田奇琳, 何炎森, 敬月美, 余惠文, 朱 旸, 陳鄭鑌, 陸鑾眉

(1.閩南師范大學(xué),閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 漳州 363000;2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所, 福建 漳州 363005)

水仙(Narcissus)屬于石蒜科水仙屬多年生草本植物,主要分布于歐洲和地中海沿岸等地,其單株花量大,具有特殊香味,具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1-3]。英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)將水仙分為1個(gè)植物學(xué)分類和12個(gè)園藝學(xué)分類:喇叭水仙、大杯水仙、小杯水仙、重瓣水仙、三蕊水仙、仙客來(lái)水仙、丁香水仙、多花水仙、紅口水仙、圍裙水仙、副冠開(kāi)裂水仙和其他[4]。中國(guó)水仙(Narcissus.tazettavar.chinensis)屬法國(guó)多花水仙中的變種,為中國(guó)著名的十大傳統(tǒng)名花之一,主要分布在東南沿海一帶,按地區(qū)劃分有漳州水仙、崇明水仙、舟山水仙等,其中漳州水仙最具代表性[5-6]。盡管目前國(guó)內(nèi)針對(duì)水仙屬種質(zhì)資源的資源分布、遺傳多樣性、引種試種等方面進(jìn)行了大量研究,總體開(kāi)發(fā)利用仍較為薄弱。福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院選育出3個(gè)多花水仙特色新品種“黃花2號(hào)”[7]、“云香”[8]和“金玉”[9];王金英[10]以引進(jìn)的20個(gè)歐洲水仙品種為試驗(yàn)材料,調(diào)查歐洲水仙在福州地區(qū)的生長(zhǎng)繁殖情況和環(huán)境適應(yīng)性,進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)方面的研究,并將研究結(jié)果應(yīng)用于水仙屬植物的分類比較;何炎森等[11]對(duì)多個(gè)多花水仙品種進(jìn)行露地栽培并比較其物候期和觀賞性狀。目前國(guó)內(nèi)水仙品種極度匱乏,生產(chǎn)上栽培的中國(guó)水仙,主要為“金盞銀臺(tái)”和“玉玲瓏”,品種多樣性不足;長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖導(dǎo)致水仙存在著病毒侵染、品質(zhì)退化等問(wèn)題[12]。此外,培育水仙新品種較為困難,中國(guó)水仙栽培品種為三倍體,利用傳統(tǒng)的雜交育種等方法難以獲得新品種[13];水仙缺乏全基因組數(shù)據(jù),且組織培養(yǎng)植株再生率普遍較低,遺傳轉(zhuǎn)化率低,性狀改良瓶頸凸顯[14-15]。引進(jìn)適合國(guó)內(nèi)氣候下栽培的水仙資源以豐富國(guó)內(nèi)水仙類型和優(yōu)良育種親本資源是水仙種質(zhì)資源創(chuàng)新的首要任務(wù)。因此,開(kāi)展國(guó)內(nèi)外水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性研究十分必要。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是植物遺傳多樣性研究和資源親緣關(guān)系鑒定的重要手段之一。目前,RAPD標(biāo)記[16-18]、ISSR[19-20]、AFLP[21-22]分子標(biāo)記技術(shù)在水仙屬植物遺傳多樣性研究方面均有應(yīng)用。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR),又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA),是一段由幾個(gè)核苷酸為單位的重復(fù)DNA序列,廣泛分布于生物基因組中;SSR標(biāo)記遵循孟德?tīng)柟诧@性遺傳模式,具有多態(tài)性較高、重復(fù)性高等許多優(yōu)點(diǎn),是遺傳多樣性分析中常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一[23-24]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用將極大推進(jìn)植物分子育種研究。SSR分子標(biāo)記作為水仙屬植物遺傳多樣性和種質(zhì)資源鑒定的重要分子標(biāo)記,目前在水仙屬植物遺傳多樣性研究方面已有少數(shù)應(yīng)用。祁世明等[24-25]建立并優(yōu)化了水仙的SSR-PCR反應(yīng)體系,從開(kāi)發(fā)的引物中篩選SSR標(biāo)記引物,對(duì)引物的多態(tài)性、重復(fù)性等進(jìn)行了驗(yàn)證,并對(duì)部分水仙資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究。劉洋[26]利用“云香”水仙不同花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了SSR標(biāo)記引物,并進(jìn)行可靠性檢測(cè)。目前真正得到推廣利用的水仙資源仍極少。鑒于此,本研究基于前期收集、保存和引進(jìn)栽培的多花水仙種質(zhì)資源,應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展國(guó)內(nèi)外多花水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性研究,旨在為水仙傳統(tǒng)育種結(jié)合生物技術(shù)育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)材料多花水仙資源采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所的水仙花資源圃,具體信息見(jiàn)表1。

表1 多花水仙資源Table 1 Narcissus tazetta resources

試劑:丙烯酰胺,脲,Tris-base,N,N-甲叉雙丙烯酰胺,硼酸,EDTA(乙二胺四乙酸二鈉),TEMED(四甲基乙二胺),冰醋酸,95%乙醇,過(guò)硫酸銨(APS),反硅化劑,硅化劑,無(wú)水碳酸鈉,硝酸銀,氫氧化鈉,甲醛溶液,二甲苯青,甲酰胺,溴酚藍(lán)等。

1.2 儀器設(shè)備

高速離心機(jī),水浴鍋,通風(fēng)櫥,微波爐,超微量紫外分光光度計(jì),電泳儀、PCR擴(kuò)增儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1DNA提取

采用上?；萘枭锟萍加邢薰镜男滦椭参锘蚪MDNA快速提取試劑盒提取,操作參照說(shuō)明書(shū)。提取21個(gè)多花水仙資源的DNA,通過(guò)超微量分光光度計(jì)的測(cè)定,將A260/A280值在1.8～2.0的DNA樣品,用瓊脂糖電泳再檢測(cè)DNA完整性。最后將合格的DNA樣品稀釋終濃度至100 ng/μL,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SSR-PCR 擴(kuò)增

將提取的多花水仙資源DNA作為模板,進(jìn)行SSR-PCR 擴(kuò)增,對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選。本研究中,引物CATACA 5、TA 34、TCA 9、AT 15選自祁世明等[25]的研究,引物NtSSR 2、NtSSR 4、NtSSR 12、NtSSR 13、NtSSR 18、NtSSR 19選自劉洋[26]的研究,引物Xgwm 469選自袁菊紅[27]的研究(表2);另外,基于中國(guó)水仙“玉玲瓏”轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的SSR標(biāo)記引物,引物委托廈門擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性30 s,49～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3.3聚丙烯凝膠電泳

聚丙烯凝膠電泳參照余惠文等[28]的方法進(jìn)行。將水仙DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后加入預(yù)電泳好的膠孔中,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)果拍照保存,讀取條帶用于后續(xù)相關(guān)分析。

1.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將聚丙烯酰胺凝膠電泳數(shù)據(jù)錄入NTsys-pc 2.10 e軟件,對(duì)21份多花水仙資源進(jìn)行主成分分析和非加權(quán)算術(shù)平均聚類(UPGMA)分析。使用Popgen 32軟件計(jì)算引物多態(tài)性百分率、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性分析

基于“玉玲瓏”水仙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從新設(shè)計(jì)的32對(duì)引物中通過(guò)SSR-PCR篩選得到6對(duì)SSR標(biāo)記引物用于本研究,分別為N 10、N 16、N 21、N 22、N 24、N 32(表3)。結(jié)合前人研究,最終從76對(duì)引物中篩選出17對(duì)擴(kuò)增的條帶清晰且有多態(tài)性的引物(表2和表3)。利用POPGEN 32軟件進(jìn)行各項(xiàng)遺傳參數(shù)分析,17對(duì)SSR引物在21份水仙資源中共擴(kuò)增出106個(gè)位點(diǎn),其中有99個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)比例為93.40%,表現(xiàn)為較高的多態(tài)性水平。每對(duì)引物產(chǎn)生的位點(diǎn)數(shù)在2～12之間,平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.2個(gè)位點(diǎn)和5.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。17對(duì)引物的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.266 7,Shannon信息指數(shù)為0.411 7(表4),這17對(duì)引物中有3個(gè)引物的觀測(cè)等位基因數(shù)在1～2之間,其余14個(gè)的觀測(cè)等位基因數(shù)均是2。新開(kāi)發(fā)的6對(duì)SSR標(biāo)記引物中,N 10、N 21、N 24和N 32多態(tài)性百分率在90%以上,N 16和N 22多態(tài)性百分率為80%～90%。在本研究所的17對(duì)引物中,有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)最高的引物N 32,最低的是引物NtSSR 2。

表3 SSR-PCR篩選獲得的引物序列Table 3 Primer sequences obtained by SSR-PCR screening

表4 17對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果Table 4 Amplification results of 17 pairs of primers

2.2 多花水仙資源主成分分析與親緣關(guān)系分析

2.2.1多花水仙資源主成分分析

用NTsys-pc 2.10e軟件對(duì)21份多花水仙資源進(jìn)行遺傳多樣性矩陣的主成分分析。由圖1可看出,供試多花水仙種質(zhì)資源可被分為四類,第Ⅰ類主要是來(lái)自漳州、平潭、南日島、崇明和普陀的中國(guó)水仙;第Ⅱ類為“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”;第Ⅲ類為“白花1號(hào)”“白花2號(hào)”“崇明白”和“Ziva”水仙;第Ⅳ類為“云香”“六橫白”“Pearl”。

圖1 21份多花水仙主成分分析Fig.1 Principal component analysis of 21 resources of N. tazetta

圖2 21份多花水仙資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 21 resources of N. tazetta

2.2.2多花水仙資源親緣關(guān)系分析

21份水仙種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.443 4～1.000 0之間。在遺傳相似系數(shù)為0.74處,可將多花水仙資源分為四類,第Ⅰ類有12個(gè)多花水仙資源,含“金三角”“平潭單瓣”“漳州單瓣”“南日島野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明復(fù)瓣”“漳州單瓣”“平潭野生”“崇明單瓣”“普陀復(fù)瓣”“綠狀元”“普陀單瓣”,其中除“綠狀元”(花被綠色)外,均為黃白雙色花。第Ⅱ類有2個(gè)多花水仙資源,為“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”,均為黃色花。第Ⅲ類有4個(gè)多花水仙資源,分別為“白花1號(hào)”“白花2號(hào)”“崇明白”“Ziva”,均為白色花。第Ⅳ類有3個(gè)多花水仙資源,分別為“云香”“六橫白”和“Pearl”,均為白色花被,淺黃色副冠,UPGMA聚類結(jié)果和主成分分析結(jié)果一致。

本研究表明,親緣關(guān)系最近的是“平潭單瓣”“漳州單瓣”“南日島野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明復(fù)瓣”“漳州單瓣”“平潭野生”“崇明單瓣”“普陀復(fù)瓣”“綠狀元”和“普陀單瓣”。“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”為洋水仙,其中“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”親緣關(guān)系較近,“Ziva”和“崇明白”親緣關(guān)系較近,“Pearl”和“云香”“六橫白”有較近的親緣關(guān)系。

對(duì)21份多花水仙聚類的4個(gè)類群用POPGEN 32軟件進(jìn)行各項(xiàng)遺傳參數(shù)分析,結(jié)果(表5)表明,第Ⅲ類群的多態(tài)性百分率(33.02%)、觀測(cè)等位基因數(shù)(1.330 2)、有效等位基因數(shù)(1.226 1)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(0.130 4)和Shannon信息指數(shù)(0.191 6)均最高,第Ⅳ類群最低。說(shuō)明第Ⅲ類群的遺傳多樣性是4個(gè)類群中最高的, 第Ⅳ類群的遺傳多樣性最低。

表5 4個(gè)多花水仙類群的遺傳多樣性Table 5 Genetic diversity of four N. tazetta groups

3 討 論

本研究篩選得到的17對(duì)SSR標(biāo)記引物可以較好地將供試水仙資源從DNA水平上區(qū)分開(kāi)來(lái),21份多花水仙種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.443 4～1.000 0之間。中國(guó)水仙與其他多花水仙類群間的遺傳相似系數(shù)較低,遺傳多樣性較高,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)UPGMA聚類分析可知,國(guó)內(nèi)漳州、崇明、舟山、平潭等地的中國(guó)水仙單復(fù)瓣種質(zhì)都聚在Ⅰ類群,表現(xiàn)其親緣關(guān)系較近。中國(guó)水仙表型特征相似,其中, “金三角”與“漳州單瓣”主要差異是副冠三裂,“綠狀元”與“漳州復(fù)瓣”主要差異是顏色為綠色[29-30]。 可見(jiàn),“金三角”和“綠狀元”雖與其他中國(guó)水仙資源表型存在差異,但與中國(guó)水仙主栽品種均表現(xiàn)出很高的遺傳相似性。中國(guó)水仙所屬的Ⅰ類群與洋水仙(“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”)所在的類群(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)遺傳相似系數(shù)在0.4～0.8之間,表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,與Liu等[31]的研究結(jié)果類似。另外在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群中,“Grand Soleil d′Or”與“彩色水仙”親緣關(guān)系較近;“Ziva”與“崇明白”親緣關(guān)系較近;“Pearl”與 “云香”和“六橫白”表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。不同種質(zhì)水仙間親緣關(guān)系的區(qū)分和種質(zhì)認(rèn)證有利于優(yōu)良水仙親本資源的保存和水仙種質(zhì)創(chuàng)新利用。

袁菊紅[27]利用18對(duì)SSR引物對(duì)石蒜屬15個(gè)種和外類群中國(guó)水仙進(jìn)行了SSR-PCR擴(kuò)增,分析石蒜屬植物的遺傳多樣性和種間親緣關(guān)系。祁世明等[24-25]開(kāi)發(fā)了29對(duì)水仙BES-SSR標(biāo)記引物,并通過(guò)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化,建立了適合水仙SSR標(biāo)記分析的標(biāo)準(zhǔn)化體系。在前人研究基礎(chǔ)上,本研究以21份多花水仙為材料,基于中國(guó)水仙“玉玲瓏”轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的6對(duì)SSR標(biāo)記引物,其條帶較清晰,非特異性條帶較少,多態(tài)性較高,通用性好。本研究新開(kāi)發(fā)的引物可豐富水仙SSR標(biāo)記引物數(shù)量,為水仙屬遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源鑒定方面奠定基礎(chǔ)。另外,本研究選用的17對(duì)引物并不能很好區(qū)分漳州、崇明、舟山、平潭等地的中國(guó)水仙單復(fù)瓣種質(zhì),仍需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)特異性分子標(biāo)記及其引物,有助于有效揭示中國(guó)水仙不同群體間的遺傳變異。本研究中,不同地區(qū)的中國(guó)水仙群體間遺傳多樣性水平低,結(jié)果與Lin等[31]、朱弘等[32]研究結(jié)論相似。探討國(guó)內(nèi)外多花水仙的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,可以為水仙育種和種質(zhì)認(rèn)證研究提供科學(xué)依據(jù),進(jìn)一步豐富、開(kāi)發(fā)和利用國(guó)內(nèi)外水仙種質(zhì)資源,推進(jìn)水仙市場(chǎng)的發(fā)展。