馬鈞，樊安平，王武生，張金川，江曉軍，馬瑞軍，賈社強(qiáng)，劉飛，雷初朝，黃永震

研究報(bào)告

全基因組重測(cè)序解析秦川牛保種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

馬鈞1，樊安平2，王武生2，張金川2，江曉軍2，馬瑞軍2，賈社強(qiáng)2，劉飛2，雷初朝1，黃永震1

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100 2. 陜西省農(nóng)牧良種場(chǎng)，寶雞 722203

在畜禽資源保護(hù)中，群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是決定保種效果的重要因素。本研究采用全基因組重測(cè)序技術(shù)檢測(cè)100頭秦川牛(30頭公牛、70頭母牛)的基因組變異，通過(guò)分析群體遺傳多樣性、連續(xù)純合片段(runs of homozygosity，ROH)分布特征、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)，對(duì)秦川牛的保種效果進(jìn)行了綜合評(píng)估。結(jié)果顯示，100頭秦川牛共檢測(cè)到20,968,017個(gè)高質(zhì)量SNPs位點(diǎn)，平均最小等位基因頻率為0.191±0.124，平均多態(tài)信息含量為0.279±0.131，平均觀(guān)察雜合度為0.275±0.131，平均期望雜合度為0.279±0.131，表明秦川保種群遺傳多樣性較為豐富。秦川牛保種群體平均狀態(tài)同源(identity by state，IBS)遺傳距離為0.243±0.020，其中公牛為0.242±0.021，親緣關(guān)系G矩陣結(jié)果與IBS距離矩陣結(jié)果一致，均顯示秦川牛保種群部分個(gè)體間親緣關(guān)系較近。100頭秦川牛個(gè)體共檢測(cè)到8258個(gè)基因組ROH，ROH總長(zhǎng)度為9.64 GB，平均ROH長(zhǎng)度為1.167±1.203 Mb，69.35%的ROH是長(zhǎng)度為0.5～1 Mb的短ROH。個(gè)體平均ROH總長(zhǎng)度為96.40 Mb?；赗OH的平均近交系數(shù)為0.039±0.039，其中30頭秦川公牛的平均近交系數(shù)為0.044±0.035，表明部分公牛個(gè)體存在一定程度的近交積累。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，秦川牛保種群所測(cè)個(gè)體可分為8個(gè)家系，包括7個(gè)含公牛家系和1個(gè)不含公牛家系。本研究表明，秦川牛保種群的遺傳多樣性較為豐富，未出現(xiàn)較大程度近交積累，但部分個(gè)體間存在近交風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)強(qiáng)化選配以確保秦川牛資源的可持續(xù)發(fā)展。

秦川牛；全基因組重測(cè)序；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；親緣關(guān)系

根據(jù)《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄(2021年版)》，我國(guó)目前擁有55個(gè)地方普通牛品種，是世界上牛種資源最多的國(guó)家之一。然而，近年來(lái)引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良牛種雜交改良本土黃牛，雖然在一定程度上提高了國(guó)內(nèi)牛肉生產(chǎn)水平，但也加劇了本土純種黃牛數(shù)量的減少。畜禽種質(zhì)資源是國(guó)家的戰(zhàn)略性資源，做好地方品種的保種工作對(duì)于落實(shí)種業(yè)振興戰(zhàn)略至關(guān)重要。秦川牛是我國(guó)優(yōu)良地方黃牛品種，具有體軀高大、適應(yīng)性好、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)致、瘦肉率高及大理石紋品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，是一個(gè)種質(zhì)特色鮮明的優(yōu)良地方品種[1]。然而，目前秦川牛保種群體的遺傳多樣性及其家系結(jié)構(gòu)尚不清楚，嚴(yán)重阻礙了秦川牛種質(zhì)資源的保護(hù)和利用，亟需相關(guān)研究為該群體保種及選配工作的科學(xué)開(kāi)展提供理論指導(dǎo)。

遺傳多樣性是生物適應(yīng)環(huán)境與進(jìn)化的基石，也是評(píng)估種質(zhì)資源現(xiàn)狀的重要參考指標(biāo)[2]。群體的遺傳多樣性越高，適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)[3]。衡量群體遺傳多樣性有助于了解群體的種質(zhì)資源現(xiàn)狀和未來(lái)趨勢(shì)，是畜禽種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵[4]。評(píng)估基因組親緣關(guān)系及近交系數(shù)有助于了解群體內(nèi)親緣關(guān)系和近交水平，為制定合理的選配計(jì)劃提供參考。連續(xù)純合片段(runs of homozygosity，ROH)是生物基因組中純合基因型的連續(xù)片段，是子代繼承了親本的相同單倍型而形成的[5]。研究表明，基因重組、近親交配、自然和人工選擇會(huì)影響ROH在基因組中的大小和分布[6]。ROH分析可用于評(píng)估群體遺傳多樣性[5,7]、解析近交水平[8]、推測(cè)近交歷史[9]、人工選擇的追蹤[10]及優(yōu)化育種規(guī)劃等[11]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymer-phism，SNP)是一種廣泛存在于基因組中的遺傳變異，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源評(píng)估、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化等研究[12～14]。目前，常見(jiàn)的SNP分型方法包括全基因組重測(cè)序(whole genome sequ-en-cing，WGS)、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序、SNP芯片等。在馬身豬保種群中使用50K SNP芯片進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)該群體的遺傳多樣性豐富，但近交程度高[15]。在青峪豬保種群體的遺傳多樣性和家系結(jié)構(gòu)評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)該群體在閉鎖繁育中出現(xiàn)了遺傳多樣性損失[16]。在合川黑豬保種群中，發(fā)現(xiàn)該群體遺傳多樣性較豐富，但部分個(gè)體間存在較大的近交風(fēng)險(xiǎn)[17]。利用GBS(genotyping by sequencing)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)評(píng)估麥洼牦牛3個(gè)保種群的保種效果，表明現(xiàn)有保種策略是可行的，研究結(jié)果為麥洼牦牛的保護(hù)和利用提供了一定遺傳學(xué)參考[18]。師睿等[19]基于SNP芯片數(shù)據(jù)分析新疆近交牛的基因組純合程度，為該種質(zhì)的育種規(guī)劃及后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供了一定參考依據(jù)。李隱俠等[20]基于綿羊SNP 50K v3芯片對(duì)柯?tīng)柨俗窝蜻M(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示柯?tīng)柨俗窝蜻z傳多樣性較豐富，群體近交程度低。馬克巖等[21]基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)永登七山羊的遺傳多樣性較低，與其他3個(gè)甘肅地方綿羊品種(蘭州大尾羊、灘羊和岷縣黑裘皮羊)有明顯分化。

本研究以陜西省農(nóng)牧良種場(chǎng)—國(guó)家秦川牛保種場(chǎng)的100頭秦川牛保種個(gè)體為研究對(duì)象，基于全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估了該群體的遺傳多樣性、近交系數(shù)、親緣關(guān)系及家系結(jié)構(gòu)，以解析秦川牛保種群的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，旨在為該群體優(yōu)質(zhì)保種、科學(xué)選配及開(kāi)發(fā)利用提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選取來(lái)自陜西省農(nóng)牧良種場(chǎng)(國(guó)家秦川牛保種場(chǎng))100頭年齡在2～4歲之間的種牛為研究對(duì)象，其中公牛30頭，母牛70頭(表1)。為了方便后續(xù)數(shù)據(jù)分析和對(duì)比研究，采用“真實(shí)牛號(hào)＋性別”的方式標(biāo)識(shí)牛只個(gè)體號(hào)。所有牛只使用一次性含EDTA抗凝劑的真空采血管頸靜脈采血，每頭牛采集血液6 mL，與管內(nèi)EDTA抗凝劑充分混勻后，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，于-20℃冰箱冷凍保存。血液基因組DNA使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒(DP348-03)進(jìn)行提取，將提取的DNA樣品用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，Nanodrop檢測(cè)DNA的純度(260/280比值)，并使用Qubit 2.0(美國(guó)Invitrogen公司)對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。根據(jù)美國(guó)Illumina公司推薦的基因組重測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行文庫(kù)制備，使用Illumina NovaSeq平臺(tái)生成150 bp雙末端reads。

1.2 基因組SNPs檢測(cè)

下機(jī)的原始數(shù)據(jù)利用Trimmomatic軟件去除接頭和低質(zhì)量reads[22]，然后用BWA-MEM軟件比對(duì)至牛參考基因組(ARS-UCD 1.2)[23]。隨后，利用 SAMtools軟件對(duì)比對(duì)后的bam文件進(jìn)行排序[24]，排序后使用Picard (https://broadinstitute.github.io/picard/)的MarkDuplicates模塊去除重復(fù)的reads。利用GATK v4.3.0.0的BaseRecalibrator 模塊進(jìn)行堿基質(zhì)量重校正[25]。對(duì)于校正后的bam文件，利用 Qualimap 2軟件統(tǒng)計(jì)樣本的測(cè)序深度[26]。使用GATK的HaplotypeCaller模塊分別對(duì)每條常染色體進(jìn)行變異檢測(cè)，并用GenotypeGVCFs模塊合并得到總VCF文件，最后使用SelectVariants模塊處理得到SNP數(shù)據(jù)集。

表1 秦川牛樣品采集信息

個(gè)體號(hào)中的M和F分別表示公牛和母牛。

1.3 基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控

為得到高質(zhì)量基因組變異數(shù)據(jù)，首先利用GATK v4.3.0.0的VariantFiltration模塊對(duì)SNP進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾參數(shù)采用GATK官方推薦的標(biāo)準(zhǔn)：①Variant Confidence/Quality by Depth(QD)<2.0；②RMS Mapping Quality(MQ)< 40.0；③Phred-scaled-value using Fisher’s exact test to detect strand bias(FS)> 60；④Z-score according to the Wilcoxon rank sum test of Alt. Ref read mapping qualities(MQRankSum)< –12.5；⑤Z-score according to the Wilcoxon rank sum test of Alt. Ref read position bias(ReadPos-Rank-Sum)<–8；⑥Symmetric Odds Ratio of 2×2 contin-gency table to detect strand bias(SOR)>3.0[25]。然后，使用BCFtools v1.8過(guò)濾得到雙等位SNP集合[27]。最后，使用PLINK v1.9軟件去除不符合哈代溫伯格平衡、MAF值小于0.05和性染色體上的SNP位點(diǎn)，以及基因型缺失大于10%的個(gè)體[28]，獲得20,968,017個(gè)常染色體SNPs位點(diǎn)用于后續(xù)分析。最后使用PLINK基于位點(diǎn)間的連鎖不平衡進(jìn)行過(guò)濾，參數(shù)為“--indep-pairwise 50 5 0.2”，通過(guò)過(guò)濾后的1,052,677個(gè)SNPs位點(diǎn)用于親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)分析。

1.4 遺傳多樣性分析

為了解現(xiàn)有秦川牛保種群體的基因組遺傳多樣性現(xiàn)狀。本研究利用PLINK v1.9軟件通過(guò)計(jì)算期望雜合度(expected heterozygosity，He)、觀(guān)察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)，對(duì)秦川牛保種群體的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估[28]。

1.5 全基因組ROH統(tǒng)計(jì)分析

本研究利用PLINK v1.9軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的基因組純合性片段，參數(shù)設(shè)置為：滑窗大小設(shè)為50個(gè)SNP(--homozyg-window-snp 50)，一段ROH中每50 kb必須有1個(gè)SNP(--homozyg-density 50)，滑動(dòng)窗口允許3個(gè)SNP位點(diǎn)雜合(--homozyg-window- het 3)，窗口允許缺少數(shù)設(shè)為5(--homozyg-window- missing 5)[28]。對(duì)ROH在秦川牛群體中的分布、長(zhǎng)度和數(shù)目情況等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為更加了解群體歷史，進(jìn)一步將其根據(jù)物理長(zhǎng)度分為短片段(0.5～1 Mb)、中片段(1～5 Mb)和長(zhǎng)片段(>5 Mb)三類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)?；赗OH的基因組近交系數(shù)(F)由每個(gè)個(gè)體檢測(cè)到的常染色體ROH片段總長(zhǎng)度占基因組常染色體總長(zhǎng)度(2.5 Gb)的比值進(jìn)行計(jì)算[29]，公式為：

1.6 秦川牛保種群體親緣關(guān)系分析

為了評(píng)估個(gè)體間的親緣關(guān)系，采用IBS遺傳距離和G矩陣兩種方法進(jìn)行分析[30]。使用PLINK v1.9軟件計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離，構(gòu)建IBS距離矩陣。使用GCTA v1.94.1軟件構(gòu)建個(gè)體間的親緣關(guān)系G矩陣。最后，使用R語(yǔ)言繪制熱圖可視化個(gè)體之間的IBS遺傳距離和G矩陣結(jié)果，并分析保種群個(gè)體間的親緣關(guān)系。

1.7 秦川牛群體家系構(gòu)建

為了解析試驗(yàn)群體的家系結(jié)構(gòu)，采用PHYLIP v3.69軟件基于個(gè)體之間IBS距離矩陣使用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[31]，并使用FigTree v1.3.1軟件進(jìn)行可視化[32]。然后，結(jié)合親緣關(guān)系分析結(jié)果，以個(gè)體間親緣關(guān)系系數(shù)大于等于0.1為標(biāo)準(zhǔn)劃分家系，分析秦川牛保種群體的家系結(jié)構(gòu)[17,20,30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛基因組遺傳多樣性分析結(jié)果

本研究對(duì)100頭秦川牛進(jìn)行基因組重測(cè)序，產(chǎn)生22,024,263,265個(gè)高質(zhì)量reads，其中99.84%的reads可比對(duì)到參考基因組上，所有樣本的平均測(cè)序深度達(dá)到11.68×。通過(guò)GATK v4.3.0.0、BCFtools v1.8和PLINK v1.9等一系列軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本的基因組變異進(jìn)行質(zhì)控，最終獲得一個(gè)包含20,968,017個(gè)SNPs位點(diǎn)的秦川牛高質(zhì)量基因組SNP變異集合。在常染色體中，1號(hào)染色體上鑒定到的SNPs數(shù)目最多，為1,316,538個(gè)；25號(hào)染色體的SNPs數(shù)目最少，為373,259個(gè)(圖1)。功能注釋結(jié)果如圖2所示，這些SNPs主要分布在基因間區(qū)(12,424,579，59.25%)或內(nèi)含子區(qū)(7,924,936，37.80%)；外顯子僅占總SNPs數(shù)量的0.74%(156,185)，包括51,581個(gè)非同義SNPs和100,071個(gè)同義SNPs。

所有個(gè)體的基因型平均檢出率為0.997?；讷@得的高質(zhì)量SNPs評(píng)估秦川牛保種群體的遺傳多樣性水平，結(jié)果顯示，秦川牛群體基因組SNP變異的MAF介于0.05～0.1的比例最高，為31.54%，介于0.4～0.5的占比最低，為9.2%，平均MAF為0.191±0.124(圖3A，表2)?；蚪MSNPs的多態(tài)信息含量范圍介于0.098～0.500之間，平均多態(tài)信息含量為0.279±0.131，具體分布如圖3B所示。其中，多態(tài)信息含量在0～0.25之間的SNPs有10,145,311個(gè)，占48.38%；多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間的SNPs有10,822,706個(gè)，占比51.62%。秦川牛保種群平均觀(guān)察雜合度為0.275±0.131，平均期望雜合度為0.279±0.131(表2)，平均觀(guān)察雜合度略小于平均期望雜合度，但二者相差不大，推測(cè)其可能受到了選擇或近交。

圖1 秦川牛基因組SNPs在每條染色體上的分布情況

圖2 秦川?；蚪MSNPs功能注釋

圖3 秦川牛保種群體遺傳多樣性分析結(jié)果

A：最小等位基因頻率占比圖；B：多態(tài)信息含量占比圖。

表2 秦川牛群體遺傳多樣性

2.2 秦川牛保種群體IBS距離矩陣分析結(jié)果

利用Plink v1.9軟件計(jì)算秦川牛個(gè)體間IBS遺傳距離，結(jié)果顯示100頭秦川牛個(gè)體間IBS距離值介于0.128～0.278之間，平均IBS值為0.243±0.020，表明個(gè)體間的平均遺傳距離較遠(yuǎn)，且差異較大；30頭種公牛之間IBS遺傳距離在0.128～0.269之間，平均遺傳距離為0.242±0.021，表明種公牛之間的遺傳距離均較遠(yuǎn)。秦川牛保種群體IBS距離矩陣可視化結(jié)果如圖4所示。大部分秦川牛個(gè)體間IBS遺傳距離較遠(yuǎn)，呈中等程度的親緣關(guān)系(圖4顏色較深的方格)；部分個(gè)體間的IBS遺傳距離較近，存在較高的親緣關(guān)系(圖4顏色較淺的方格)，表明該保種群存在較大的潛在近交風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 秦川牛保種群體G矩陣分析結(jié)果

基于全基因組SNPs位點(diǎn)構(gòu)建的G矩陣能真實(shí)反映個(gè)體間的親緣關(guān)系。利用GCTA軟件構(gòu)建基因組關(guān)系G矩陣，進(jìn)一步分析秦川牛保種群體的親緣關(guān)系。結(jié)果如圖5所示，顏色越接近紅色表示親緣關(guān)系越近。同IBS距離矩陣結(jié)果相似，大部分個(gè)體間的親緣關(guān)系呈中等程度(圖5中顏色較淺的方格)，但部分牛之間的親緣關(guān)系較近(圖5中顏色較深的方格)，均表明秦川牛保種群體存在較大的近交風(fēng)險(xiǎn)，必須強(qiáng)化選配措施。

橫、縱坐標(biāo)為本研究所使用的100頭秦川牛個(gè)體，每一個(gè)小方格代表兩個(gè)個(gè)體間的遺傳距離值，顏色越接近紅色表明兩個(gè)個(gè)體間的遺傳距離越大，反之亦然。

2.4 秦川牛保種群體基因組ROH基本統(tǒng)計(jì)及近交系數(shù)結(jié)果

本研究在100頭秦川牛保種群體中共檢測(cè)到8258個(gè)ROH片段，ROH總長(zhǎng)度為9.64 GB；平均每頭秦川牛有82.58個(gè)ROH片段，個(gè)體平均ROH總長(zhǎng)度為96.40 Mb，單個(gè)ROH片段平均長(zhǎng)度為1.167±1.203 Mb。圖6A展示了秦川牛群體單個(gè)ROH長(zhǎng)度分布情況，發(fā)現(xiàn)大部分ROH長(zhǎng)度都在4 Mb以下，長(zhǎng)度為0.5～1 Mb的ROH最多，占比69.35%，其次是長(zhǎng)度為1～2 Mb的ROH，比例為17.89%，大于4 Mb的占比很小。在整個(gè)研究群體中，不同牛只檢測(cè)出的ROH數(shù)目變化較大，從最少的25個(gè)ROH片段到最多的328個(gè)ROH片段。個(gè)體基因組ROH總長(zhǎng)度范圍在21.50～880.90 Mb之間，在100頭秦川牛中，79頭牛的ROH長(zhǎng)度在50～100 MB之間(圖6B)。ROH在染色體上的數(shù)量分布如圖6C所示，在秦川牛的29條常染色體上，1號(hào)染色上分布數(shù)目最多，為637個(gè)，28和29號(hào)染色體上分布數(shù)目最少，均為85個(gè)。從染色體上ROH分布長(zhǎng)度看，1號(hào)染色體ROH總長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為775.71 Mb，而29號(hào)染色體分布的ROH長(zhǎng)度最短，為110.07 Mb(圖6D)。為深入了解群體歷史，進(jìn)一步將ROH依據(jù)物理長(zhǎng)度將其分成長(zhǎng)、中、短三類(lèi)，結(jié)果如圖6E所示。0.5～1 Mb之間的短ROH片段數(shù)目和長(zhǎng)度分別是5727個(gè)和3764.76 Mb，1～5 Mb之間的中ROH片段數(shù)目和長(zhǎng)度分別為2344個(gè)和4594.06 Mb，大于5 Mb的長(zhǎng)ROH片段數(shù)目和長(zhǎng)度分別為187個(gè)和1281.38 Mb。短ROH數(shù)目在總ROH數(shù)目中比例最大，但其長(zhǎng)度在總長(zhǎng)度中占比并非最大，在ROH總長(zhǎng)度中占比最多的是1～5 Mb的ROH。基于ROH的近交系數(shù)F分析結(jié)果顯示(圖6F)，現(xiàn)有保種群的個(gè)體近交系數(shù)范圍在0.009～0.352之間，平均近交系數(shù)為0.039± 0.039，其中母牛個(gè)體號(hào)為1294F的個(gè)體近交系數(shù)最大為0.352。30頭秦川公牛F為0.044±0.035，略高于保種群整體平均水平，表明部分公牛個(gè)體已出現(xiàn)一定程度的近交積累。

圖5 秦川牛保種群G矩陣分析可視化結(jié)果

橫、縱坐標(biāo)為本研究所使用的100頭秦川牛個(gè)體，每一個(gè)小方格代表兩個(gè)個(gè)體間的親緣關(guān)系，顏色越接近紅色表明兩個(gè)個(gè)體間的親緣關(guān)系越近，反之亦然。

圖6 秦川?；蚪MROH統(tǒng)計(jì)分析

A：秦川?；蚪M單個(gè)ROH占比統(tǒng)計(jì)；B：秦川牛個(gè)體ROH長(zhǎng)度的樣本數(shù)分布；C：ROH在不同染色體上的數(shù)量分布情況；D：ROH在不同染色體上的長(zhǎng)度分布情況；E：短、中和長(zhǎng)三類(lèi)ROH的數(shù)量和長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖；F：基于ROH的近交系數(shù)可視化。

2.5 秦川牛保種群體家系結(jié)構(gòu)分析

由于種公牛在保種群中的重要性，本研究使用NJ法對(duì)30頭公牛進(jìn)行了聚類(lèi)分析。結(jié)合基因組親緣關(guān)系分析結(jié)果，以公牛間基因組親緣系數(shù)大于等于0.1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類(lèi)分析[17,20,30]。結(jié)果如圖7所示，現(xiàn)有種公牛樣本可分為7個(gè)家系，分別命名為家系A(chǔ)、家系B、家系C、家系D、家系E、家系F和家系G。進(jìn)化樹(shù)中用同一顏色標(biāo)注的樣本被評(píng)估為同一家系(表3)。其中，存在部分交叉?zhèn)€體。例如，樣本1329M既與家系E的個(gè)體親緣關(guān)系較近，又與家系D的部分個(gè)體(1278M)親緣關(guān)系較近，所以同時(shí)被歸并到這兩個(gè)家系中。最終，這7個(gè)家系分別含有10、7、2、3、3、2和4個(gè)公牛。根據(jù)所有個(gè)體間的G矩陣親緣關(guān)系分析結(jié)果，將與公牛的親緣關(guān)系值大于0.1的母牛與公牛劃分為同一家系，最終將保種群所測(cè)個(gè)體分為7個(gè)含有公牛的家系。在這7個(gè)家系外，還有13頭母牛與所檢測(cè)的公牛親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)，將其劃分至1個(gè)不包含公牛血緣的家系H(表3)。此外，部分家系中的母牛存在交叉現(xiàn)象，同時(shí)被歸并到不同的家系中。其中母牛1109F同時(shí)被劃分到B和E家系中，母牛1409F同時(shí)被劃分到家系D和E，母牛1158F同時(shí)被劃分到家系E和F，母牛1185F同時(shí)被劃分到家系A(chǔ)和G，母牛1144F同時(shí)被劃分到家系A(chǔ)、B、C和F中。

圖7 秦川牛保種群體公牛進(jìn)化樹(shù)結(jié)果

3 討論

畜禽種質(zhì)資源是保障國(guó)家畜產(chǎn)品供給的戰(zhàn)略性資源，是種業(yè)振興的物質(zhì)基礎(chǔ)。保種工作旨在維護(hù)種群內(nèi)的基因多樣性，減少遺傳漂變和基因缺失等的不良影響，保障群體的健康發(fā)展和適應(yīng)環(huán)境能力，促進(jìn)畜禽品種改良和創(chuàng)新[33]?？茖W(xué)評(píng)估保種效果可以確定現(xiàn)有群體是否存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)以及采取何種措施進(jìn)行改善。秦川牛是我國(guó)優(yōu)良的地方黃牛品種，在我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，但現(xiàn)有保種群的全基因組遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)尚未得到系統(tǒng)性研究。本研究采用全基因組重測(cè)序技術(shù)檢測(cè)秦川牛保種場(chǎng)的100頭秦川牛，鑒定到20,968,017個(gè)SNPs位點(diǎn)，并基于這些高質(zhì)量SNPs從遺傳多樣性、親緣關(guān)系、近交水平和家系結(jié)構(gòu)等方面對(duì)保種群的保種效果進(jìn)行評(píng)估，為秦川牛保種群制定保種計(jì)劃提供科學(xué)依據(jù)。

遺傳多樣性反映了物種或種群在進(jìn)化過(guò)程中的適應(yīng)性和生存能力，種群內(nèi)的基因多樣性越高，意味著群體更具適應(yīng)性和生存能力[21,34]。雜合度水平對(duì)生物體的機(jī)能表現(xiàn)有深遠(yuǎn)的影響，有研究發(fā)現(xiàn)生物體的雜合度與其適應(yīng)性(例如生長(zhǎng)速率、存活率或繁殖力)之間存在正相關(guān)[35]，而低雜合度與近親繁殖抑郁癥和適應(yīng)性降低有關(guān)[36]。Gao等[37]基于BovineSNP50芯片發(fā)現(xiàn)包括32頭秦川牛在內(nèi)45個(gè)世界范圍牛品種的Ho為0.142～0.327，其中32頭秦川牛的Ho為0.297。本研究中，秦川?；蚪M的Ho和He分別為0.275±0.131和0.279±0.131，屬于中等雜合度水平，但雜合度有所降低。同時(shí)，與Zhang等[38]基于7003個(gè)SNPs在30頭秦川牛的研究結(jié)果(Ho：0.370；He：0.364)也相差較大，這可能與研究所用位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)選擇、采樣地區(qū)以及樣本數(shù)目有關(guān)。本研究采用全基因組重測(cè)序進(jìn)行分析，相對(duì)于商業(yè)芯片，獲得的基因組SNP變異更加全面。然而，試驗(yàn)所用保種群個(gè)體經(jīng)長(zhǎng)期閉群繁育，可能存在遺傳多樣性有所降低的問(wèn)題。此外，秦川?；蚪M的平均觀(guān)察雜合度略低于平均期望雜合度，但二者相差不大，表明該保種群具有較低的雜合子喪失，推測(cè)其可能受到了一定程度選擇壓力，但未出現(xiàn)顯著的遺傳漂移或近交等。最小等位基因頻率是對(duì)每個(gè)群體中不常見(jiàn)等位基因頻率的估計(jì)[39]。秦川牛群體MAF分布結(jié)果顯示，該群體低等頻率的等位基因數(shù)目較多，而較高M(jìn)AF值的SNPs相對(duì)較少，表明該群體的遺傳多樣性程度相對(duì)較高?；蚪M多態(tài)信息含量反映某一位點(diǎn)在群體中的多態(tài)程度，常用來(lái)評(píng)估群體遺傳多樣性。根據(jù)Botstein等[40]報(bào)道，對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)，PIC值大于0.5時(shí)，可被視為高多態(tài)性位點(diǎn)；反之，當(dāng)PIC值小于0.25時(shí)，歸類(lèi)為低多態(tài)性位點(diǎn)；而當(dāng)PIC值處于0.25～0.5之間時(shí)，則屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)秦川牛保種群基因組SNPs位點(diǎn)的PIC值分布相對(duì)均勻，平均PIC值為0.279±0.131，大部分位點(diǎn)PIC值都分布在0.1～0.5之間，其中51.62%的SNPs位點(diǎn)多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間，說(shuō)明該群體的遺傳多樣性較為豐度，具有中度遺傳變異，尤其在較高的PIC值區(qū)間內(nèi)。以上結(jié)果表明，近年來(lái)秦川牛保種群體所采用的保種措施有效，群體遺傳多樣性并未出現(xiàn)明顯丟失。

表3 秦川牛保種群體家系劃分結(jié)果

個(gè)體號(hào)中的M和F分別表示公牛和母牛。

ROH在基因組上的分布情況反映了群體遺傳多樣性、近交歷史及近交水平等[5,7～9]，并且研究發(fā)現(xiàn)基于ROH計(jì)算的近交系數(shù)(F)與基于系譜的近交系數(shù)(F)具有較高相關(guān)性，且比F、F等近交系數(shù)計(jì)算方法更能反映群體真實(shí)近交水平[41]。短ROH表示發(fā)生在較遠(yuǎn)時(shí)期的親緣關(guān)系，長(zhǎng)ROH反映近期發(fā)生的近交[42]。長(zhǎng)ROH數(shù)目越多，家系內(nèi)存在近交的可能性越高。本研究在100頭秦川牛保種個(gè)體中共檢測(cè)到8258個(gè)ROH片段，其中長(zhǎng)度為0.5～1 Mb的短ROH數(shù)目最多，長(zhǎng)度為5 Mb以上的ROH數(shù)目最少，揭示秦川牛保種群在較近時(shí)期并未出現(xiàn)較大程度近交。基于ROH的近交系數(shù)分析顯示，秦川牛保種群的近交系數(shù)為0.039±0.039，處于相對(duì)較低的近交水平，但高于先前研究報(bào)道的麥洼牦牛保種群的平均近交系數(shù)(0.0168)[18]。30頭公牛的平均近交水平略高于整體平均水平，表明部分公牛個(gè)體已出現(xiàn)一定程度的近交積累，在后續(xù)種公牛選留中建議保留近交水平較低的個(gè)體，以避免保種群遺傳多樣性喪失。此外，研究還發(fā)現(xiàn)部分個(gè)體具有較高的近交水平，其中母牛1294F個(gè)體的近交系數(shù)達(dá)到0.352，出現(xiàn)較高程度的近交。在后續(xù)保種工作中，對(duì)于這些近交系數(shù)相對(duì)較高的個(gè)體要適當(dāng)引入外血，或使用與其關(guān)系較遠(yuǎn)家系的公牛配對(duì)以降低其后代的近交系數(shù)。

目前，保種場(chǎng)普遍采用閉群繁育方式來(lái)保護(hù)畜禽遺傳資源，種群遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)極易受到人工選擇和雜交等因素的影響[43]。因此，理清保種群體個(gè)體間的親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)于保存群體遺傳多樣性及保障保種群體的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要?；贗BS遺傳距離和G矩陣的親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，部分秦川牛個(gè)體間的親緣關(guān)系相對(duì)較近，這些個(gè)體間具有較大的近交風(fēng)險(xiǎn)，在后續(xù)配種工作中，要避免這些親緣關(guān)系較近的公母牛進(jìn)行配對(duì)。此外，本研究中秦川牛保種群的平均IBS遺傳距離為0.243±0.020，公牛平均IBS遺傳距離為0.242±0.021，公牛的平均IBS遺傳距離略低于整個(gè)秦川牛保種群，這與先前蔡春波等[15]和劉彬等[16]分別在馬身豬和青峪豬保種群的研究結(jié)果有所不同，這表明部分秦川公牛之間親緣關(guān)系相對(duì)較近，因此在后期選留種公牛時(shí)需控制好親緣關(guān)系系數(shù)。由于家系構(gòu)成在保存畜禽遺傳多樣性中的重要作用，基于30頭種公牛的IBS遺傳距離構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并以個(gè)體間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度，將本研究所測(cè)秦川牛劃分了7個(gè)擁有種公牛的家系和1個(gè)不含公共公牛的家系，并且部分家系牛只存在交叉現(xiàn)象。

為了驗(yàn)證基因組分析在保種實(shí)踐中的可靠性，本研究查閱了保種場(chǎng)的系譜記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母牛1294F的父親和爺爺是同一頭公牛，證實(shí)了該牛只基因組近交系數(shù)過(guò)大是配種失誤產(chǎn)生的近交造成的。本研究進(jìn)一步將家系劃分結(jié)果與保種場(chǎng)系譜記錄進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在同一家系中，親緣關(guān)系熱圖上位置相近且顏色相似的個(gè)體大部分是同一頭種公?；蛟摷蚁灯渌５暮蟠?。此外，一些個(gè)體與兩個(gè)或多個(gè)家系的部分牛只都具有較高的親緣關(guān)系值，是由于其擁有相同的母親或祖代。因此，基于基因組的家系研究結(jié)果可有效填補(bǔ)個(gè)體系譜記錄不全的缺陷，優(yōu)化保種群的家系構(gòu)成，并發(fā)現(xiàn)畜禽保種中的潛在問(wèn)題。在后續(xù)保種選配過(guò)程中，可以結(jié)合家系結(jié)構(gòu)和保種場(chǎng)的系譜記錄，制定合理的配種方案，減少同一家系公母?jìng)€(gè)體之間的配種，從而科學(xué)地開(kāi)展保種工作，避免種群出現(xiàn)近交和品種內(nèi)分化。

本研究基于高通量全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)從遺傳多樣性、ROH分布特征、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)等方面對(duì)秦川牛的保種效果進(jìn)行綜合評(píng)估，發(fā)現(xiàn)秦川牛保種群的遺傳多樣性較為豐富；保種群體未出現(xiàn)大面積近交，但部分個(gè)體間存在較大的近交風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果可為秦川牛的保種選配工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of genetic diversity and genetic structure of Qinchuan cattle conservation population using whole-genome resequencing

Jun Ma1, Anping Fan2, Wusheng Wang2, Jinchuan Zhang2, Xiaojun Jiang2, Ruijun Ma2, Sheqiang Jia2, Fei Liu2, Chuchao Lei1, Yongzhen Huang1

In the conservation of livestock and poultry resources, population genetic diversity and genetic structure of the conservation population are important factors affecting the effectiveness of conservation. In this study, whole-genome resequencing technology was used to detect genomic variation in 100 Qinchuan cattle (30 bulls and 70 cows). By analyzing population genetic diversity, runs of homozygosity (ROH) distribution features, kinship relationships, and family structure, the conservation effectiveness of Qinchuan cattle was comprehensively evaluated. The results showed that a total of 20,968,017 high-quality SNPs were detected in 100 Qinchuan cattle, the average minimum allele frequency was 0.191±0.124, the average polymorphic information content was 0.279±0.131, and the average observed heterozygosity was 0.275±0.131, the average expected heterozygosity is 0.279±0.131, indicating that the genetic diversity of the Qinchuan cattle conservation population is relatively rich. The average identity by state (IBS) distance of the Qinchuan conservation population was 0.243±0.020, with a value of 0.242±0.021 for the bulls. The results of the kinship G-matrix were consistent with the results of the IBS distance matrix, both showing that some individuals in the conservation population had close kinship. A total of 8258 genomic ROH were detected in 100 Qinchuan cattle, with a total length of 9.64 GB. The average length of ROH fragments was 1.167±1.203 Mb, 69.35% of the ROH were short ROH with a length of 0.5～1 Mb, and the average total length of ROH per individual was 96.40 Mb. The average inbreeding coefficient based on ROH was 0.039±0.039, with a value of 0.044±0.035 for the bulls, indicating that some bulls had a certain degree of inbreeding accumulation. The results of the phylogenetic tree combined with kinship analysis showed that the individuals in the Qinchuan cattle conservation population could be divided into eight families, including seven families with bulls and one family without bulls. This study demonstrated that the genetic diversity of the Qinchuan conservation population is relatively rich, with no significant inbreeding accumulation, but there is a risk of inbreeding among some individuals. Therefore, it is necessary to strengthen selection and mating to ensure the sustainable development of Qinchuan cattle resources.

Qinchuan cattle; whole-genome resequencing; genetic diversity; genetic structure; kinship

2023-04-25;

2023-06-11;

2023-06-30

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2023-YBNY-141)和財(cái)政部與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部-國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(編號(hào)：CARS-37)資助[Sup-portedby the Key R&D project of Shaanxi Province (2023-YBNY-141) and Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs-National Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-37)]

馬鈞，在讀博士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: Junma96@163.com

黃永震，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: hyzsci@nwafu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-115

(責(zé)任編委: 趙要風(fēng))