楊逸尊，羅國(guó)芝，2，3，譚洪新，2，3

(1.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

近幾年來(lái)，抗生素抗性基因引起了越來(lái)越多的關(guān)注[1，2]，而水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)被越來(lái)越多地認(rèn)為是抗生素抗性細(xì)菌的重要來(lái)源和抗生素抗性基因的貯存庫(kù)[3]。宏基因組學(xué)分析表明，抗生素選擇壓力顯著影響了抗生素抗性基因譜的組成，顯著促進(jìn)了抗生素抗性基因的富集，包括相應(yīng)的和非相應(yīng)的抗生素抗性基因類(lèi)型[4]。形成各種抗生素抗性基因的共存組合，共同選擇多種抗生素耐藥性。ZHAO等[5]發(fā)現(xiàn)在同一種抗生素選擇壓力下，非對(duì)應(yīng)抗生素抗性基因的豐度也升高，表明抗生素具有顯著的共選擇效應(yīng)，表現(xiàn)出抗生素的特異型。

生物絮凝技術(shù)(biofloc technology，BFT)作為一種新興的養(yǎng)殖技術(shù)，其主體生物絮團(tuán)主要是水體中的大量微生物、飼料糞便殘?jiān)?、有機(jī)碎屑和一些聚合物通過(guò)復(fù)雜作用相互絮凝而成的細(xì)菌團(tuán)[6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗生素在生物絮凝養(yǎng)殖技術(shù)中的使用研究較少，而硫酸新霉素在各種養(yǎng)殖及水處理系統(tǒng)中的使用也鮮有關(guān)注，故本實(shí)驗(yàn)選取了硫酸新霉素這種常用漁藥，來(lái)探究不同濃度硫酸新霉素對(duì)生物絮團(tuán)水質(zhì)處理能力及抗生素抗性基因的影響。水體中細(xì)菌對(duì)硫酸新霉素產(chǎn)生耐藥性共有三種途徑[7]，其中最具普適性的就是由細(xì)菌自身產(chǎn)生修飾氨基糖苷類(lèi)抗生素的酶，而這種修飾氨基糖苷類(lèi)的酶又可以細(xì)分為三種，一種是以aph基因?yàn)榇淼膶?duì)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行編碼的抗生素抗性基因，一種是以aac基因?yàn)榇淼膶?duì)氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行編碼的抗生素抗性基因，最后一種就是以ant基因?yàn)榇淼膶?duì)氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行編碼的抗生素抗性基因。本實(shí)驗(yàn)選取了5種硫酸新霉素抗性基因，包含了三種類(lèi)別的氨基糖苷修飾基因，為用藥后抗性基因的積累給出數(shù)據(jù)支持，也為抗生素在生物絮凝養(yǎng)殖技術(shù)中的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與材料

實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)循環(huán)水養(yǎng)殖與工程實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室為封閉空間，溫度設(shè)定為25 ℃。反應(yīng)容器為10 L透明圓柱形塑料桶，使用功率為370 W的氣泵(森森集團(tuán)股份有限公司，型號(hào)：HG-370)進(jìn)行曝氣，氣石為球形石英曝氣石，置于反應(yīng)容器中心使水體和空氣充分且均勻接觸。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)過(guò)提前24 h充分曝氣以去除水中殘留氯。絮團(tuán)取自上海海洋大學(xué)循環(huán)水養(yǎng)殖與工程實(shí)驗(yàn)基地未添加過(guò)抗生素的羅非魚(yú)養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖密度約為20 kg/m3。添加的碳源為一水合葡萄糖(C6H12O6·H2O，分析純，含碳量為36.4%)；使用的飼料為通威魚(yú)用膨化配合飼料(江蘇省宿遷市沭陽(yáng)縣扎下鎮(zhèn)，粗蛋白為31.0%，碳含量為37.3%)，實(shí)驗(yàn)所用氯化銨(分析純，純度≥99.5%)及所有水質(zhì)檢測(cè)使用試劑均采購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所用抗生素均采購(gòu)自合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

實(shí)驗(yàn)分為4組，每組三個(gè)平行，A組作為對(duì)照組不添加硫酸新霉素，B組添加0.02 g硫酸新霉素(休藥期500 ℃·d)，C組添加0.04 g硫酸新霉素，D組添加0.12 g硫酸新霉素。添加的藥量根據(jù)硫酸新霉素的推薦使用量計(jì)算，其中B組為推薦使用量的一半，初始濃度為0.50 mg/L，C組為推薦使用量，初始濃度為1.00 mg/L，D組為推薦使用量的3倍，初始濃度為3.00 mg/L。4組接種絮團(tuán)后調(diào)節(jié)TSS至315～330 mg/L，水體體積為8 L。

第一次加藥連續(xù)檢測(cè)每組投加10 mg/L氨氮(氯化銨溶液)，實(shí)驗(yàn)期間反應(yīng)器加蓋并及時(shí)補(bǔ)充因蒸發(fā)流失的少量水分。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)水體堿度為355～375 mg CaCO3/L，當(dāng)?shù)陀?50 mg CaCO3/L時(shí)添加適量小蘇打以維持堿度。當(dāng)所有組氨態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮濃度降低并維持在0.5 mg/L以內(nèi)時(shí)視為第一次連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。維持系統(tǒng)培養(yǎng)直到休藥期結(jié)束，加藥進(jìn)行第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)。

第二次加藥連續(xù)檢測(cè)每組投加10 mg/L氨氮(氯化銨溶液)，實(shí)驗(yàn)期間反應(yīng)器加蓋并及時(shí)補(bǔ)充因蒸發(fā)流失的少量水分。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)水體堿度為265～285 mg CaCO3/L，當(dāng)?shù)陀?50 mg CaCO3/L時(shí)添加適量小蘇打以維持堿度。當(dāng)所有組氨態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮濃度降低并維持在0.5 mg/L以內(nèi)時(shí)視為實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 水質(zhì)及絮團(tuán)指標(biāo)的檢測(cè)方法

水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)先用注射器取10 mL絮團(tuán)水樣，再通過(guò)0.22 μm針頭濾器(上海航歐機(jī)電設(shè)備有限公司，型號(hào)：Collins MCE 0.22 μm)過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法見(jiàn)表1，檢測(cè)儀器為分光光度計(jì)(上海優(yōu)尼科儀器有限公司，型號(hào)：UV2000)，總有機(jī)碳分析儀(島津制作所，型號(hào)：TOC-4200)，多參數(shù)手提測(cè)試儀(德國(guó)WTW，型號(hào)：Multi 3430)，105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，碳氮元素分析儀(德國(guó)Elementar vario max CNS)，馬弗爐(協(xié)郝上海儀器科技有限公司，型號(hào)：SX2-4-10Y)。

表1 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)方法Tab.1 Water quality index detection method

1.4 硫酸新霉素的檢測(cè)

水體中硫酸新霉素在第一次休藥期結(jié)束和第二次加藥3 d后從各組實(shí)驗(yàn)水體中均勻抽取50 mL水樣，通過(guò)0.22 μm針頭濾器過(guò)濾后通過(guò)冰袋運(yùn)送至上海微譜化工技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)。硫酸新霉素含量檢測(cè)方法由LC-MS/MS外標(biāo)法測(cè)定。液相型號(hào)為：Waters 1-Class；質(zhì)譜型號(hào)為：Waters TQS；色譜柱為：ACQUITY UPLcr HSS T3 1.8 μm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相為：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：0.4 mL/min。

1.5 生物絮團(tuán)中抗生素抗性基因的采集與測(cè)定

在第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后從各組實(shí)驗(yàn)水體中均勻抽取150 mL水樣，通過(guò)0.22 μm濾膜抽濾后，將抽濾在濾紙上的絮團(tuán)放進(jìn)10 mL透明無(wú)菌離心管中，用干冰保存第一時(shí)間送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行抗生素抗性基因的檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)所用引物通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，表2為所用目的基因引物。

表2 本實(shí)驗(yàn)所研究基因參考引物Tab.2 Reference primers for genes studied in this lab

1.6 生物絮團(tuán)中異養(yǎng)細(xì)菌的生物群落估算

用稀釋平板計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)定生物絮團(tuán)中的異養(yǎng)細(xì)菌的群落數(shù)量。在對(duì)接種絮團(tuán)擴(kuò)培之前及擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后采集絮團(tuán)水樣。在無(wú)菌操作臺(tái)中，取1 mL均勻水樣，根據(jù)菌群的大致數(shù)量用合適倍數(shù)的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋。將各組稀釋后的菌液用殺菌消毒后的干凈三角玻棒均勻涂布在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上(杭州百思生物技術(shù)有限公司)。將均勻涂布后的平板放入恒溫生化培養(yǎng)箱中(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：SHP-250)，設(shè)定溫度為35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。最后對(duì)培養(yǎng)之后的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌落數(shù)(CFU/mL)為平板上所有菌落數(shù)量再乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.7 氨氮去除效率和氨氮去除速率及抗生素使用量計(jì)算公式

R=100%×(Ci-Ce)/Ci

S=(Ci-Ce)/(T×t)

抗生素使用量計(jì)算公式：

M=ρ×V×Mi/k

式中，M為使用藥物的質(zhì)量(g)；ρ為養(yǎng)殖水體密度(kg/m3)；V為實(shí)驗(yàn)水體體積(L)；Mi為抗生素藥物使用劑量(g)；k為藥物有效成分含量(%)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel2017軟件進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)，由Origin Pro 2021和Graphpad Prism 9.0軟件繪制相關(guān)圖表。實(shí)驗(yàn)數(shù)值用平均值(Mean±SD)形式表示，采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)及絮團(tuán)變化

在探究不同濃度硫酸新霉素對(duì)生物絮團(tuán)氨氮轉(zhuǎn)化速率和抗生素抗性基因累積的效果前，對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)并無(wú)顯著差異，如表3所示。

表3 加藥之前4個(gè)組水質(zhì)指標(biāo)平均值、最小值和最大值Tab.3 Average，minimum and maximum values of water quality indicators in 4 groups before dosing

第一次加藥連續(xù)檢測(cè)水質(zhì)變化如圖1所示，其中各組氨態(tài)氮變化如圖1(a)所示。4個(gè)組的氨態(tài)氮去除效率分別為99.80 %、99.70%、99.53%和99.29%；氨態(tài)氮去除速率分別為(3.88±0.02)mg TAN/(g TSS·h)、(2.22±0.03)mg TAN/(g TSS·h)、(2.17±0.04)mg TAN/(g TSS·h)和(1.72±0.02)mg TAN/(g TSS·h)，氨態(tài)氮去除速率A組>B組>C組>D組。A組與其他三組去除速率有顯著差異，B組和C組的去除速率無(wú)顯著差異，D組與其他三組去除速率有顯著差異。

圖1 第一次加藥時(shí)4個(gè)組中三態(tài)氮(a，b，c)及溶解性有機(jī)碳(d)的變化圖Fig.1 Changes of tristate nitrogen(a，b，c)and dissolved organic carbon(d)in the four groups during the first dosing.

實(shí)驗(yàn)期間4個(gè)組亞硝氮的濃度變化如圖1(b)所示，4個(gè)組的亞硝氮濃度變化趨勢(shì)總體一致，在實(shí)驗(yàn)前4 h處于上升階段且在第4 h達(dá)到峰值，第4 h后A組和B組亞硝氮在第12 h下降到0.1 mg/L的低濃度水平，C組和D組亞硝氮分別在第16和18 h下降到0.1 mg/L的低濃度水平。

實(shí)驗(yàn)期間4個(gè)組硝態(tài)氮的濃度變化如圖1(c)所示，4個(gè)組的硝態(tài)氮濃度在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的濃度較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)均有下降，除C組外其余3組下降幅度不大，均在3.00 mg/L以內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)期間4個(gè)組DOC濃度變化如圖1(d)所示，4個(gè)組的DOC均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且總消耗量均在96.00至99.00 mg/L之間，各組無(wú)顯著差異。

在第一次連續(xù)監(jiān)測(cè)前對(duì)4個(gè)組的TSS濃度進(jìn)行了檢測(cè)，4組濃度分別為(315.00±3.00)mg/L、(315.00±2.00)mg/L、(325.00±2.00)mg/L和(315.00±1.00)mg/L。各組無(wú)顯著差異，連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)束后4組TSS濃度如圖2所示，各組TSS濃度較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前均有所下降，A組降至(210.00±14.51)mg/L；B組降至(243.33±18.93)mg/L；C組降至(252.00±26.73)mg/L；D組降至(238.67±14.64)mg/L。下降量A組>D組>B組>C組，A組與其余3組有顯著性差異。

圖2 第一次加藥結(jié)束4個(gè)組TSS濃度變化圖Fig.2 Changes of TSS concentration in 4 groups at the end of the first dosing

第二次加藥連續(xù)檢測(cè)水質(zhì)變化如圖3所示,其中各組氨態(tài)氮變化如圖3(a)所示。4個(gè)組的氨態(tài)氮去除效率分別為99.70%、99.68%、99.73%和99.79%。4個(gè)組的氨態(tài)氮去除速率分別為(2.99±0.08) mg TAN/(g TSS·h)、(2.98±0.03) mg TAN/

圖3 第二次加藥時(shí)4個(gè)組中三態(tài)氮(a，b，c)及溶解性有機(jī)碳(d)的變化圖Fig.3 Changes of tristate nitrogen(a，b，c)and dissolved organic carbon(d)in the four groups during the second dosing

(g TSS·h)、(2.97±0.08)mg TAN/(g TSS·h)和(5.10±0.03)mg TAN/(g TSS·h)，氨態(tài)氮去除速率D組>A組>B組>C組。D組與其他三組去除速率有顯著差異，A組、B組和C組的去除速率無(wú)顯著差異。

實(shí)驗(yàn)期間4個(gè)組亞硝氮的濃度變化如圖3(b)所示，4個(gè)組的亞硝氮濃度變化趨勢(shì)總體一致，在實(shí)驗(yàn)前4 h處于上升階段且在第4 h達(dá)到峰值，在第10 h下降到0.02 mg/L以下的低濃度水平。4個(gè)組硝態(tài)氮的濃度變化如圖3(c)所示，4個(gè)組的硝態(tài)氮濃度在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的濃度較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)均有下降，但下降幅度均在2.00 mg/L以內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)期間4個(gè)組DOC濃度變化如圖3(d)所示，4個(gè)組的DOC均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且總消耗量均在90.00～94.00 mg/L之間，各組無(wú)顯著差異。

在第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)前對(duì)4個(gè)組的TSS濃度進(jìn)行了檢測(cè)，4組濃度分別為(331.30±7.59)mg/L、(329.00±3.27)mg/L、(327.00±3.56)mg/L和(323.30±3.30)mg/L。各組無(wú)顯著差異，連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)束后4組TSS濃度如圖4所示，各組TSS濃度較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前均有所下降，A組降至(264.67±19.62)mg/L；B組降至(301.33±4.99)mg/L；C組降至(267.33±5.25)mg/L；D組降至(262.67±4.99)mg/L。下降量D組>A組>C組>B組，B組與其余3組有顯著性差異。

圖4 第二次加藥結(jié)束4個(gè)組TSS濃度變化圖Fig.4 Changes of TSS concentration in 4 groups at the end of the second dosing

各組連續(xù)檢測(cè)后絮團(tuán)組分如表4所示，絮團(tuán)VSS/TSS為B組>C組>A組>D組，B組與C組與A、D組呈顯著差異。粗灰分則為D組>A組>C組>B組，A組與D組無(wú)顯著差異，其余各組間均有顯著差異。粗蛋白各組無(wú)顯著差異。粗脂肪B組>C組>A組>D組，B組與其他各組呈顯著差異。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)絮團(tuán)VSS/TSS、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪的含量Tab.4 Contents of floc VSS/TSS，crude ash，crude protein and crude fat at the end of the experiment %

2.2 水體抗生素含量

在休藥期結(jié)束也就是第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)前和第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)束后3 d對(duì)水體中的硫酸新霉素進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表5所示。4個(gè)組前后兩次均未在水體中檢測(cè)到硫酸新霉素的存在，或低于檢出閾值。

表5 休藥期結(jié)束時(shí)4組水體硫酸新霉素含量Tab.5 The contents of neomycin sulfate in the four groups of water at the end of the withdrawal period (mg/L)

2.3 生物絮團(tuán)中抗生素抗性基因含量

在第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)束后，對(duì)水體送樣檢測(cè)抗生素抗性基因，其中包含5種氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性基因和1種整合子基因。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后4個(gè)組的intl1的拷貝數(shù)分別為1.17×106copies/mL、6.51×105copies/mL、2.17×106copies/mL和2.13×106copies/mL，拷貝數(shù)C組>D組>A組>B組；4個(gè)組aadB的拷貝數(shù)分別為2.86×105copies/mL、2.13×105copies/mL、4.03×105copies/mL和6.17×105copies/mL，拷貝數(shù)D組>C組>A組>B組；4個(gè)組aph(3′)-Ia的拷貝數(shù)分別為7.10×103copies/mL、3.63×103copies/mL、3.01×104copies/mL和1.03×106copies/mL，拷貝數(shù)D組>>C組>>A組>B組；4個(gè)組aph(3′)-Ⅱa的拷貝數(shù)分別為3.43×103copies/mL、1.86×103copies/mL、2.17×104copies/mL和6.64×105copies/mL，拷貝數(shù)D組>>C組>A組>B組；4個(gè)組aac(6′)-Ⅰb的拷貝數(shù)分別為5.50×105copies/mL、3.25×105copies/mL、2.34×106copies/mL和4.00×106copies/mL，拷貝數(shù)D組>C組>A組>B組；4個(gè)組aac(3)-Ⅱ的拷貝數(shù)分別為7.04×103copies/mL、6.00×103copies/mL、1.53×104copies/mL和1.43×105copies/mL，拷貝數(shù)D組>>C組>A組>B組。

圖5 第二次加藥后4組6種抗生素抗性基因拷貝數(shù)Fig.5 Copy numbers of 6 antibiotic resistance genes in 4 groups after the second dosing

2.4 生物絮團(tuán)中異養(yǎng)細(xì)菌生物群落數(shù)量

如圖6所示，在連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后4個(gè)實(shí)驗(yàn)組與初始水樣的異養(yǎng)菌生物群落數(shù)量相差較大，各組培養(yǎng)后菌群擴(kuò)增量較大與初始組有顯著差異。連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的異養(yǎng)菌群落數(shù)量為B組>C組>D組>A組。其中B組與A組、C組、D組有顯著差異，A組、C組和D組無(wú)顯著差異。

圖6 第二次加藥后初始和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的異養(yǎng)菌數(shù)量Fig.6 The number of heterotrophic bacteria in the initial and 4 experimental groups after the second dosing

3 討論

3.1 不同濃度硫酸新霉素對(duì)生物絮團(tuán)氨氮轉(zhuǎn)化的影響

通過(guò)第一次連續(xù)監(jiān)測(cè)，直觀地看出硫酸新霉素的添加會(huì)對(duì)水體氨氮處理速率產(chǎn)生影響，硫酸新霉素的濃度越高影響越大，第一次加藥后的氨氮處理速率也就越低。但是通過(guò)一個(gè)休藥期的培養(yǎng)后，水體中的菌群對(duì)硫酸新霉素有了明顯的抗性，同樣的濃度再次添加已經(jīng)無(wú)法對(duì)氨氮處理速率產(chǎn)生負(fù)面的影響，反而在添加了較高濃度硫酸新霉素的D組中，較高濃度的硫酸新霉素在不影響亞硝氮和硝氮轉(zhuǎn)化的情況下，促進(jìn)了氨氮轉(zhuǎn)化的速率。這和LI等[15]使用四環(huán)素對(duì)生物膜系統(tǒng)對(duì)脫氮性能探究的結(jié)果相反。據(jù)推測(cè)，高濃度硫酸新霉素的選擇使菌群多樣性降低同時(shí)也對(duì)具有抗生素抗性的細(xì)菌大量富集，使之成為新的優(yōu)勢(shì)種。在適應(yīng)高濃度抗生素環(huán)境后，相關(guān)菌群恢復(fù)了其生態(tài)功能，且菌群數(shù)量較加藥前有所提升，最終使生物絮團(tuán)對(duì)氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化速率提高。

3.2 不同濃度硫酸新霉素在生物絮團(tuán)中累積情況

在對(duì)第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)前和第二次連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)束后3 d的水體進(jìn)行采集送樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水體中的抗生素含量低于檢測(cè)閾值未能檢出或者已經(jīng)被分解甚至轉(zhuǎn)移至絮團(tuán)內(nèi)部。這與LIANG等[16]在研究通過(guò)生物膜法去除抗生素抗性基因的時(shí)候?qū)τ谒w中硫酸新霉素去除率的結(jié)果相似。這說(shuō)明了生物絮團(tuán)在適應(yīng)抗生素環(huán)境后，能夠快速轉(zhuǎn)移和代謝水體中的硫酸新霉素。不過(guò)這也反映出，水體中硫酸新霉素并不能維持在所使用濃度條件下。那么在生物絮團(tuán)中使用抗生素時(shí)，濃度的選擇要與常規(guī)養(yǎng)殖模式有所區(qū)別。

3.3 不同濃度硫酸新霉素對(duì)生物絮團(tuán)抗生素抗性基因的影響

在對(duì)第二次加藥后的生物絮團(tuán)進(jìn)行抗生素抗性基因檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)了硫酸新霉素的添加對(duì)于aph(3′)-Ia、aph(3′)-Ⅱa、aac(6′)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱ這四種硫酸新霉素抗性基因具有較大的選擇和富集的能力，尤其是aph(3′)-Ia、aph(3′)-Ⅱa和aac(3)-Ⅱ這三種基因隨著硫酸新霉素濃度的增加，基因拷貝數(shù)成倍上漲，呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。這與ZHAO等[17]在活性污泥反應(yīng)器中使用不同種類(lèi)抗生素得出的結(jié)果相似。但是本實(shí)驗(yàn)中添加了0.5 mg/L硫酸新霉素的B組，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的所有抗生素抗性基因均低于未添加抗生素的A組，這與ZHAO等[17]和WAN等[18]的結(jié)論有所差異，推測(cè)原因可能是低濃度的硫酸新霉素對(duì)于絮團(tuán)的選擇壓力較小，而B(niǎo)組的細(xì)菌群落數(shù)量有大幅增加，使對(duì)應(yīng)的幾種抗生素抗性基因相對(duì)豐度降低。