宮為大，陶鋼，趙甜甜，楊悅，紀(jì)紅

遺傳資源

一例嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良的診療與基因檢測分析

宮為大，陶鋼，趙甜甜，楊悅，紀(jì)紅

安徽省蕪湖市第一人民醫(yī)院康復(fù)科，蕪湖 241060

嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良(infantile neuroaxonal dystrophy，INAD)是一種罕見的常染色體隱性遺傳神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為早期肌張力降低，可快速進(jìn)展為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育倒退、錐體束征陽性及痙攣型四肢癱瘓。本文報(bào)道1例中國INAD患兒，該患兒表現(xiàn)為肌張力降低，運(yùn)動(dòng)及語言發(fā)育遲緩，康復(fù)訓(xùn)練后得到改善?；驒z測結(jié)果提示該患兒基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，分別來自父親攜帶的雜合子變異c.496dupG (p.Glu166fsTer32)及其母親攜帶的雜合子變異c.2189T>G (p.Met730Arg)。變異p.Met730Arg尚未被報(bào)道，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測該變異蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可能發(fā)生改變，體外檢測結(jié)果表明該變異蛋白表達(dá)量顯著降低。本研究進(jìn)一步豐富了基因變異譜，有助于提升臨床醫(yī)生對INAD疾病的診斷意識(shí)。

嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良（INAD）；PLA2G6；康復(fù)治療

神經(jīng)退行性腦鐵積累癥(neurodegeneration with brain iron accumulation，NBIA)是一種罕見的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有進(jìn)行性認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能障礙，以及基底節(jié)鐵沉積增加的臨床特征[1]。目前已發(fā)現(xiàn)有15個(gè)基因缺陷與NBIA發(fā)生有關(guān)，其中包括編碼非Ca2+依賴型磷脂酶活性蛋白VIA-2型(iPLA2β)的基因，該基因變異可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜磷脂代謝紊亂以及細(xì)胞內(nèi)鐵沉積等[1,2]。與基因變異相關(guān)的疾病稱為磷脂酶A2相關(guān)神經(jīng)退行性病變(PLA2G6- associated neurodegeneration，PLAN)，是一組具有表型異質(zhì)性的常染色體隱性遺傳疾病，包括嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良(infantile neuroaxonal dystrophy，INAD)、非典型性神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良(atypical neuroaxonal dystrophy，ANAD)及早發(fā)性帕金森綜合征等[3]。INAD是發(fā)病年齡最早且臨床表現(xiàn)嚴(yán)重的一種亞型，患兒通常可在6月齡至3歲間發(fā)病，并表現(xiàn)為進(jìn)行性精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育倒退、張力減退、小腦共濟(jì)失調(diào)、痙攣型四肢癱瘓及視力障礙等[3,4]。由于INAD表型缺乏特異性且病例罕見，并易與腦癱及痙攣性截癱等疾病混淆，因此臨床診斷難度較大。

本文報(bào)道1例INAD患兒的診斷與康復(fù)治療過程，基因檢測結(jié)果提示其基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，并通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及體外功能實(shí)驗(yàn)分析變異潛在有害性。本研究豐富基因變異譜，并為INAD疾病遺傳學(xué)研究提供新的臨床資料以及提示臨床康復(fù)訓(xùn)練的重要性。

1 對象與方法

1.1 研究對象及臨床資料收集

患者，女，19月齡，漢族，系其母第一胎第一產(chǎn)，該患兒因“發(fā)育遲緩”于2022年10月收治本院康復(fù)科。收集患者病史，完善體格檢查、輔助檢查、影像學(xué)檢查以及基因檢測等臨床資料。本研究已獲得患者家長知情同意，并通過蕪湖市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 基因檢測及變異分析

采集患兒及家屬外周血各約3 mL，根據(jù)基因DNA提取試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)說明提取白細(xì)胞DNA，通過建立全外顯子組文庫后上機(jī)高通量測序儀NovaSeq6000(美國因美納公司)進(jìn)行測序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)人類基因組GRCh37/hg19版本參考序列比對后進(jìn)行質(zhì)控過濾并得到變異譜，變異查看包括dbSNP、ExAC及千人基因組等正常人群分布數(shù)據(jù)庫，并應(yīng)用在線平臺(tái)SIFT(http://sift. jcvi.org/)、Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/)預(yù)測變異生物危害性。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)(American College of Medical Genetics，ACMG)指南對變異進(jìn)行致病性評(píng)級(jí)[5]。變異參考Ensemble數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，再應(yīng)用ABI 3500XL分析儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行Sanger驗(yàn)證。

1.3 變異保守性分析

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索PLA2G6蛋白，選擇不同物種氨基酸序列后應(yīng)用Align功能對序列進(jìn)行比對分析。

1.4 變異型蛋白結(jié)構(gòu)分析

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查詢PLA2G6蛋白序列和結(jié)構(gòu)信息(https://www.uniprot.org/)并下載蛋白3D結(jié)構(gòu)文件，所有缺失殘基和Loop結(jié)構(gòu)使用modeller10.2軟件進(jìn)行補(bǔ)全，變異型結(jié)構(gòu)使用PyMOL 2.4版本軟件在野生型結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建，使用H++服務(wù)器(http://newbiophysics.cs.vt.edu/H++/)預(yù)測蛋白質(zhì)子化狀態(tài)后使用PyMOL 2.4版本軟件Align功能進(jìn)行對比，最后分析變異蛋白結(jié)構(gòu)局部變化。

1.5 變異型蛋白表達(dá)體外實(shí)驗(yàn)

在含10%胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中培養(yǎng)人293T細(xì)胞(上海細(xì)胞庫)，并在6孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)使用Lipofec-tamine 3000試劑(貨號(hào)：#L3000150，美國賽默飛公司)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。使用pECMV-FLAG-N載體，并按照Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase (貨號(hào)：#P505，中國諾唯贊公司)試劑盒說明進(jìn)行PLA2G6野生型組(PLA2G6-WT)質(zhì)粒構(gòu)建，擴(kuò)增引物：上游引物5′-GACGACGATAAGACTAAGCTTATGCAG-TTCTTTGGCCGCC-3′；下游引物5′-TGCTGGATA-TCTGCAGAATTCTCAGGGTGAGAGCAGCAGCT-GGA-3′。隨后按照Mut Express MultiS Fast Muta-genesis Kit V2(貨號(hào)：#C215，中國諾唯贊公司)說明構(gòu)建變異型組(PLA2G6-MUT)，擴(kuò)增引物：上游引物5′-AAGGAACTGGGCAAGAGGGTG-GTGGACTG--T-TGCACGG-3′；下游引物5′-CTCTTG-CCCAG-TT-CCTTGGCCCCAAAAACAGT-3′。經(jīng)測序驗(yàn)證后進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增提取。將轉(zhuǎn)染后的PLA2G6-WT及PLA2G6-MUT細(xì)胞應(yīng)用蛋白裂解液(中國碧云天公司)提取蛋白后進(jìn)行Western blot(WB)實(shí)驗(yàn)分析蛋白表達(dá)量，結(jié)果使用Image J軟件分析?？贵w信息：一抗鼠抗人FLAG (貨號(hào)：#8146，美國CST公司)，稀釋比例均為1∶1000；二抗Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody (貨號(hào)：#7076，美國CST公司)，稀釋比例為1∶5000。

2 結(jié)果與分析

2.1 患者臨床表現(xiàn)

該患兒7月齡起出現(xiàn)四肢無力癥狀，10月齡仍不能獨(dú)坐，在19月齡時(shí)因“獨(dú)立行走不穩(wěn)伴語言發(fā)育遲緩”就診。入院體格檢查：神志清、反應(yīng)一般、易哭鬧、言語表達(dá)簡單疊詞、問答不能、雙眼追視尚可，四肢肌張力偏低(4級(jí))，四肢協(xié)調(diào)性級(jí)精細(xì)動(dòng)作欠佳，雙手可主動(dòng)抓握但靈活性較差，獨(dú)站欠穩(wěn)、可室內(nèi)行走1 m左右、呈寬基底步態(tài)、雙下肢明顯膝過伸、雙足輕度外翻?；純喊l(fā)育里程碑落后，尤其運(yùn)動(dòng)及適應(yīng)性功能落后明顯。輔助檢查：血常規(guī)及生化檢查未見異常；頭顱核磁共振提示小腦萎縮，其他未見異常。

給予患兒運(yùn)動(dòng)療法、感覺統(tǒng)合療法、平衡功能訓(xùn)練、作業(yè)療法、手功能訓(xùn)練及足底反射等綜合康復(fù)治療1個(gè)月后，患兒獨(dú)立平地行走能力及語言表達(dá)能力得以改善(表1，表2)。

2.2 基因檢測結(jié)果

本次全外顯子組測序平均測序深度為110.67×，大于20×目標(biāo)區(qū)域平均覆蓋度為99.20%。分析結(jié)果提示該患兒基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，NM_003560：c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)，其父攜帶雜合子變異c.496dupG (p.Glu166fsTer32)，其母攜帶雜合子變異c.2189T>G (p.Met730Arg)。檢索人群分布頻率數(shù)據(jù)庫未見上述變異被收錄(PM2)。變異p.Glu166fs*32已被報(bào)道[6]，為功能缺失型(loss of function, LOF)變異，并可能導(dǎo)致基因功能缺失(PVS1)。變異p.Met730Arg在ClinVar及HGMD等數(shù)據(jù)庫未見報(bào)道，屬于基因新變異(PM3)。經(jīng)在線軟件預(yù)測變異p.Met730Arg可對蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響(PP3)。經(jīng)ACMG指南將變異p.Met730Arg評(píng)級(jí)為臨床意義不明，評(píng)級(jí)證據(jù)為PM2+PM3+PP3；將變異p.Glu166fs*32變異評(píng)級(jí)為可能致病性，評(píng)級(jí)證據(jù)為PVS1+PM2。Sanger測序證實(shí)變異的存在(圖1)。

表1 發(fā)育評(píng)估(Gesell量表)

Developmental Quotient，DQ：發(fā)育商

表2 粗大運(yùn)動(dòng)評(píng)估(GMFM-88評(píng)估)

2.3 變異保守性與蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

通過對不同物種間氨基酸序列的同源比對結(jié)果提示基因編碼蛋白166Glu及730Met位點(diǎn)保持高度同源(圖2A)。蛋白結(jié)構(gòu)模擬分析野生型結(jié)構(gòu)730Met位于α-螺旋結(jié)構(gòu)，與周圍殘疾無相互作用，但p.Met730Arg變異發(fā)生后與Asp733形成鹽橋以及與Val701形成氫鍵，這可能使局部結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)而引起穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響蛋白功能(圖2B)。

圖1 該患兒及其父母基因檢測結(jié)果

基因結(jié)果提示患兒基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，NM_003560: c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)，其父攜帶c.496dupG (p.Glu166fs*32)雜合子變異，其母攜帶c.2189T>G (p.Met730Arg)雜合子變異，Sanger測序證實(shí)變異的存在。

圖2 多物種保守性與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果

A：PLA2G6蛋白166E與730M氨基酸在不同物種間具有保守性；B：蛋白結(jié)構(gòu)模型分析。野生型Met730未比周圍殘基產(chǎn)生作用，當(dāng)p.Met730Arg變異發(fā)生后，預(yù)測Arg730的胍基分別與Asp733形成鹽橋(粉紅色虛線)，以及與Val701形成氫鍵(黃色虛線)。

2.4 變異蛋白體外表達(dá)結(jié)果

為進(jìn)一步分析變異p.Met730Arg有害性，體外WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLA2G6-WT組及PLA2G6-MUT組均存在蛋白表達(dá)，但PLA2G6-MUT組相比較PLA2G6-WT組蛋白表達(dá)量降低約58.3% (<0.001)。這表明變異p.Met730Arg可導(dǎo)致體外細(xì)胞蛋白表達(dá)量降低(圖3)。

3 討論

嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良(INAD)，也稱為神經(jīng)退行性腦鐵積累癥2A型(NBIA2A，OMIM#256600)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳神經(jīng)退行性疾病[2]。目前已報(bào)道中國人群INAD患者數(shù)量不足50例，發(fā)病中位數(shù)約為1歲3月齡，主要表現(xiàn)為早期肌張力降低，并可快速進(jìn)展為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育倒退、小腦萎縮等[4,6～15]。在疾病終末期可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重痙攣狀態(tài)或進(jìn)行性認(rèn)知障礙等嚴(yán)重表現(xiàn)，通常在10歲前死亡[2,16,17]。本例患兒6月齡前無異常表現(xiàn)，但7月齡時(shí)父母發(fā)現(xiàn)其四肢無力，后逐步出現(xiàn)抓握靈活性差、獨(dú)站欠穩(wěn)定、步態(tài)異常及語言發(fā)育落后等。通過綜合性康復(fù)訓(xùn)練后該患兒大運(yùn)動(dòng)及精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能得到改善，獨(dú)站穩(wěn)定時(shí)間延長，但行走仍保持寬基底步態(tài)。經(jīng)基因檢測結(jié)果提示該患兒基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)。前者為LOF變異，曾被報(bào)道于1例中國女性INAD患兒，該患兒除與本例相似的運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙外，還表現(xiàn)出眼球震顫及聽力降低癥狀，但這些表型尚未出現(xiàn)在本例患兒中[6]。本研究根據(jù)患兒臨床特征及基因檢測結(jié)果，最終診斷為INAD。

圖3 變異蛋白體外表達(dá)結(jié)果

A：WB電泳圖展示；B：WB灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。**<0.001。

基因位于染色體22q13.1區(qū)域，編碼iPLA2β蛋白，該蛋白由806個(gè)氨基酸組成，主要分為N段結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)區(qū)域及催化結(jié)構(gòu)域，可水解游離脂肪酸及溶血磷脂而起到維持穩(wěn)定細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)的作用，iPLA2β蛋白功能受損可引起細(xì)胞內(nèi)鐵沉積、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及線粒體內(nèi)膜損傷等，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]?；蛉毕莩龑?dǎo)致INAD外，還引起其他疾病發(fā)生，如ANAD (OMIM#610217)、常染色體隱性遺傳帕金森14型(OMIM#612953)及肌張力障礙-帕金森綜合征(Dystonia-Parkinsonism, DP)，因此將基因變異相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)變性病統(tǒng)稱為PLAN[19]。對于PLAN不同表型的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，這可能與基因不同變異類型或位點(diǎn)有關(guān)，相比LOF變異所導(dǎo)致的強(qiáng)致病性特征(如無義變異、移碼變異等)，在特殊位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義變異而引起的iPLA2β酶活性改變更應(yīng)被重視，Engel等[20]研究表明，在INAD患者基因p.Gly638Arg、p.Arg741Trp變異可顯著破壞水解游離脂肪酸的酶活性，而DP患者基因p.Arg632Trp、p.Arg741Gln變異則不會(huì)顯著破壞iPLA2β酶活性，可以看出在Arg741位點(diǎn)上，即便是不同氨基酸改變也會(huì)存在表型間差異。因此對于INAD患者發(fā)病早且病情嚴(yán)重的特征可能與基因變異導(dǎo)致功能缺失或嚴(yán)重降低有關(guān)，而PLAN或其他亞型可能由于iPLA2β酶底物改變而影響功能相關(guān)。本例患兒基因發(fā)現(xiàn)1個(gè)新型變異p.Met730Arg，該變異是否會(huì)導(dǎo)致類似Arg741Trp顯著破壞酶活性仍需進(jìn)一步功能驗(yàn)證，但根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)模型分析提示該變異蛋白局部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可能發(fā)生改變，體外功能實(shí)驗(yàn)表明變異蛋白表達(dá)量較野生型組顯著降低。

目前INAD仍無特殊治療方案，仍以對癥支持性治療為主，本例患兒因表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩而進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，雖然短期內(nèi)取得一定程度的改善，但這仍無法改變INAD病情發(fā)展。腦鐵沉積可能是包括INAD在內(nèi)的遺傳性NBIA疾病共同病理生理學(xué)特征，因此將腦鐵沉積作為藥物靶點(diǎn)可能是治療NBIA病情進(jìn)展的策略之一，其中鐵螯合療法因可減少細(xì)胞鐵元素負(fù)荷而減緩神經(jīng)退行性變性，并已在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[21]。其他治療策略，如手術(shù)干預(yù)在內(nèi)等多種方法已在多例NBIA患兒中進(jìn)行并取得一定改善，但這仍局限于對癥性治療范疇。通過腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的基因替代療法可能會(huì)恢復(fù)變異導(dǎo)致功能喪失的蛋白表達(dá)，目前已經(jīng)有相關(guān)研究通過構(gòu)建INAD小鼠模型并應(yīng)用基因療法成功改善運(yùn)動(dòng)功能以及神經(jīng)病理學(xué)特征[3,22,23]。

總之，本研究對1例主要表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩及小腦萎縮患兒進(jìn)行報(bào)道，通過綜合性康復(fù)治療后運(yùn)動(dòng)功能得到改善?；驒z測結(jié)果提示該患兒基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，包括一個(gè)新型變異p.Met730Arg，根據(jù)該患兒臨床特征及基因結(jié)果診斷為INAD。本文旨在提示臨床醫(yī)生對于早期出現(xiàn)認(rèn)知障礙、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育倒退以及軸性肌張力障礙的患兒，應(yīng)考慮INAD可能。通過基因檢測對疾病進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，這不僅可制定個(gè)體化治療及護(hù)理方案，而且也為評(píng)估家庭再生育的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

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Diagnosis, treatment and genetic analysis of a child with infantile neuroaxonal dystrophy

Weida Gong, Gang Tao, Tiantian Zhao, Yue Yang, Hong Ji

Infantile neuroaxonal dystrophy (INAD) is a rare autosomal recessive neurodegenerative disease characterized by early hypotonia, and rapid progression to psychomotor development regression, pyramidal tract positivity, and spastic quadriplegia. In this report, we describe a Chinese patient with INAD who presented with hypotonia, delayed motor and language development, and subsequently improved with rehabilitation training. Genetic testing revealed that the patient had compound heterozygousgene variants, with the heterozygous c.496dupG (p.Glu166fsTer32) variant inherited from her father and the heterozygous c.2189T>G (p.Met730Arg) variant inherited from her mother. The p.Met730Arg was a novel variant. The protein structure predicts that the structural stability of the mutant protein may change, and theexperimental results show that the expression of the mutant protein decrease. This study enriches thegene mutation spectrum, and improves the clinicians’ diagnostic awareness of INAD.

infantile neuroaxonal dystrophy (INAD); PLA2G6; rehabilitation

2023-02-15;

2023-04-27;

2023-05-04

宮為大，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。E-mail: gongweida1@126.com

紀(jì)紅，本科，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。E-mail: 82872366@qq.com

10.16288/j.yczz.23-034

(責(zé)任編委: 許琪)