這使得維氏氣單胞菌對克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的危害更甚于其他水產(chǎn)品。

已有研究表明，維氏氣單胞菌致病性受到其毒力因子分泌、表達的控制，如外毒素、腸毒素、胞外蛋白酶和各種黏附因子等[23]。其中溶血素、胞外蛋白酶是維氏氣單胞菌的重要毒力因子，在病原菌的致病過程中起到?jīng)Q定性的作用。羅志飛等[24]曾通過研究發(fā)現(xiàn)氣單胞菌弱毒株培養(yǎng)上清均不溶血、不溶蛋白，而強毒株具有強溶血活性和溶蛋白活性。

維氏氣單胞菌致病機制較為復雜，可能是由多個毒力因子共同作用所致。因此，檢測分離菌所攜帶毒力因子，對揭示其潛在致病性至關(guān)重要。溶血素是維氏氣單胞菌的重要毒力因子，它通過改變細胞膜的通透性，進而使紅細胞破裂溶解來表現(xiàn)出溶血性和腸毒性，而且溶血素還會破壞其他細胞，且這種破壞是不可逆轉(zhuǎn)的[25]。目前，關(guān)于維氏氣單胞菌溶血素的研究較少，SREEDHARAN等[26]從瀕死的魚類分離出的維氏氣單胞菌均含有aerA和hlyA基因，研究表明這些基因能對宿主細胞的損傷和死亡造成一定影響，而本次實驗中也在分離菌CPA2020中發(fā)現(xiàn)了hly基因，證明這也是克氏原螯蝦致病過程中維氏氣單胞菌毒力的重要來源之一。此外，各種胞外酶活性也是氣單胞菌毒力的重要因素[27]。胞外蛋白酶是一類廣泛存在的酶，在細菌致病性、應激反應和細胞活力等方面發(fā)揮著重要作用。明膠酶是一種潛在的毒性因子，它缺乏明顯的底物特異性，可水解酪蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白等多肽，造成廣泛的組織損傷，并有助于細菌在高密度環(huán)境中的傳播。同時，毒力基因檢測從致病菌CPA2020中還發(fā)現(xiàn)脂肪酶基因lip，NAWAZ等[28]在對鯰魚毒力因子的研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶會破壞紅細胞的細胞膜，致使細胞發(fā)生溶解。外膜蛋白(outer membrane proteins，Omps)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，與維持細胞形態(tài)、物質(zhì)代謝、組織黏附及致病等密切相關(guān)[29]。王薇等[30]的研究證實了OmpA是擬態(tài)弧菌的一種重要黏附素，它通過黏附參與致病作用，是一種重要的毒力因子。Namba等[31]報道，從鯉腸道中分離出來的維氏氣單胞菌CWP11菌株產(chǎn)生的外膜蛋白OMPA是一種黏附因子，經(jīng)克隆和核苷酸測序發(fā)現(xiàn)OmpA存在2個串聯(lián)的OmpAⅠ-OmpAⅡ同系物，利用同源重組技術(shù)缺失該菌株的OmpAⅠ，發(fā)現(xiàn)可降低對鯉魚腸上皮細胞的黏附活性降低，說明OmpAⅠ對腸上皮細胞有較強的黏附作用。

近年來江蘇省泗洪多家克氏原螯蝦養(yǎng)殖場細菌性病害頗為嚴重，病蝦往往呈現(xiàn)蝦體發(fā)紅、四肢無力、攝食減少、行動遲緩、對外界刺激反應遲鈍、肝胰腺水腫等癥狀，并陸續(xù)出現(xiàn)暴發(fā)性死亡。為明確該病病原，本研究對江蘇省泗洪螯蝦主養(yǎng)區(qū)的多個典型發(fā)病養(yǎng)殖場進行調(diào)研與病原檢測。通過對分離菌進行致病性、形態(tài)特征觀察、理化特性鑒定，結(jié)合gyrB基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析，結(jié)果表明引起克氏原螯蝦暴發(fā)性死亡的病原為維氏氣單胞菌。研究結(jié)果可為克氏原螯蝦細菌性病害的防治及維氏氣單胞菌致病機理的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦

發(fā)病克氏原螯蝦[平均體長(7.0±1.0)cm]取自江蘇省泗洪縣某克氏原螯蝦養(yǎng)殖場，癥狀為攝食減少、反應遲緩、腹部肌肉腫脹，肝胰腺水腫，顏色加深。用于回歸感染實驗的健康克氏原螯蝦取自江蘇省揚州市克氏原螯蝦養(yǎng)殖場，本實驗采用了封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖用水經(jīng)曝氣2 d，水溫(24～25)℃，每日投喂人工飼料1次。

1.2 病原菌的分離與純化

取患病克氏原螯蝦肝胰腺劃線接種于LB培養(yǎng)基平板，于28 ℃過夜培養(yǎng)。挑取優(yōu)勢單菌落劃線接種于LB培養(yǎng)基上，進一步純化，28 ℃培養(yǎng)18 h，選取單菌落(菌株編號為CPA2020)接種于 LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于甘油管-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌人工感染實驗

將純化的優(yōu)勢菌(CPA2020)接種于LB培養(yǎng)基并于28 ℃過夜培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水調(diào)至濃度為1.6×104、1.6×105、1.6×106、1.6×107和1.6×108CFU/mL。選用暫養(yǎng)5 d的健康克氏原螯蝦，每個實驗組分別注射感染20只健康克氏原螯蝦，每只蝦注射0.1 mL不同濃度的菌液，同時設立無菌生理鹽水作對照，對照組蝦注射等量無菌生理鹽水。連續(xù)觀察蝦的死亡情況并記錄，按Behreans and Karber方法[32]計算半數(shù)致死劑量LD50，對瀕死蝦進行細菌再分離和鑒定。

1.4 病原菌的鑒定

對分離菌CPA2020分別進行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、糖(醇及苷)類代謝、硝酸鹽還原、O-F實驗、動力等理化特性測定，各項理化指標的測定主要參照《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》[33]進行。細菌微量生化反應管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.5 gyrB基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學構(gòu)建

1.5.1 PCR模板DNA的制備

取純培養(yǎng)菌分別接種于含鹽1%的營養(yǎng)LB肉湯中28 ℃培養(yǎng)16 h，按TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn))使用說明書提取DNA作為PCR模板DNA，-20 ℃保存待用。

1.5.2gyrB基因序列的PCR擴增與測序

gyrB基因PCR擴增的兩個引物分別為：UP1(正向引物)：5′-GAAGTCATCATGACCG TTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，UP2r(反向引物)：5′-AGCAGGGTACGGATGT GCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。在20 μL反應體系中含有：正反引物各0.5 μL，PCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，細菌基因組模板1 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min；16 ℃結(jié)束反應程序。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后交由南京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5.3gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對分離菌的gyrB基因序列通過NCBI的Blast進行同源性檢索，并使用Clustal X 2.0軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫下載相似性較高的菌株的序列進行多序列比對(multiple alignments)，并對gyrB基因采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，選用鄰接(neighbor joining method)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 克氏原螯蝦的病理組織分析

分別取健康、自然患病及人工感染的克氏原螯蝦各5只，將解剖出的克氏原螯蝦肝胰腺用波恩氏液固定24 h后，使用70%酒精保存，克氏原螯蝦肝胰腺組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋一系列操作后，使用切片機連續(xù)切片(3～6 μm)，之后進行H-E染色，中性樹脂膠封片，最后使用顯微鏡觀察記錄。

1.7 胞外酶與溶血活性檢測

采用平板法測定分離菌CPA2020的卵磷脂酶、脂酶、明膠酶、脲酶以及溶血素活性。吸取10 μL分離菌CPA2020分別點種在含10%卵黃液、1%吐溫80、1%明膠、2%尿素(含酚紅指示劑)以及7%兔脫纖血的固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h。實驗均重復3次，根據(jù)是否出現(xiàn)透明圈判定酶活性。若有水解圈產(chǎn)生，則反應為陽性。

1.8 毒力基因檢測

根據(jù)GenBank已登錄的維氏氣單胞菌的毒力基因，實驗選擇flaA、aer、ompA、aha、flaH等16個常見毒力基因，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，由上海生物工程技術(shù)公司合成(表1)，以檢測分離菌幾種毒力基因的攜帶情況。

1.9 病原菌耐藥性性測定

取供試分離菌，移接于普通營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18 h，后將菌株懸液均勻涂布于LB瓊脂平板上，待自然干燥后平貼各藥敏紙片，每個平板均勻分布貼6張，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并記錄結(jié)果。參照杭州濱和微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標準，以測量的抑菌圈直徑大小為指標判定其敏感與耐藥性。

2 實驗結(jié)果

2.1 克氏原螯蝦疾病發(fā)生情況

人工感染后的病蝦與自然發(fā)病蝦的癥狀相同，表現(xiàn)為行動遲緩，對外界刺激反應遲鈍，頭胸部與腹部間肌肉松軟，頭胸甲和肌節(jié)容易分離(圖1a)，外觀可見其心臟積液(圖1b)，腹部肌肉腫脹(圖1c)，肝胰腺水腫，顏色加深(圖1d)。

圖1 患病克氏原螯蝦臨床癥狀Fig.1 The clinical signs of diseased P.clarkiia：健康蝦頭部；b：病蝦頭部；c：健康蝦心臟；d：病蝦心臟；e：健康蝦腹部；f：病蝦腹部；g：健康蝦肝胰腺；h：患病蝦肝胰腺

2.2 病原菌的致病性

低濃度組在觀察期內(nèi)持續(xù)發(fā)病死亡；對照組克氏原螯蝦在5 d的觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)死亡(圖2)。計算得分離菌對克氏原螯蝦的半致死量為6.31×105CFU/mL。證明分離菌對克氏原螯蝦具有較高致死率，并從人工感染死亡克氏原螯蝦體內(nèi)分離到大量優(yōu)勢原感染菌。

圖2 菌株CPA2020對克氏原螯蝦人工感染實驗結(jié)果Fig.2 The artificial infection experiment results of strain CPA2020 on P.clarkii

2.3 病原菌的鑒定

菌株CPA2020的生理生化特性鑒定結(jié)果見表2，分離菌能夠在37 ℃中生長，具有動力，能利用蔗糖、精氨酸雙水解酶、甘露糖等，這與《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》[33]中維氏氣單胞菌的理化特性描述基本一致。初步鑒定菌株CPA2020為維氏氣單胞菌。

對其gyrB基因序列進行擴增、測序，在NCBI中進行Blast同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其gyrB基因序列與維氏氣單胞菌的同源性最高(100%)。選取不同氣單胞菌屬的代表株gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，CPA2020與維氏氣單胞菌(R537457.1)聚為一支，綜合生理生化檢測結(jié)果，可以判定病原菌為維氏氣單胞菌，并命名其為CPA2020。

圖3 基于CPA2020 gyrB序列構(gòu)建的氣單胞菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Aeromonas based on CPA2020 gyrB sequence

2.3 毒力基因及胞外酶檢測

PCR擴增結(jié)果圖4所示，分離鑒定的病原維氏氣單胞菌可擴增出lip、hly、flgN、ompA、flgM、flaH、aha、flgA 8種相關(guān)毒力基因，表明菌株CPA2020攜帶這些毒力因子。

圖4 菌株CPA2020毒力基因PCR凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Virulence genes of strain CPA2020 by PCR amplificationM：Marker；1：lip；2：hly；3：flgN；4：ompA；5：flgM；6：flaH；7：aha；8：flgA

病原菌CPA2020胞外酶檢測結(jié)果表明，分離菌具有明膠酶、溶血素和卵磷脂酶活性，但不具有脂肪酶和脲酶活性。結(jié)果如圖5所示。

圖5 胞外酶和溶血素的檢測Fig.5 Determination of extracellular enzymes and hemolysin.a：明膠酶活性；b：溶血素活性；c：卵磷脂酶活性；d：脂肪酶的活性；e：脲酶的活性。

2.4 維氏氣單胞菌感染克氏原螯蝦的病理學分析

克氏原螯蝦感染分離菌CPA2020后，腸道和肝胰腺組織出現(xiàn)明顯的組織學改變，產(chǎn)生明顯的炎癥反應。健康蝦的腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，層次分明(圖6A)。自然患病蝦的腸道內(nèi)各組織溶解在一起，腸道組織間出現(xiàn)較大裂隙，皺嵴減少(圖6B)，人工感染的病蝦的腸道內(nèi)也呈現(xiàn)出皺嵴減少的病理變化(圖6C)。健康蝦的肝小管形態(tài)完整，排列緊密(圖6D)，而自然患病和人工感染的病蝦肝小管間均出現(xiàn)間隙，空泡化嚴重(圖6E、F)。

圖6 維氏氣單胞菌感染克氏原螯蝦后肝胰腺與腸組織病理變化(放大倍數(shù)，400×)Fig.6 Tissue structure of hepatopancreas and intestine of P.clarkii infected by A.veronii(magnification，400×)A：正常的腸道組織；B：自然患病的腸道組織；C：人工感染的腸道組織；D：正常的肝胰腺組織；E：自然患病的肝胰腺組織；F：人工感染的肝胰腺組織。

2.5 藥敏實驗

藥敏實驗結(jié)果見表3，菌株CPA2020對鏈霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星等12種藥物耐藥，對頭孢唑林、克拉霉素等9種藥物中介，對頭孢呋辛、左氟沙星、氨曲南等13種藥物敏感。

表3 菌株CPA2020的耐藥性分析Tab.3 Analysis of drug resistance of strain CPA2020

3 討論

3.1 維氏氣單胞菌親緣性分析

通過gyrB基因同源性分析，并且構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，分離菌CPA2020與維氏氣單胞菌聚為一支。因此，可鑒定分離菌CPA2020為維氏氣單胞菌。此外，不同維氏氣單胞菌之間的親緣性也不同。由圖3可知，CPA2020與一株從斑點叉尾鮰魚上分離出的維氏氣單胞菌(KR537457.1)同源性最高，達100%，與GAO等[34]分離出的一株引起青蝦大量死亡的維氏氣單胞菌(MK905236.1)同緣性很高，而與胡騫等[22]從患病克氏原螯蝦肝胰腺中分離到的維氏氣單胞菌相似度比較低(MN189983.1)，說明不同來源的維氏氣單胞菌，其親緣性存在一定的差異性。

3.2 維氏氣單胞菌致病性分析

人工感染實驗結(jié)果表明，CPA2020可使健康的克氏原螯蝦在5 d內(nèi)全部死亡，說明該菌有較強的致病性。為探究其致病的重要因子，本研究對分離菌CPA2020進行胞外酶檢測，結(jié)果表明，分離菌CPA2020可分泌卵磷脂酶、明膠酶和溶血素。為進一步了解CPA2020的致病機制，本研究對其進行了毒力基因檢測。結(jié)果顯示菌株CPA2020攜帶8種毒力因子，進一步揭示菌株CPA2020具有強致病性。同時，這些毒力基因可作為檢測致病性類維氏氣單胞菌的生物學標記，為分子流行病學研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 藥敏實驗結(jié)果分析

藥敏實驗結(jié)果顯示菌株CPA2020對氨曲南、頭孢呋辛、左氟沙星等13種藥物敏感，但部分頭孢類藥物是違禁藥品，目前不能廣泛應用于臨床。對慶大霉素、卡那霉素、克拉霉素等9種藥物中度敏感，這與耿昕穎等[36]研究結(jié)果部分一致，其他不相同部分可能與菌株來源、用藥差異等有關(guān)。對復方新諾明、萬古霉素、鏈霉素等12種藥物耐藥，所以在藥物使用時應該結(jié)合國家漁業(yè)用藥準則，有選擇地用敏感藥物進行治療，并輪換用藥，防止耐藥菌株的產(chǎn)生。由于抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的長期使用，誘導維氏氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性，并且不同地域分離株以及不同水產(chǎn)動物來源分離株的耐藥性均有差異。本研究的耐藥性分析表明，菌株CPA2020對氨基糖苷類、青霉素類藥物耐藥。這和藺凌云等[37]、田甜等[38]的實驗結(jié)果相似，說明維氏氣單胞菌對氨基糖苷類、青霉素類藥物的抗藥性是較為普遍的。本實驗結(jié)果顯示只有頭孢類藥物可有效抑制維氏氣單胞菌，但其已被禁用。維氏氣單胞菌多重耐藥現(xiàn)象嚴重，耐藥株的出現(xiàn)是在抗生素選擇壓力下發(fā)生多位點突變所致。當前的養(yǎng)殖過程中因更多僅考慮疾病治愈效果而濫用抗菌藥物，致使細菌發(fā)生耐藥性變異。因此我們亟需研發(fā)不產(chǎn)生耐藥性的新型藥物，如抗細菌毒力藥物，選擇性地遏制病原菌的黏附、毒素表達、毒素傳遞和免疫逃避等，從而降低病原菌的毒力，達到有效預防和治療細菌感染的目的。

綜上所述，本研究對此次克氏原螯蝦細菌性疾病病原進行分離鑒定及藥敏實驗，可為我國螯蝦產(chǎn)業(yè)的疫病防控、合理用藥、流行病學調(diào)查等研究提供參考。未來仍需進一步開展維氏氣單胞菌的致病因子、耐藥基因和螯蝦免疫相關(guān)基因等方面的研究，以期揭示螯蝦細菌性疾病的免疫應答規(guī)律，從而為其細菌疾病的防控與治療提供科學依據(jù)，保證螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。